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调控T7 RNA聚合酶的表达大肠杆菌BL21 (DE3)为重组蛋白的生产提供更多的宿主选择

摘要

大肠杆菌是原核表达系统中应用最广泛的用于生产重组蛋白的细菌。在BL21 (DE3)中,编码T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)的基因受强lacUV5启动子(PlacUV5),这比野生型的lac启动子和leakier多种活性(PlacWT)在一定的生长条件下。这些特性不利于生产有毒或生长负担重的重组蛋白。一方面,T7 RNAP的渗漏表达导致靶蛋白在非诱导期快速生成,消耗了细胞生长的资源。此外,在非诱导期或诱导期,T7 RNAP生产的高表达导致了难以表达蛋白的高表达,这都可能导致表达质粒丢失或表达基因发生突变。因此,需要开发更多表达严谨、T7 RNAP表达水平不同的BL21 (DE3)衍生变异株。因此,我们替换了PlacUV5分别与其他可诱导启动子结合,包括阿拉伯糖启动子(ParaBAD)、鼠李糖促进剂(PrhaBAD)、四环素启动子(P春节),通过调控T7 RNAP的转录水平和泄漏水平,优化重组蛋白的生产。与BL21 (DE3)相比,构建的工程菌株对诱导剂的敏感性更高,其中鼠李糖和四环素启动子的渗漏能力最低。在产生葡萄糖脱氢酶(GDH)的过程中,工程菌株BL21 (DE3::ara)的生物量、细胞存活率和外源蛋白表达量均高于BL21 (DE3)。此外,这些工程菌株已成功应用于提高膜蛋白的产量,包括大肠杆菌胞嘧啶转运蛋白(CodB)大肠杆菌膜蛋白插入酶/折叠酶(YidC)大肠杆菌f - atp酶b亚基(Ecb)。本文构建的工程菌株为重组蛋白的生产提供了更多的宿主选择。

介绍

大肠杆菌BL21 (DE3)和pET表达系统是最具代表性的重组蛋白表达系统[1].在BL21(DE3),编码靶蛋白质的基因,这是对的pET质粒的表达,是通过驱动的染色体编码噬菌体T7 RNA聚合酶(T7 RNAP)。该T7 RNA聚合酶特异性识别的T7启动子和转录八倍的速度比大肠杆菌RNAP [23.4].编码T7 RNAP的基因是由异丙基β-管辖d-1-硫代半乳糖醛酸苷(IPTG)诱导lacUV5启动子(PlacUV5),它是野生型lac启动子的强烈的变体(PlacWT) [5].选择这些成分来创建蛋白质过表达系统的原因很简单,合成的mRNA越多,产生的蛋白质就越多。但该系统不适用于毒性或生长负担重的重组蛋白。

BL21 (DE3)理想的重组蛋白生产包括两个阶段,非诱导期生物量快速积累,诱导期蛋白质生产。此外,T7 RNAP的表达水平对重组蛋白的产生也很重要[6].对于易于表达的蛋白质,BL21 (DE3)中蛋白质的生产往往受到限制,因为大部分原料将用于生产生物质[78].为了解决这个问题,许多策略被开发来调节细胞生长和蛋白质生产之间的资源分配。基于CRISPRi的基因生长开关在大肠杆菌通过靶向细胞生长和DNA复制相关基因,增加T7 RNAP的表达,使gfp蛋白产量增加2.2倍[9].最近,Stargardt等通过引入噬菌体T7 gp2基因(抑制因子)实现了细胞生长和蛋白表达的解耦大肠杆菌RNAP),细胞中的大部分资源流向T7 RNAP的表达,在有足够生物量时促进靶蛋白的产生[1011].然而,对于难表达蛋白,靶蛋白的高表达往往会压倒宿主细胞。为了解决这一问题,人们开发了一系列BL21 (DE3)衍生的变异株,如C41 (DE3)、C43 (DE3)和Mutant56 (DE3) [1213].值得一提的是,这些变异株背后的原因是T7 RNAP的表达水平降低,从而产生较少的与目的重组蛋白相对应的T7 RNAP。例如,Sun等人通过将弱lac启动子与强P启动子杂交,构建了一种能高效生产重组蛋白的非自溶菌株lacUV5,通过下调T7 RNAP的表达,实现酶的高效生产[14].

此外,PlacUV5突变体是crp独立的,比P更容易泄漏虫胶15].如果非诱导期T7 RNAP表达量增加,细胞在积累一定生物量之前就开始产生蛋白质。PlacUV5在没有诱导物的情况下,诱导物对细胞产生毒性,导致表达质粒丢失或表达基因发生突变[1617].因此,T7 RNAP的严格表达对蛋白质生产系统的稳定性至关重要。开发了lacI突变体,该突变体仅能与lacO (lac算子)结合,显著降低了PlacUV518].De Gier开发了一个名为Lemo21 (DE3)的系统,其中T7 RNAP的转录活性由其抑制剂T7溶菌酶的细胞丰度控制,而T7溶菌酶的表达又受到PrhaBAD,控制了T7 RNAP的活性,克服了基于T7 RNAP的蛋白表达系统中表达渗漏的问题,靶蛋白产量提高,特别是膜蛋白[1].此外,添加诱导剂IPTG会对细胞产生化学毒性[1617].为了消除IPTG对细胞的毒性,利用阿拉伯糖启动子驱动T7 RNAP转录的BL21-AI < gp2 >菌株被开发并成功地用于过表达毒性蛋白[11].基于这些实施例变得明显,T7 RNAP的最佳和严格的表达水平,以达到最大的重组蛋白产量是重要的。

在本研究中,我们构建了3个不同转录水平和T7 RNAP泄漏表达的BL21 (DE3)衍生变异株,扩展宿主菌株进行重组蛋白表达。具体而言,通过替换PlacUV5与其他可诱导启动子结合:阿拉伯糖启动子(ParaBAD)、鼠李糖促进剂(PrhaBAD)、四环素启动子(P春节).此外,该工程菌株还成功地产生了一种自溶蛋白和三种膜蛋白葡萄糖脱氢酶(GDH),大肠杆菌胞嘧啶转运蛋白(CodB)大肠杆菌膜蛋白插入酶/折叠酶(YidC)大肠杆菌F-ATPase b亚基(Ecb),曾被报道难以在大肠杆菌压力(12141619].本文对提高重组蛋白的表达具有重要的研究意义。

材料和方法

菌株和质粒结构

本研究中使用的所有质粒和重组蛋白均列于附加文件中1:表S1, DNA引物列于附加文件1S2:表。的大肠杆菌用DH5α构建质粒,用BL21 (DE3)表达基因。用于表达重组蛋白的质粒均来源于pET24。PCR获得的质粒骨架片段通过Gibson组装连接。在质粒构建过程中,将细胞中表达的重组蛋白c端融合到EGFP上。通过化学转化法将构建的质粒转化为DH5a,并通过菌落PCR验证转化产物。通过质粒提取试剂盒筛选正确菌落,获得质粒。

培养条件

所有大肠杆菌在含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母膏和10 g/L NaCl的LB培养基中培养,37℃,220 rpm,不断摇匀,固体LB培养基添加2%琼脂。发酵菌株在极好的肉汤(TB)培养基中生长,28°C, 220转/分钟,不断摇动。根据细胞内质粒所携带的筛选标记,在培养基中加入50µg/mL的卡那霉素(kan)或大光霉素(spec)。

瓶中发酵:将新构建的含有不同启动子的重组蛋白质粒的菌株在3 mL LB液体培养基中37℃培养过夜。取300µL的培养物接种TB培养基30 mL,置于250 mL摇瓶中。细胞在37°C培养至OD6002-4的异丙基β-d量1 thiogalactopyranoside应承担(IPTG),l-阿拉伯糖、鼠李糖(Rha)和无氢四环素(aTc)的最终浓度分别为0.3 mM、10 mM、10 mM、2.4µM。在28°C条件下发酵60 h,对发酵条件进行优化[20.].

工程菌株的构建

本文所使用的四种诱导启动子包括PlacUV5ParaBAD,PrhaBAD和P春节.分别在gRNA质粒上放置不同的启动子序列,获得质粒pTarget-ara/pTarget-rha/pTarget-tet, PCR制备1000 bp同源臂的模板DNA。通过PCR得到的引物列于附加文件中1S2:表。我们利用改良的CRISPR/Cas9系统(pEcCas/pEcgRNA)对其基因组进行编辑大肠杆菌BL21 (DE3) [21].该CRISPR / Cas9系统包含两个质粒。第一质粒,pEcCas,转化到BL21(DE3)株。然后用供体片段的质粒pEcgRNA通过电穿孔转移到上述菌株(1.85千伏,200欧姆,25μF),然后回收用于在1mL的LB培养基中在37℃1个小时下进行。启动子的程度(即,749,956-751,219 bp)的控制BL21(DE3)的T7 RNA聚合酶被分别由其它诱导型启动子和其辅助表达的蛋白质代替。突变体通过菌落PCR和基因测序证实。然后正确的菌落进行了筛选,并进一步经受质粒固化过程以获得空工程化菌株[21].

扫描荧光显微镜和荧光强度

利用引物EGFP- f和EGFP- r扩增EGFP片段,克隆至pET24a,用Dph1酶切,构建pET24a-EGFP质粒。质粒分别转入新构建的菌株和原菌株BL21 (DE3)。为制备感受态细胞,将转化体在37℃下培养至OD600达到0.6 - -0.8。用氯化钙法将pET24a-EGFP质粒转移到宿主菌株中,37℃恢复1 h, 37℃LB琼脂平板上以50µg/mL kan筛选阳性菌落。随机选取1个菌落,在37℃的LB中用抗生素预培养。取300µL的培养物接种TB培养基30 mL,置于250 mL摇瓶中。重组蛋白表达菌按上述发酵方法培养,在28℃下表达18 h。

在600 nm处用吸光度法监测细胞生长,荧光显微镜下观察少量细胞。将500µL细胞以12,000 rpm离心5分钟,然后用500µL磷酸盐缓冲盐水(PBS)重悬。100微升重悬液转移到96孔黑色Optiplate 96f板上。在485 nm激发波长和535 nm发射波长下检测整个细胞荧光。所有实验均为3个重复。

质粒稳定性分析

分别在发酵24、36和48 h取样,用PBS稀释至相同OD。将100µL的稀释液用50µg/mL卡那霉素包被在LB琼脂平板上。培养12 h后,随机取100个单菌落,分别在含50µg/mL kan的LB琼脂平板和LB琼脂平板上进行斑点检测。37℃培养12 h后,发现50µg/mL kan的LB培养基上的菌落生长在LB琼脂平板上,而不是在LB培养基上。计算质粒稳定性为在卡那霉素培养基中生长的菌落数/100 × 100%。

基于工程菌株的蛋白表达

四株菌表达的重组蛋白均为c端融合到EGFP上。因此,可以通过荧光强度来观察重组蛋白的表达水平。将含有不同重组蛋白质粒的工程菌株在5 mL LB液体培养基中37℃过夜。取300µL的培养物接种TB培养基30 mL,置于250 mL摇瓶中。在OD值为2-4时,按上述方法添加诱导剂,在28℃下继续发酵,表达蛋白。根据上述方法对发酵处理后的样品进行检测,计算单位细胞荧光值和质粒稳定性。所有实验均为3个重复。

结果

工程菌株的构建和表征

不同的启动子的构建的DNA表达盒整合入的染色体大肠杆菌BL21 (DE3)经CRISPR/Cas9系统检测[21].工程菌株分别为BL21 (DE3::ara)、BL21 (DE3::rha)、BL21 (DE3::tet)。1a).首先用荧光强度表征工程菌株诱导启动子的渗漏能力和T7 RNAP的转录水平。如图所示。1b,在没有诱导剂的情况下,原菌株BL21 (DE3)的荧光强度明显更高,证明了PlacUV5具有高的基本泄漏表达式。然而,可以看出,PrhaBAD和P春节表现出最低的泄漏能力。加入相对诱导剂后,BL21 (DE3::rha)和BL21 (DE3::tet)的平均荧光值达到43万a.u,分别是BL21 (DE3)的2.11倍和2.0倍。在BL21 (DE3::rha)中,有诱导物的荧光强度比没有诱导物的荧光强度高24.26倍,而BL21 (DE3)菌株的荧光强度是没有诱导物的荧光强度的2.52倍。同样的现象也可以在图中得到。1c.与工程菌株相比,未经诱导的菌株BL21 (DE3)荧光图像最亮。诱导后,菌株BL21 (DE3::rha)和BL21 (DE3::tet)的荧光图像亮度高于菌株BL21 (DE3)(图2)。1c).一般来说,PrhaBAD被认为是最佳的严格启动子,因为它有最低的泄漏表达。

图。1
图1

3株工程菌的构建及EGFP发酵18 h的荧光强度。一个工程T7 RNAP的基因设计大肠杆菌菌株BL21 (DE3)。构建了3株含有不同启动子的T7 RNAP基因工程表达株。B含或不含诱导剂EGFP质粒不同菌株的荧光强度及荧光图(C).误差条表示三个重复的平均值的标准差

工程寄主菌株在GDH生产中的应用

研究表明,当BL21(DE3)过表达的葡萄糖脱氢酶(GDH),严重的细胞自溶诱导,导致较低的蛋白质生产[14].因此,我们研究了这三种工程菌株是否能提高GDH的表达(图)。2a).在生产GDH的前24 h,菌株BL21 (DE3)的生长状况和蛋白质产量最优。而BL21 (DE3)生长放缓,生物量急剧下降,而3个工程菌株的细胞生物量和荧光强度从24 h持续上升到36 h。特别是在36 h,菌株BL21 (DE3::ara)和BL21 (DE3::rha)的荧光强度分别是BL21 (DE3)的1.57和1.37倍。

图2
figure2

GDH-EGFP在不同菌株中的表达。一个GDH-EGFP在整个发酵过程中的荧光强度。B在整个发酵过程中检测BL21 (DE3)、BL21 (DE3::ara)、BL21 (DE3::rha)和BL21 (DE3::tet)的质粒携带率。数值和误差棒代表三次重复实验的平均值和偏差。GDH葡萄糖脱氢酶

此外,表达质粒GDH的在发酵后期细胞内稳定性进行了测试(图2b)如图所示。2b, plasmid-carrying细胞的比率在BL21 (DE3)继续随发酵时间的增加而下降,达到2.17%的低点36 h。相比之下,plasmid-carrying细胞的比率BL21 (DE3:: ara), BL21 (DE3:: rha)和BL21 (DE3::春节)仍约为100%,99%和100%分别为36 h。工程菌株的质粒稳定性明显高于亲本菌株BL21 (DE3)。这说明下调T7 RNAP的表达水平,减少启动子的渗漏表达,可以提高质粒的稳定性,减少表达基因的突变,促进蛋白的表达。其中,工程菌株BL21 (DE3::ara)更能产生GDH, GDH通过下调T7 RNAP表达而抵抗自溶[14].总体上,3株工程菌的存活率仍然较高,表达质粒在36 h时稳定存在于细胞中,说明通过延长发酵时间可以进一步提高自溶蛋白的产量。

工程寄主菌株在膜蛋白生产中的应用

进一步研究了工程菌株在三种膜蛋白(Codb、Ecb和Yidc)表达中的应用。对于每一种膜蛋白,我们都是精心挑选的大肠杆菌基于以前的尝试表达这些蛋白的宿主菌株。例如,CodB几乎不产生中大肠杆菌k - 12 (19],当Ecb和Yidc在BL21 (DE3)中表达时,大多数宿主细胞死亡[18].三种膜蛋白的合成结果如图所示。3..在膜蛋白Codb的生产过程中,添加诱导剂后,菌株BL21 (DE3)在12 h时的荧光强度达到36461 a.u,分别是其他3个工程菌株在同一阶段的11.8倍、3.0倍和6.8倍(图)。3.一种)。这是毫无疑问的菌株BL21(DE3)在12小时之前产生的膜蛋白Codb有很大的优势。然而,菌株BL21的荧光强度(DE3)急剧下降,而三个工程化菌株的荧光强度持续24小时后,以稳定地增加。其中,菌株BL21(DE3 :: RHA)的荧光强度达到10870 A.U.,而细胞生物质具有小的变化,和携带质粒的细胞的平均比率为约98%(图3.b).即使在60 h,菌株BL21 (DE3::rha)的荧光强度也最高,是BL21 (DE3)的2.7倍。因此,通过延长发酵时间提高膜蛋白产量,认为菌株BL21 (DE3::rha)是较适合生产Codb的寄主菌株。同样,菌株BL21 (DE3)的荧光强度随着Ecb的产生呈先升高后降低的趋势,而构建的3个菌株均呈上升趋势(图3)。3.c). 18 h时,BL21 (DE3)的荧光强度最高(为6410 a.u), 24 h时,BL21 (DE3::rha)和BL21 (DE3::tet)的荧光强度无显著差异。60 h时,BL21 (DE3::rha)和BL21 (DE3::tet)的荧光强度分别为6913 a.u和5711 a.u。分别是BL21 (DE3)菌株的2.3倍和1.6倍。在48小时内,三种工程菌株携带质粒的细胞比例保持在98%左右(图。3.d).因此,BL21 (DE3::rha)下调了T7 RNAP的表达水平,提高了质粒的稳定性,是延长发酵时间、高效生产Ecb的较好宿主选择。在Yidc的生产过程中,BL21 (DE3::tet)在18 h的荧光强度达到3519 a.u,是BL21 (DE3)的2.7倍(图2)。3.e), 96%的质粒稳定存在(图。3.f).菌株BL21 (DE3::tet)在60 h时的荧光强度最高,菌株BL21 (DE3::tet)更适合Yidc生产。总之,产生不同膜蛋白的最佳宿主是不同的,这是由于不同膜蛋白对T7 RNAP的需求所致。因此,这3个工程菌株已经成功应用于膜蛋白的生产,3个工程菌株可以通过调控T7 RNAP的严格表达和启动子的泄漏水平,进一步提高膜蛋白的产量。

图3.
图3

3种膜蛋白在3个工程菌株和对照菌株BL21 (DE3)中的表达。一个BL21 (DE3)、BL21 (DE3::ara)、BL21 (DE3::rha)和BL21 (DE3::tet)在整个发酵过程中的Codb-EGFP荧光强度及携带质粒细胞的百分率BCBL21 (DE3)、BL21 (DE3::ara)、BL21 (DE3::rha)、BL21 (DE3::tet)在整个发酵过程中的Ecb-EGFP荧光强度及携带质粒细胞的百分率DE在整个发酵过程BL21的Yidc-EGFP(DE3),BL21(DE3 :: ARA),BL21(DE3 :: RHA)和BL21(DE3 :: TET)的荧光强度和携带质粒的细胞的百分比F.数值和误差棒代表三次重复实验的平均值和偏差。CodB,大肠杆菌胞嘧啶转运蛋白。央行,大肠杆菌f - atp酶b亚基YidC,大肠杆菌膜蛋白insertase / foldase

精细调控诱导剂浓度可进一步提高靶蛋白产量

已有报道,诱导剂的浓度对蛋白的最终表达量有很大的影响[1822].为了进一步提高工程菌株的应用潜力,在前人研究的基础上,通过添加不同浓度的诱导剂,对3株工程菌株和菌株BL21 (DE3)的生产能力进行了研究。IPTG的添加浓度分别为0.1 mM、0.3 mM和0.5 mM。l -阿拉伯糖浓度分别为2.5 mM、10.0 mM、20.0 mM。鼠李糖(Rha)添加浓度分别为2.0 mM、10.0 mM、40.0 mM。无水四环素(aTc)分别为0.6µM、2.4µM、7.0µM。

无花果。4结果显示,在不同诱导剂浓度下,产生上述不同重组蛋白的4株工程菌株在36 h时的荧光强度均高于BL21 (DE3),当产生GDH和Yidc两种重组蛋白时(图2)。4a, d)。与BL21 (DE3)相比,生产其他两种蛋白时,三种工程菌株的单位细胞荧光强度均较低(图2)。4B, c),这可能是发酵后期细胞生物量高的结果。由以上结果可以得出,诱导物的浓度与蛋白的表达密切相关。而在生产不同蛋白时,最优蛋白表达所需的诱导剂浓度也不同。例如,20毫米的诱导器l在BL21 (DE3::ara)中表达GDH时-阿拉伯糖效果最好。对于Codb和Ecb,以菌株BL21 (DE3::rha)为生产宿主时,最优rha浓度为40 mM,菌株BL21 (DE3::tet) aTc浓度为7.0µM时,最优Yidc蛋白产量。其中,添加不同浓度的鼠李糖后,BL21 (DE3::rha)蛋白产生的动态范围和表达水平最广。和PrhaBAD可调性始终是好的。

图4.
装具

3个工程菌株和对照菌株BL21 (DE3)在不同诱导剂浓度下36h GDH和3种膜蛋白的可调谐表达。一个GDH的可调表达式。BCodb的可调表达式。CEcb的可调表达式。DYidc的可调表达式。数值和误差棒代表三次重复实验的平均值和偏差

讨论

众所周知,pET表达系统是生产重组蛋白的有力工具。BL21 (DE3)携带一个可诱导的T7 RNA聚合酶依赖的pET表达系统,可以简单地操纵和调节蛋白质生产水平。然而,这个黄金标准的表达系统仍有改进的空间[16].例如,原诱导剂的化学性质和T7 RNAP的漏表达并不有利于重组蛋白的表达。IPTG并不是一种无害的诱导剂,相反,它会造成明显的损害大肠杆菌BL21 (DE3)宿主,由于其含有携带表达基因的质粒,已经承担了代谢负担[23].其他研究表明,这种现象是由于过多的T7 RNAP生产从细胞生长中吸取资源和T7 RNAP在缺乏诱导剂的情况下的泄漏表达造成的,在产生有毒蛋白或膜蛋白时对细胞是有毒的[2425].此外,pET系统显示“全部或无”诱导性,不允许详细的表达调控。近年来,调控T7 RNAP的表达是提高重组蛋白产量的有效策略。Wagner等人发现,通过蛋白质组学和遗传学的结合,调控T7 RNAP表达的启动子中的突变是改善Walker菌株膜蛋白过表达特性的关键[2627].因此,我们使用T7 RNAP抑制剂T7 Lys抑制T7 RNAP活性,提高膜蛋白产量[28].为了实现T7 RNAP的严谨表达,进一步提高难表达蛋白的产量,本研究通过替换控制T7 RNAP的启动子来调节T7 RNAP的转录表达和泄漏水平。诱导启动子,特别是PrhaBAD,可在非诱导条件下抑制泄漏表达式,实现可调。BL21 (DE3)菌株的荧光强度明显降低,24 h后产生上述重组蛋白,97%的细胞不含表达质粒(图3)。2b,3.b, d, f)。相反,3个工程菌株的荧光强度持续升高,即使在48 h后,仍有98%的细胞稳定存在并发挥作用,证明选择合适的启动子可以降低宿主细胞的生长负担。先前的研究表明,PrhaBAD将受控T7 RNAP置于pET24质粒上进行基因表达[18],但缺点是质粒不能在细胞中稳定存在,导致表达基因发生突变。在本研究中,我们利用CRISPR/Cas9技术在BL21 (DE3)染色体上修改了控制T7 RNAP的启动子,不仅解决了上述局限性,还实现了T7 RNAP的稳定表达,减轻了携带额外质粒带来的代谢负担。

此外,加入IPTG是有害的细胞,该菌株BL21(DE3)的存活率24小时,这也是在上述数据证实(图之后大大降低。3.b, d, f).已经证明IPTG浓度小于0.1mM时对细胞无毒[29,但此浓度不能满足我们通常发酵实验的要求。本文选取的三种诱导启动子,分别是l阿拉伯糖(1130.),鼠李糖1831], anhydrotetracycline [32都被用于控制基因表达。Chou等人开发了l在菌株JM109 (DE3)的pET体系中,与BL21 (DE3)相比,青霉素酰化酶(PAC)的产量显著提高,证明了这一点l-阿拉伯糖作为诱导剂比IPTG更有效[33].有一项研究证明归纳法l-arabinose可以作为取代以联合诱导用1mM IPTG [11].mlacI被置于PrhaBAD而鼠李糖诱导启动子已被广泛应用于鼠李糖膜蛋白和分泌蛋白的生产大肠杆菌31].最近,基于无水四环素诱导启动一个新的基因调控工具已经开发[34].总之,大量的研究已经证明本文所使用的诱导剂对细胞是无毒或微毒的。更重要的是,IPTG诱导剂价格昂贵,而其他低成本诱导剂(例如,l-阿拉伯糖和鼠李糖)可以满足可持续发展的要求。因此,本研究的启动子工程可以缓解外部环境对细胞生存的压力,降低蛋白质生产的经济成本。

结论

可调谐蛋白表达对合成和系统生物学至关重要。但BL21 (DE3)并不适合表达所有的蛋白,如膜蛋白或自溶蛋白。本工作构建了3个BL21 (DE3)衍生的变异菌株,并进一步用于提高GDH和膜蛋白的产量。相比之下,PlacUV5, 3个诱导启动子的基础渗漏表达较低,可降低细胞毒性,准确调控T7 RNAP的表达。BL21 (DE3)在18 h前的生产效果最好,而3株工程菌株在24 h后的荧光强度均高于BL21 (DE3),平均携带质粒的细胞比例约为98%。长期以来,BL21 (DE3)在膜蛋白生产中没有优势。通过延长发酵时间,在不影响菌体存活率的前提下,进一步提高了GDH和膜蛋白的产量。我们开发了3个健壮的、新的BL21 (DE3)衍生变异株,为重组蛋白的生产提供了更多的宿主选择。

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确认

国家重点研发计划项目(No. 2019YFA0904900);江苏省高校自然科学基金项目(No. 19KJB530011);江苏省自然科学基金项目(No. 19KJB530011);国家自然科学基金项目(No. 21908112, No. 22038007)。

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杜芳,刘玉强。徐,y。et al。调控T7 RNA聚合酶的表达大肠杆菌BL21(DE3),以提供用于重组蛋白生产的多个主机选项。活细胞的事实20.189(2021)。https://doi.org/10.1186/s12934-021-01680-6

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关键字

  • BL21 (DE3)
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