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免疫接种利什曼虫tarentolae-衍生的诺如病毒样颗粒引起高体液反应并刺激中和抗体的产生

摘要

背景

诺如病毒是世界范围内流行和散发急性非细菌性肠胃炎的主要病因。不幸的是,开发一种有效的诺如病毒疫苗被证明是困难的,而且目前还没有预防疫苗。诺如病毒疫苗的进一步研究应被视为重中之重,需要新的候选疫苗。最近开发安全疫苗的方法之一是使用病毒样颗粒(VLPs)。基于vlp的疫苗显示出巨大的免疫潜力,因为它们模拟了病毒颗粒的形态和结构,而不存在病毒基因组。

后果

这项研究是第一份在原生动物中成功产生诺沃克病毒VLP的报告利什曼虫tarentolael . tarentolae)原生动物源性候选疫苗具有高度的免疫原性,不仅能够诱导强烈的免疫反应(抗体滴度达到104)但也刺激受体阻断试验证实的中和抗体的产生。抗体滴度能够减少VLP与受体的结合> 50%(英国电信)50), 1:5 - 1:20 20血清稀释。

结论

中国产诺沃克病毒VLPsl . tarentolae可能与诺如病毒疫苗的研制有关

背景

诺沃克病毒(NOV)是一种阳性的单链RNA病毒,在全球范围内引起流行性和散发性急性胃肠炎病例[12]。NOV是高度传染性的媒介;它们可以通过粪口途径传播,通常通过与受感染者的密切接触或通过食用受污染的食物或水在封闭社区中引起暴发[3.].目前的证据是NoV的疾病负担很高,仅次于轮状病毒,是世界范围内严重急性肠胃炎和腹泻相关死亡率的原因。据估计,11月11日在全球造成约6.85亿急性肠胃炎病例,每年造成20多万人死亡。该疾病在所有环境中均可发生,但在幼儿中发病率最高。每年在全世界5岁以下儿童中观察到2亿多例病例,导致5万多名儿童死亡,其中大多数在发展中国家。然而,NoV感染在发展中国家和工业化国家都是一个问题,由于医疗成本和生产力损失,全球经济损失超过600亿美元[4].

NoVs属于家族杯状病毒科可分为10个基因群(GI-GX),再细分为48个基因型。诺如病毒是一种T = 3的二十面体衣壳非包膜病毒,主要由VP1衣壳蛋白的多个拷贝组成。尽管NoV具有很高的遗传多样性,但大多数NoV感染是由II型基因型4 (GII.4)菌株引起的。GII.4变异与所有报告的疫情的70-80%相关,如Farmington_Hills_2002, GII.4 Hunter_2004, GII.4 Den Haag_2006b, GII.4 New Orleans_2009和GII.4 Sydney_2012 [56].在2002年至2012年期间,大约每2至4年就会出现新的GII.4病毒,但自2012年以来,同一种病毒(GII.4悉尼)一直是世界范围内据说是大流行的主要毒株[7].在没有有效预防疫苗的情况下,11月大流行在全球范围内迅速蔓延,造成了巨大的医疗和社会费用负担。考虑到诺瓦克病毒的巨大疾病负担和控制的难度,疫苗可能是一种有吸引力的,也许是唯一有效地在更广泛的社区控制诺瓦克病毒的方法。

2016年,世界卫生组织表示,开发NoV疫苗应该被视为绝对优先事项。疫苗开发带来了巨大的科学挑战,需要大量的资金和时间投资。目前疫苗开发的趋势侧重于疫苗安全性和低成本生产,如基于vlp的疫苗(乙型肝炎病毒(HBV)、人乳头瘤病毒(HPV))。VLPs在形态和抗原上与本地病毒难以区分,但缺乏遗传物质,使它们不能复制。VLPs可以在不同的、易于扩展的表达系统中产生,如细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞。此外,基于vlp的疫苗诱导了一种强大的免疫反应,这与自然病毒感染诱导的免疫反应高度相似[8].目前,欧洲和美国批准和提供的基于vlp的疫苗很少。这些疫苗包括乙肝疫苗:Recombivax HB®和Engerix®,以及HPV疫苗:Gardasil®。

目前,一些NoV疫苗正在研发中,只有少数疫苗在临床测试中。所有这些产品都是基于非复制VLPs或P粒子亚基的生产,它们在各种表达系统中与NoV具有相似的表面抗原结构[9].迄今为止,只有正在开发的候选疫苗具有人类疗效数据[10].

在本研究中,我们基于非常规生产的NoV大流行株衣壳蛋白提出了潜在的候选疫苗利什曼虫tarentolael . tarentolae(LEXSY)表达系统。该系统易于操作,完全真核生物,具有哺乳动物样蛋白折叠和翻译后修饰机制(哺乳动物型n-糖基化模式)[1112]。该系统的主要优点包括生长条件便宜、生长速度快、易于操作,因为它对人体无致病性。此外,l . tarentolae培养物可以很容易地在生物发酵罐中扩大和生长;实际上,重组蛋白的产量可以达到每升培养基几毫克[1113].最近的报告也证实了巨大的潜力l . tarentolae在BALB/c小鼠体内作为生产抗原的活工厂。注射重组l . tarentolae通过有效地瞄准树突状细胞和淋巴器官,增加抗原呈递和t细胞免疫反应[14151617].

这份报告显示l . tarentolae-衍生的NoV VLP在接种的小鼠中诱导高体液免疫应答并刺激中和抗体的产生。

后果

基因的表达与表征l . tarentolae衍生的NoV衣壳蛋白

诺如病毒是一种非包膜病毒,病毒体主要由一种主要结构蛋白VP1组成。优化了NoV VP1衣壳蛋白的合成基因序列(GII.4 2012年11月大流行变异Hu/GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU)l . tarentolae使用原生动物适应密码子(GeneArt-Thermo Fisher Scientific)。在高密度细胞培养(> 10)中表达NoV VP1蛋白8使用四环素诱导的LEXSY表达系统。将合成的基因克隆到pLEXSY_I-blecherry3载体中,载体上有或没有分泌信号肽。添加分泌信号肽并没有改变蛋白的定位(数据未显示),主要是在细胞质中。在还原条件下通过western blotting分析蛋白表达,证实VP1单体的分子量约为60 kDa(图)。1A).有一个40 kDa左右的微弱带,可能与VP1蛋白的裂解/降解相对应。共聚焦显微镜分析(免疫荧光分析,IFA)显示高水平的NoV衣壳蛋白,主要位于胞浆中l . tarentolae细胞(图。1B) ELISA分析明确表明NoV衣壳蛋白在l . tarentolae被NoV基因组2抗体和针对NoV衣壳的构象抗体特异性识别,表明重组VP1蛋白自组装成VLP(图。1C) 受体结合试验(组织血型抗原(HBGAs)结合试验)进一步证实了VP1蛋白的正确折叠和构象l . tarentolae用粘蛋白包被板ELISA检测HBGAs结合的细胞(图)。1D)。最后,塔兰托拉-用TEM和DLS对NoV VLPs进行纯化和可视化。获得的NoV VLPs约为40 nm,与天然NoV的尺寸一致(图4)。1E、 F)。

图1
图1

描述的l . tarentolae-来源于NoV衣壳蛋白。一个在还原条件下对LEXSY表达系统中表达的NoV VP1进行Western blotting分析。使用特异性抗VP1-NoV抗体在细胞裂解物中检测该蛋白。WTl . tarentolae细胞裂解液作为阴性对照。B间接免疫荧光的l . tarentolae表达VP1蛋白的细胞。转染空pLEXSY_blecherry3质粒的细胞用作阴性对照。使用抗VP1-NoV抗体(绿色)检测VP1蛋白。红色对应于漂白荧光(转染对照)亮场图像显示细胞形态。图像使用徕卡TCS Sp8 X共聚焦显微镜获得。C通过ELISA从全细胞裂解液中识别NoV VP1蛋白。在ELISA平板上涂上连续稀释的l . tarentolae抗nov抗体检测到含有VP1蛋白的细胞裂解液。WTl . tarentolae细胞裂解物作为阴性对照。条形图代表从三次重复实验中获得的平均值。D结合NoV VP1蛋白产生l . tarentolae细胞转化为HBGAs受体。NoV VP1蛋白在美国frugiperda细胞作为阳性对照。E纯化水的电子显微照片l . tarentolae-衍生的NoV VLPs(比例尺:100 nm)。F用DLS测量NoV VLPs的尺寸分布

NoV生产的VLPsl . tarentolae诱导免疫小鼠产生抗体反应

为了证明在大肠杆菌中产生的基于NoV VP1的VLP的免疫原性l . tarentolae分别于第0、14、28天皮下免疫两组BALB/c小鼠,免疫组份为NoV VLPs或PBS。所有小鼠在鲨烯基水包油纳米乳佐剂(Addavax)存在下免疫。最后一次接种后2周,采集血样,收集各组血清作进一步分析。

采用ELISA法测定免疫诱导的体液反应。PBS免疫小鼠血清作为阴性对照。结果证实了其对同源和异源NoV重组蛋白VP1的识别能力。高稀释的NoV小鼠血清能够特异性识别不同表达系统(原生动物)产生的VP1蛋白l . tarentolae和昆虫美国frugiperda(WT细胞裂解物用作背景阈值)(图。2).

图2
图2

BALB/C小鼠NoV-VP1基VLPs诱导的体液反应分析l . tarentolae接种后收集的小鼠血清。酶联免疫吸附测定板涂以连续稀释的重组蛋白l . tarentolae含有VP1的细胞裂解物(一个)或WTl . tarentolae细胞溶解产物(B)(背景阈值)。作为一个参考美国frugiperda含VP1-NoV的介质(C)或WT美国frugiperda培养基(D)。稀释系数在x轴上表示。对于每一种酶联免疫吸附试验,均显示了三个独立实验的平均值。平均值A450值和标准偏差显示在y轴上

血清终点滴定结果显示VP1-NoV抗体效价达到104(无花果。3.).抗体效价估计为结合血清浓度至少比pbs佐剂免疫对照血清高2倍。

图3
图3

免疫后收集的小鼠血清终末抗体滴度分析。酶联免疫吸附测定板l . tarentolae含有VP1-NoV VLPs的细胞裂解物。混合血清的稀释系数在x轴上显示。对于每一种酶联免疫吸附试验,给出了三个独立实验的平均值。平均值A450值和标准偏差显示在y轴上

进行HBGA阻断试验以测试获得的小鼠抗体的中和潜力。来自猪胃的III型粘蛋白被用作阳性碳水化合物对照,因为此前有报道称其主要含有a和H抗原。获得的结果表明,与小鼠血清孵育后,NoV VLPs与HBGAs结合的显著减少(PBS接种的小鼠血清作为阴性对照)。抗体滴度能够减少VLP结合> 50%(英国电信)50), 1:5 ~ 1:20 0血清稀释(图。4)证实了接种NoV vp1基VLPs诱导的特异性保护性免疫应答l . tarentolae

图4
图4

阻断试验中VP1 NoV小鼠血清的分析。ELISA板涂有来自猪胃的III型粘蛋白。小鼠血清的系列稀释液阻断的能力美国frugiperda-测量了HBGAs衍生的NoV VLP。汇集血清的稀释系数显示在x轴上。对于每个ELISA,给出了三个独立实验的平均值。平均A450值和标准偏差显示在y轴上

讨论

人类NoVs是所有年龄组人群中急性病毒性肠胃炎的主要原因。2016年6月,世界卫生组织疫苗产品开发咨询委员会确定NoV为疫苗开发的优先病原体[18].

VLPs是无法复制的空粒子,在形态上与原生病毒相同。VLPs可引起细胞和体液免疫反应[919].考虑到VLPs与可溶性蛋白相比具有较高的免疫原性,VLP平台最近被用于许多疫苗研究。NoV衣壳蛋白VP1具有构象性免疫显性抗原位点。这些抗原表位在VLPs表面以多个副本形式呈现[720.].这些抗原表位的最佳表达的VLP免疫原可能提高对人11型病毒的交叉保护免疫[21].因此,通过表达VP1的自组装产生的NoV VLPs似乎是NoV疫苗开发的合适候选[22].

使用NoV VLP作为候选疫苗已经进行了广泛的研究,包括II期临床试验(NCT03039790),该试验可能决定针对NoV感染的疫苗开发的成功[232425].该报告是第一个描述获得高效表达基于NoV vp1的VLPs的可能性l . tarentolae原生动物寄生虫。在这里,l . tarentolae通过间接免疫荧光和兔抗nov多克隆抗体ELISA检测证实了VP1的正确折叠。通过OptiPrep梯度超离心法对VP1蛋白进行生物物理分析,TEM证实了该衣壳蛋白自组装成直径约40 nm的VLPs(数据未显示)。这些结果与之前发表的关于NoV VLP在酵母和昆虫细胞中表达的数据一致[2627].VLPs大部分位于33%的OptiPrep层,这与Teixeira描述的结果一致et al。另一个成员是杯状病毒科家兔出血性疾病病毒(RHDV)用同样的方法分析[28].LEXSY表达系统的主要优点是可以低成本扩大细胞培养和使用生物反应器。这两个特性使l . tarentolae基于表达系统吸引了工业化规模的抗原生产[18].以前,该表达系统仅用于生产少量病毒抗原,如血凝素、HPV L1或HBV小表面抗原[2930.3132),抗体(17333435]及重组蛋白[3637].

在昆虫、哺乳动物、酵母中产生的NoV VLPs [38),而大肠杆菌作为全长VP1蛋白的细胞[3940或P粒子[4142]先前已有报道在小鼠体内诱导抗体反应。在这里,我们提供了强有力的证据,证明在小鼠体内产生的VLPs具有免疫原性潜力l . tarentolae.用寄生虫来源的NoV VLPs免疫的小鼠血清能够特异性识别来自昆虫细胞的同源和异源抗原。此外,两种类型的VLPs的反应水平相当。这种交叉反应可能表明形态结构的相似性获得的小鼠血清中的终末抗体滴度显示出对该抗原的高体液反应l . tarentolae-衍生免疫原(滴度104),其结果可与用昆虫细胞产生的VLPs免疫的兔血清的结果相媲美。

每种疫苗的目标都是诱导产生能够阻止病毒进入的中和性抗体。利用NoV进入HBGA受体。到屁股,如果l . tarentolae-我们进行了衍生的VLPs能够引发保护性反应阻断试验。我们确定小鼠血清能够强烈干扰VLPs与HBGAs相互作用的能力。该数据表明,新的寄生虫表达系统可以成功用于疫苗开发。

结论

提出的结果是第一个以我们的知识来证明的l . tarentolae由全长NoV VP1蛋白形成的衍生VLPs可诱导强烈的免疫应答,并导致高滴度的中和抗体的产生。成功地表达了重组粒子l . tarentolae在寻找替代解决方案服务于制药用途的大规模VLP生产中具有重要意义。

材料和方法

Vp1合成序列和质粒

2012年11月4日GII大流行变异(Hu/GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU)vp1DNA编码序列(1637bp)的优化使用l . tarentolae-适应密码子(GeneArt-Thermo Fisher Scientific),由GeneArt Gene Synthesis合成。将合成的基因连接到BglII-NotI酶切位点丛神经-blecherry3vector(Jena Bioscience)。

l . tarentolae培养和表达

NoV衣壳蛋白按照制造商说明书(Jena Bioscience)使用可诱导的LEXSY表达系统进行表达。简单地说,是携带质粒Vp1基因序列被传送到l . tarentolae450v, 450 μF脉冲时间5 ~ 6ms。电孔细胞在含博莱霉素(100µg/ml)的LEXSY BHI培养基中悬浮培养。随后,重组细胞株在25 cm内培养2组织培养瓶中填满选择培养基,26℃,在黑暗中保存72 h,搅拌培养至最终光密度4-5,600 nm (OD = 600)。通过添加最终浓度为15µg/ml的四环素诱导T7启动子驱动的转录。

SDS-PAGE和蛋白质印迹

将含有NoV VLPs的样品加载在10-20%的预制WedgeWell Gel (Thermo Scientific)上,并在165 V的恒定电压下运行。电泳后,将蛋白质半干电转移到聚偏二氟乙烯膜上。然后在5%半脱脂牛奶溶液(5%milk/TBS/0.01% Tween20)中封闭膜1小时,并与兔抗n末端衣壳蛋白抗体Abcam ab92976 (1:1000 in 5%milk/TBS/0.01%Tween20)在8°C孵育过夜。第二天,用洗涤缓冲液(TBS/0.01%Tween20)洗涤膜3次,并在过氧化物酶标记亲和纯山羊抗兔抗体(Jackson免疫研究)溶液(5%牛奶1:4000 /TBS/0.01%Tween20)中室温孵育1小时。洗涤后(同上)用SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific)进行反应。

免疫荧光

利什曼虫tarentolae用PBS洗涤表达NoV衣壳蛋白的细胞和对照细胞,并在室温下在4%多聚甲醛中固定30分钟。用固定细胞悬浮液覆盖赖氨酸涂层的玻璃盖玻片并使其干燥。然后,用PBS中的0.2%Triton X-100使细胞渗透10分钟。随后,将盖玻片接种于培养皿中用NoV抗体的兔抗N末端衣壳蛋白(Abcam ab92976)进行ted)(1:2000在PBS/1%吐温20/5%FBS中)1小时。然后用PBS清洗盖玻片,并用Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔二级抗体(Invitrogen)(PBS中1:1000/1%吐温20/5%BSA)孵育1h。清洗后,用延长金防伪试剂(Thermo Scientific)将盖玻片安装在显微镜载玻片上,并使用徕卡TCS Sp8 X共聚焦显微镜分析细胞。

VLP的生产和净化

细胞溶菌作用

Tetracycline-inducedl . tarentolae细胞培养在26℃摇瓶中培养72 h,搅拌培养至OD600的最终光密度为4-5。然后细胞在4°C下8000 rpm离心15分钟。将细胞颗粒重悬于冰冷的裂解缓冲液(PBS/0.6%Tween-20)中,超声(40 min, 40%振幅,10 s时间开启,15 s时间关闭)。裂解后的细胞在4℃下8000 rpm离心40 min,丢弃细胞球,裂解液在4℃下保存16 h,形成颗粒。

非离子型碘沙醇培养基梯度(Opti-Prep™梯度)的超离心

溶菌产物包含一种分层在OptiPrep™梯度(Sigma-Aldrich)中形成更加清晰管(2毫升的40% (v / v) OptiPrep™,2.5毫升36% (v / v) OptiPrep™,2.5毫升33% (v / v) OptiPrep™,2毫升30% (v / v) OptiPrep™在更加清晰水)和超离心机在27000转16 h,在4°C。收集500 μ l馏分并进行分析。使用Amicon®Ultra 100 K离心单位(默克Millipore)的PBS替换OptiPrep™缓冲液。采用考马斯亮蓝R-250染色,SDS-PAGE法测定各组分的纯度。

ELISA法检测NoV-VLPs

96孔ELISA板(Greiner Microlon高结合,透明),以100µl/孔依次稀释l . tarentolae细胞裂解物[野生型(WT)和NoV-VP1裂解物],并在4℃下将涂布板培养过夜。此外,用100µl/孔连续稀释的美国frugiperda培养基[野生型(WT)和NoV-VP1],并在4°C下培养过夜。然后在4°C下洗涤培养皿 × 使用200µl/孔洗涤缓冲液(PBS/0.05%吐温20)5分钟,使用250µl/孔封闭缓冲液(3%BSA/PBS/0.05%吐温20)在37°C下封闭1小时,并按照之前的方法进行清洗。接下来,添加100µl/孔的小鼠抗NoV基因组2抗体(Abodies online.com)(3%BSA/PBS/0.05%Tween20中的1:1000)、兔抗VP1构象抗体(Immune Technology Corp.)(3%BSA/PBS/0.05%Tween20中的1:1000)或免疫后第56天收集的免疫小鼠的混合血清,并在37°C下培养1小时,和之前一样清洗盘子。接下来,添加100µl/孔的过氧化物酶结合亲和纯山羊抗兔或抗鼠抗体(Jackson Immuno Research)(1:2000加入3%BSA/PBS/0.05%吐温20),并在室温下培养1小时。最后,按照最后一个洗板步骤(6 × 添加100µl/孔的HRP底物溶液(1步Turbo TMB-ELISA,热电科学公司)。将培养板在黑暗中培养,直到形成蓝色,并通过向每个孔中添加50µl 0.5 M硫酸停止反应。使用平板阅读器(NanoQuant Microplate reader,帝肯)在450 nm处测量信号强度。

组织血型抗原(HBGAs)结合ELISA试剂盒

96孔酶联免疫吸附测定板(Greiner Microlon高结合,透明)涂有来自猪胃的III型粘蛋白(Sigma-Aldrich;10µg/ml, PBS),室温保存4 h。然后用200µl/孔的洗涤液(PBS/0.05%Tween20)洗涤4 × 5 min,用250µl/孔的洗涤液(3%BSA/PBS/0.05%Tween20)在37℃封闭2 h。堵塞后的盘子被冲洗成以前的样子。接下来,100µl/井生产NoV VLPsl . tarentolae将细胞加入孔中,室温孵育1 h。NoV生产的VLPs美国frugiperda细胞作为阳性对照。洗涤后,100µl /兔子anti-VP1构象的抗体(免疫技术公司)(1:1000 tween20 3% BSA / PBS / 0.05%)被添加的板是孵化1 h在37°C孵化紧随其后的100µl / Peroxidase-conjugated AffiniPure山羊Anti-Rabbit抗体(杰克逊免疫研究)(1:20 00 tween20 3% BSA / PBS / 0.05%) 1 h在室温下。最后洗涤平板(6 × 5 min, 200µl/孔),加入100µl/孔酶标底物溶液(1-Step Turbo TMB-ELISA, Thermo Scientific)。深色孵育至出现蓝色,每孔加入50µl 0.5 M硫酸终止反应。在450nm波长下使用平板阅读器(TECAN NanoQuant Microplate reader)测量信号强度。

电子显微镜

为了可视化l . tarentolae部分纯化的裂解物在TM缓冲液(50 mM Tris–HCl pH)中稀释 = 7.4/10毫米MgCl2)并吸附到碳涂层网格上。用2%醋酸铀酰进行阴性染色。在飞利浦CM100透射电子显微镜(TEM;Gdańsk大学,波兰)。

动态光散射

使用Malvern Instrument Zeta Sizer NanoS DLS (Malvern, Worcestershire, UK)进行粒径测定。测量是在25°C的水中进行的。样品溶液通过0.45 μm过滤器,在室温下平衡10分钟,每次测量持续10秒。结果计算为连续6次测量的平均值。

动物免疫

两组6只BALB/c雄性小鼠(6周龄)进行皮下免疫。第一组小鼠作为阴性对照,分别于0、14、28 d用1:1 pbs -佐剂混合物免疫。第二组接种疫苗在实验室生产15µg VLPl . tarentolae将候选疫苗与鲨烯基水包油纳米乳剂佐剂(Addavax, invvivogen)按1:1比例混合。所有动物实验都是由一家经认证的公司(医学大学三城中心动物实验研究和服务中心,Gdańsk)按照目前的动物实验指南进行的。该议定书得到了Gdańsk医科大学动物实验伦理委员会的批准(许可号:45/2015)。所有手术都是在异氟醚麻醉下进行的,所有的努力都是尽量减少动物的痛苦。

ELISA法测定小鼠血清终点滴定

免疫后第56天采集免疫小鼠血清并进行混匀。96孔ELISA板(Greiner Microlon高结合,透明),100µl/孔L. tarentolae衍生的NoV- VP1细胞溶解产物。涂布板在4°C孵育过夜。然后用200µl/孔(PBS/0.05%Tween20)洗涤4 × 5 min,用250µl/孔(3%BSA/PBS/0.05%Tween20)封闭2 h, 37℃。将培养皿按既往洗涤,将连续稀释的小鼠血清(3%BSA/PBS/0.05%Tween20)加入到培养皿中,室温孵育1 h。兔抗nov抗体(Abcam ab92976)系列稀释) (3%BSA/PBS/0.05%Tween20)作为阳性对照。孵育盘洗净后,采用合适的二抗液(Jackson immunoresearch) (3%BSA/PBS/0.05%Tween20)检测。最后,最后一个plate-washing步骤后(6×5分钟与200µl /), 100µl / HRP-substrate解决方案添加(互译涡轮TMB-ELISA,热科学),孕育了板在黑暗,直到蓝色发达,和反应是停止通过添加50 0.5µl M硫酸。450nm处的信号强度用平板阅读器(nanquant Microplate reader, TECAN)测量

阻断ELISA

96孔酶联免疫吸附测定板(Greiner Microlon高结合,透明)涂有来自猪胃的III型粘蛋白(Sigma-Aldrich;10µg/ml, PBS),室温保存4 h。然后用200µl/孔的洗涤液(PBS/0.05%Tween20)洗涤4 × 5 min,用250µl/孔的洗涤液(3%BSA/PBS/0.05%Tween20)在37℃封闭2 h。然后,连续稀释的小鼠血清(开始稀释,1:5)与等量的NoV VLPs混合美国frugiperda昆虫细胞,室温孵育1小时。用pbs接种小鼠的血清作为阴性对照。将vlp -血清混合物加入粘蛋白包被板,室温孵育1 h。NoV生产的VLPs美国frugiperda不添加小鼠血清作为阳性对照。洗涤后,100µl /兔子anti-VP1构象的抗体(免疫技术公司)(1:1000 tween20 3% bsa / PBS / 0.05%)添加和孵化1 h在37°C紧随其后的孵化与100µl / Peroxidase-conjugated AffiniPure山羊Anti-Rabbit抗体(杰克逊免疫研究)(1:20 00 tween20 3% bsa / PBS / 0.05%) 1 h在房间温度。最后洗涤平板(6 × 5 min, 200µl/孔),加入100µl/孔酶标底物溶液(1-Step Turbo TMB-ELISA, Thermo Scientific)。深色孵育至出现蓝色,每孔加入50µl 0.5 M硫酸终止反应。使用酶标仪(NanoQuant Microplate reader, TECAN)在450nm处测量信号强度․BT50定义为OD450值为阳性对照(仅VLPs) 50%的血清稀释量。

11月积极控制

纯化的NoV VLPs在美国frugiperda如前所述的细胞[43].简单地说,就是合成DNA编码Vp1-c通过基因Art基因合成(Thermo Fisher Scientific)合成了2012年11月4日GII.4变体(Hu/GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU)的apsid蛋白,并克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中,以获得重组杆状病毒(rBV-VP1)Sf9昆虫细胞。用于生产NoV VLPs,Sf9悬浮培养的细胞以3的MOI感染rBV-VP1,并在感染后60小时收获。

统计分析

所有统计分析均使用Sigmaplot 12.0软件(SYSTAT软件)进行。两组均值之间的统计差异采用t检验进行分析。每组实验共3个重复,P值< 0.05为差异有统计学意义。

数据和材料的可用性

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从相应作者处获得。

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下载参考资料

确认

我们要感谢马戈尔扎塔·皮奥特罗斯卡提供的技术援助和Beata Muszyńska提供的动物护理和免疫服务。我们还感谢Ewa Nanowska对手稿进行专业英语编辑,以及Beata Bąk提供的额外编辑。

资金

这项工作得到了波兰国家研发中心的支持[LIDER/157/L-6/14/NCBR/2015]。

作者信息

从属关系

作者

贡献

概念化:BG和MP;方法学:KZ、MP、AC、GPS;形式分析:BG、KG;调查:MP、KZ、AC、MN;资源:BG;撰写原始草案准备:KZ;写作审查和编辑:MP、KG、AC、SŻ、DN、LH、BG;可视化:MP、MN、WZ、KZ、BG;监督:BG;项目管理:BG;资金获取:BG。所有作者have同意手稿的出版版本。所有作者都阅读并批准了最终手稿。

相应的作者

与Beata Gromadzka的通信。

道德声明

伦理批准和同意参与

动物研究议定书由Gdańsk医科大学动物实验伦理委员会批准(许可号:45/2015)。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

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潘西旭,齐默,蔡诺塔。et al。免疫接种利什曼虫tarentolae-衍生的诺沃克病毒样颗粒引起高体液反应并刺激中和抗体的产生。活细胞的事实20.186(2021)。https://doi.org/10.1186/s12934-021-01677-1

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  • 诺沃克病毒
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