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代谢工程耐辐射球菌用于从甘油生产蒎烯

摘要

背景

这项工作的目的是设计耐辐射球菌R1是生产蒎烯的微生物细胞工厂。蒎烯是一种单萜分子,主要用于生产香料、医药产品和喷气发动机生物燃料。我们的目标是从甘油中生产蒎烯,甘油是各种工业的丰富副产品。

后果

以促进蒎烯的生产耐辐射奇球菌的,我们表达了来自大冷杉,香叶酰焦磷酸(GPP)合酶由大肠杆菌,并过表达天然的1-脱氧d木酮糖5-phosphate合成酶。此外,我们通过使基因失活,破坏了与底物GPP竞争的去氧黄质途径dr0862,编码植物烯合酶,或用大肠杆菌.这些操作导致了耐辐射奇球菌的能产生3.2的菌株 ± 0.2 mg/L蒎烯,在添加甘油的最低培养基中,产率为0.13 ± 在摇瓶培养基中添加0.04 mg/g甘油。此外,我们的研究结果表明,该药物具有较高的耐受性耐辐射奇球菌的对蒎烯的反应大肠杆菌

结论

在这项研究中,我们成功地设计了极端微生物耐辐射奇球菌的生产蒎烯。这是第一个证明使用耐辐射奇球菌的作为生产萜类分子的细胞工厂。此外,其对蒎烯的抗性较高耐辐射奇球菌的一个合适的宿主进一步工程努力,以提高蒎烯效价,以及一个候选的生产其他萜类分子。

背景

近年来,人类社会可持续发展问题日益突出。对化石燃料的担忧正在增加,这与化石燃料储量的枯竭以及它们的分布和环境影响相关的风险有关[188 app 188 app ].化石燃料的使用与温室气体的产生和大气中金属颗粒、氮氧化物和硫氧化物的增加有关[188 app ].最近的报告表明,全球约87%的CO2排放是由人类活动造成的。根据目前的预测,到2050年,世界人口将超过90亿,这将使人们更加关注可持续发展[188 app ].这些挑战促使我们大力推动从可持续来源获取能源和化学品。在这方面,微生物细胞工厂起着主要作188bet亚洲体育平台用。它们能够将农业或工业的低价值副产品转化为高价值的化学品或生物燃料[188 app ].

甘油是各种大型工业过程的副产品,如生产肥皂(甘油三酯皂化)和生物柴油(酯交换)。因此,它被认为是一种廉价的发酵碳源[188 app ].与葡萄糖相比,甘油是一种更少的碳源,每单位价格提供更多的减少当量[188 app ].因此,这种多元醇化合物是利用微生物细胞工厂生产有价值分子的方便碳源。188bet亚洲体育平台

乙醇是全球最受欢迎的生物燃料[188 app ].然而,对可直接用于现有发动机的更高燃烧功率的燃料的需求导致了其他化合物的发展,如高级生物燃料[188 app ].丁醇(188 app ]、丁烯及其低聚物[188 app ],脂肪酸,加氢处理酯[188 app ],双沙波烯,法尼烯[188 app ],和蒎烯是这样的先进生物燃料的实例。蒎烯脱颖而出这些分子作为能够产生高能量水平接近JP-10燃料的化合物中所需的喷气发动机[188 app ].某些植物会产生少量的单萜,但从这些植物中提取蒎烯效率低、繁琐且成本高。除了用作高级生物燃料外,蒎烯还广泛用于杀虫剂、香料、香料和医药产品的生产[188 app ].

蒎烯合成酶通过GPP环化催化α-和/或β-蒎烯的形成。蒎烯合酶主要存在于植物中,尤其是松树答:茅松果体taeda,挪威云杉.几个蒎烯合酶已经表征,一些生产蒎烯的两种异构体(α和β),以及其他只有一个异构体。两个α和β异构体可以以二聚体形式被利用作为一个强大的生物燃料(α蒎烯二聚体:146.900 BTU,β蒎烯二聚体:146.500 BTU)188 app 188 app ].各种蒎烯合成酶已被开发用于微生物生产蒎烯。在一项比较研究中,来自答:茅结果表明,这两种异构体的生产量最高大肠杆菌188 app ].

微生物细胞工厂代谢工程领域的最新进展为利用廉价碳源生产蒎烯开辟了新的途径。188bet亚洲体育平台在微生物细胞工厂生产蒎烯的大部分努力已经得到关注188bet亚洲体育平台大肠杆菌.然而,蒎烯收率和滴度工程大肠杆菌压力仍然低于工业生产的门槛。目前报道的最高蒎烯效价在摇瓶培养中为166.5 mg/L,在补料分批发酵中为0.97 g/L [188 app 188 app ].根据以往的研究,通过大肠杆菌可能与蒎烯和GPP(蒎烯的主要前体)的毒性有关,以及作为蒎烯合成酶主要辅因子的锰的可得性有限[188 app ].鉴于大肠杆菌对于蒎烯的生产,我们决定进行调查耐辐射球菌作为这方面的一个潜在选择。

耐辐射球菌众所周知,它们对不同来源的压力非常耐受性:电离辐射、活性氧、紫外线、重金属、干燥、高盐度和酒精。此外,它还能够利用各种碳源(不同的糖、甘油、脂肪和蛋白质)[188 app 188 app ],使其成为生物修复、分解有毒化合物和生产有价值分子等多种用途的有前途的候选者[188 app 188 app ].考虑到锰是大多数蒎烯合酶的主要辅因子,包括答:茅在美国,锰的含量很高耐辐射奇球菌的(0.2-4 mM)是另一个正面特征[188 app ].最重要的是,耐辐射奇球菌的拥有一个强大的非甲戊酸GPP生产途径[188 app ],并能产生大量的去氧黄质色素,而GPP是这种色素的前体[188 app ].这些明显的特征使耐辐射奇球菌的在不同的标准或苛刻的条件下,以及在不同的碳源上生长,有前景的生产萜化合物的平台。另一方面,也应考虑到一些挑战,如缺乏强诱导启动子等基因工程工具,以及对该菌株代谢知识的不足。

在这项研究中,耐辐射奇球菌的一种极端微生物,成功地在添加了甘油的最小培养基中产生蒎烯。我们的生产菌株表达来自答:茅的GPP合酶大肠杆菌,并过表达天然的1-脱氧d-木聚糖5-磷酸合酶(DXS)的突变体dr0862八氢番茄红素合成酶(编码)。该菌株在最小甘油培养基中能产生3.2±0.2 mg/L的蒎烯。

材料和方法

菌株和生长条件

质粒传播,大肠杆菌NM522在LB培养基(10 g/L胰蛋白胨、5 g/L NaCl和5 g/L酵母抽提物)中于37°C下以250 rpm摇动生长。对于蒎烯生产,大肠杆菌用蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、甘油5 g/L、NaCl 2 g/L、MnCl2, 0.5 mM氯化镁2,和20 mM磷酸盐缓冲液pH 7.0)在30°C摇晃(180转)。耐辐射奇球菌的R1在PGY培养液(蛋白胨5 g/L,葡萄糖2 g/L,酵母膏5 g/L, K 1 g/L)中生长2HPO4)在30°C和TGY琼脂(5 g/L胰蛋白胨、1 g/L葡萄糖、5 g/L酵母抽提物、1 g/L钾)上摇动(180 rpm)2HPO4,15 g/L琼脂),在30°C下进行评估耐辐射奇球菌的首先,在30°C摇晃(180 rpm)下,我们使用富含10 g/L蛋白胨,5 g/L酵母提取物,20µM MnCl的培养基2,1毫米氯化镁2, 0.18 mM CaCl2.培养基中添加5 g/L甘油,5 g/L葡萄糖,或这两种碳源的2.5 g/L组合。为评价工程菌株的蒎烯产量,在摇瓶中使用含5 g/L甘油的富培养基。然后,以不同浓度的甘油为唯一碳源的最低培养基(10、15或25 g/L甘油,50 mg/L半胱氨酸,25 mg/L组氨酸,25 mg/L蛋氨酸,1% BME维生素混合物,20µM MnCl)2,1毫米氯化镁2, 0.18 mM CaCl2,10 g / L Na2HPO4, 2 g/L KH2阿宝4)在30°C摇瓶(100 rpm)中培养出最佳菌株,以甘油作为主要碳源生产蒎烯。此外,在富含和最少甘油的培养基中测试70至250 rpm的不同搅拌速度。必要时,使用适当的抗生素(100µg/ml氨苄西林、50µg/ml卡那霉素和10µg/ml四环素用于大肠杆菌;氯霉素3µg/ml,卡那霉素25µg/ml耐辐射奇球菌的)添加到培养基中。

DNA操作和菌株构建

1785 bp的编码序列答:茅从得到蒎烯合酶[NCBI,登录号:AAK83564,无信号肽],密码子优化的用于表达的耐辐射奇球菌的,并由GenScript合成。密码子优化的基因序列显示在附加文件中188 app :图S1。合成的基因(表示ps博士)中,用添加Xho我/我/濒死经历I酶切位点位于基因上游,亚克隆到质粒pRADN1 [188 app ]中间Xho我和Bam你好,网站。我们决定将蒎烯合成酶基因置于3个众所周知的强启动子PPgroE和P凝灰岩通常用于基因的组成表达耐辐射奇球菌的188 app ].三个启动子片段(包括它们相关的核糖体结合位点),利用pcr扩增耐辐射奇球菌的R1基因组DNA作为模板。所有引物序列列在附加文件中188 app S1:表。启动子片段P和PgroE之间插入Xho我和Ndel我和P凝灰岩之间的Xho我和I,获得表达载体普拉达- kp、普拉达- gp、普拉达- tp。为了构建表达蒎烯合成酶- gfp融合的质粒,我们首先构建了缺失终止密码子的蒎烯合成酶基因的载体,本质上如上所述。接下来,我们进行PCR扩增绿色荧光蛋白使用pCDH 513B载体作为模板,并将其插入两者之间Bam你好,后面的3

表达大肠杆菌当前编码GPP合酶,置于P的控制下.首先,将启动子片段进行pcr扩增,插入pRAD-kP之间Bam你好,Xba我的网站。然后当前是扩增从菌进行大肠杆菌NM522基因组DNA与插入的结果片段之间Xba我和后面的III获得载体pad - p - i。此外,P当前将片段插入pRADN1中,获得pradi。对于本地人的过度表达耐辐射奇球菌的基因dx编码1-脱氧d木酮糖-5-磷酸合酶,我们放大在P并将其插入启动子片段之间后面的三世和萨尔我在pRAD-P-I。的dxPCR扩增耐辐射奇球菌的R1基因组DNA作为模板插入萨尔我和Sda我交出载体pad - p -I- d。为了构建pRAD-P-D质粒,对pRAD-P-I-D质粒进行限制Bam你好,后面的三世删除当前,用S1核酸酶(ThermoFisher)处理以去除单链DNA悬置,然后重新连接以产生pRAD-P-D。

此前已有研究表明,蒎烯合成酶和GPP合成酶的翻译融合可以提高蒎烯生产的催化活性[188 app ].为了验证这一点,我们制作了两个版本的蒎烯合成酶-GPP合成酶融合:一个在N端有蒎烯合成酶(pinene合成酶-连接-GPP合成酶)和一个在N端有GPP合成酶(GPP合成酶-连接-蒎烯合成酶)。在这两种情况下,酶都是由一个灵活的GGGGS连接肽分离的。为了构建表达这些融合的质粒ps博士当前基因PCR扩增,限制性萨尔我/我和我/BamHI,分别与插入之间萨尔我和BamHI在prap - p - i - d中生成prap - p:G-D。质粒pRAD-G:P-D以类似方法制备。

的基因dr0862crtB)及dr1395编码八氢番茄红素分别合酶和GPP合酶,其中在灭活耐辐射奇球菌的R1。这是通过用从P为此,我们PCR扩增了基因的上游和下游区域以及P推广使用耐辐射奇球菌的R1基因组DNA作为模板。以pET-26b质粒为模板,PCR扩增卡那霉素抗性基因。然后将片段依次插入pET-26b中(以组装片段为目的),最后以完整片段为模板进行PCR,引物分别为dr0862_UP fwd/ dr0862_DWN rev和dr1395_UP fwd/dr1395_Dwn rev。PCR产物经纯化后用于转化耐辐射奇球菌的R1(如下所述的转换)。失活时dr1395,将PCR片段与含有该片段的质粒混合当前基因(pradi和pradp - i - d)。缺少当前没有获得变压器。因为这两种突变都被认为会破坏耐辐射奇球菌的,在含卡那霉素的TGY琼脂上选择不产生色素表型的转化子,对修改后的染色体区域进行pcr扩增和测序,确认基因替换。

蒎烯生产菌株是通过转化耐辐射奇球菌的株R1,∆dr0862和∆dr1395与相关表达质粒。所有质粒及菌株列于表中188 app

表1质粒和菌株

对构建的耐辐射奇球菌的菌株对一个大肠杆菌蒎烯生产菌株,大肠杆菌构建了EcpsB菌株。为此,我们将ps博士并将其插入pET26-b表达载体之间濒死经历我和BamHI生成pET26b-ps博士.接下来,大肠杆菌BL21(DE3)与pET26b-共转化ps博士以及编码甲戊酸途径的pMBIS质粒酿酒酵母188 app ].1mM的IPTG加入用于基因表达的诱导和蒎烯生产中大肠杆菌EcpsB。而ps博士基因密码子中表达而优化的耐辐射奇球菌的,酶的产生大肠杆菌经SDS-PAGE(附加文件)确认188 app :图S5)。

耐辐射球菌转化

转化是用改良的氯化钙法进行的[188 app ].简单地说,耐辐射奇球菌的在30°C, 180 rpm的搅拌速度下培养24 h,在新的5ml的PGY中加入100µl的细菌培养物,在30°C, 180 rpm的搅拌下培养,达到OD6000.4。取1.5 mL细胞培养液离心,弃上清。将细胞颗粒重悬在100µL的PGY液体中,再加入40µL的0.3 M氯化钙,加入30µL的微管中。取目的质粒10µl(1-2µg)或纯化扩增子10µl(0.2-0.6µg)加入微管中,轻轻移液混合。这种混合物放在冰了15分钟,然后放在一个30°C孵化器2 h。随后,1毫升PGY添加到细菌,和混合进一步孵化后30°C 24 h。这个孵化,混合TGY琼脂板上镀含氯霉素/卡那霉素(或两者),孵化30°C 72 h。

groE、katA和tufA启动子基因表达的确认

Real-time PCR方法确认启动子的功能,导致蒎烯合酶基因的转录。RNA提取,cDNA合成,SYBR green qPCR,使用相应试剂盒,按照制造商说明书(Pars Toos Co.)。利用引物Ps-RT fwd/rev和Gap-RT fwd/rev扩增蒎烯合酶基因和管家基因(甘油醛3-磷酸脱氢酶(dr1343分别)。

此外,为了证实在细胞中存在蒎烯合酶,我们进行了生长耐辐射奇球菌的表达蒎烯合酶融合到GFP,在PGY培养基中以30°C和180 rpm摇动24小时。使用荧光显微镜观察蒎烯合酶GFP融合的表达(Leica DM,4000 B)。

蒎烯毒性试验

研究α-蒎烯和β-蒎烯工程生产菌株的毒性耐辐射奇球菌的(∆dr0862P-I-D应变)和大肠杆菌在外源蒎烯存在的情况下,在微滴平板上培养EcpsB。在30°C、180 rpm搅拌速度的富液培养液中培养24 h,接种富液至起始OD630为0.02。将不同浓度的α-和β-蒎烯(1、1.75、2.5和5 g/L)添加到培养基中,并在30°C下在微孔板读取器(BioTek,ELx808)中将摇动速度设置为“培养基”进行培养。不同菌株的生长通过测定OD来确定630每30分钟一次,持续48小时。

耐辐射杜兰氏菌代谢蒎烯能力的测试

确定的能力耐辐射奇球菌的为了代谢α-和β-蒎烯,在含有10%v/v十二烷的富培养基中添加20 mg/Lα-和β-蒎烯.耐辐射奇球菌的接种了过量的疫苗600培养5天,30°C, 180转。然后,将0.5 mL的十二烷层转移到1.5 mL的微离心管中,14,000 g离心5分钟,沉淀碎片。上层放置在一个新的微管中,该样品用GC-FID分析,如下所述。将所得结果与发酵前无菌层和添加蒎烯异构体的十二烷层的结果进行了比较。

蒎烯样品制备

我们评估在丰富和最小的甘油培养基各种十二烷浓度(10和20%)的提取蒎烯。关于发酵用于生产蒎烯,1毫升24小时龄细菌培养物加入到50毫升新鲜生长培养基中并且温育在30℃和180rpm下振摇丰富和100rpm最少甘油平台。当OD600达到3耐辐射奇球菌的和1个大肠杆菌, 10%的v / v加入丰富培养基(180转/分振荡)的十二烷和最小甘油培养基(100转/分振荡)的20%提取蒎烯。分别于24、48、72 h后采样十二烷层,用气相色谱法测定回收的蒎烯[188 app ].

GC-FID和GC-MS分析

蒎烯生产耐辐射奇球菌的大肠杆菌气相色谱法测定。为此,取摇瓶培养物中0.5 mL的十二烷层转移到1.5 mL的微离心管中,14000 g离心5分钟,沉淀碎片。将上层置于新的微管中,其中1µl注入GC-FID或GC-MS。此外,为了分析产生的蒎烯在细胞内的存在,将生产蒎烯的发酵生物量在10.000 g离心10 min,并在生物量中加入5 ml十二烷。在剧烈涡旋后,用超声裂解细胞(20 s超声裂解/5 s冰敷15 min)。然后将0.5 mL的十二烷转移到1.5 mL的微离心管中,14000 g离心5分钟沉淀碎片。将上层十二烷转移到一个新的微管上,用GC-FID分析。

为了优化和确定保留时间,以α-和β-蒎烯分子(Sigma Co.)为标准样品。此外,为了量化产率,将不同浓度的蒎烯注射到GC-FID装置中,绘制标准曲线。

的GC-FID (Thermo Scientific Trace 1300) was used with a BPX-5 column (30 m 0.22 mm × 0.25 µm). The inlet temperature was set to 300 °C, purge flow 5 ml/min, split flow at 180 ml/min, the oven at 50 °C for 1 min, ramp at 50 °C/min to 250 °C.

通过GC-MS对工程菌株合成的蒎烯分子进行了鉴定。对于GC-MS,样品通过气相色谱系统(Thermo Scientific Trace 1300)与单个四极质谱仪(Thermo Scientific ISQ 7000)耦合进行分析。采用分流喷射,比例为20:1,入口温度为300°C。载气为氦气,入口流量设置为2ml·min−1在整个运行。气相色谱系统采用Thermo Scientific TraceGOLD TG-5MS色谱柱(长度:30 m;直径:0.25毫米;膜厚:0.25µm),采用如下温度梯度:初始温度为40°C,保温10 min, 50°C min时升至250°C−1中,然后在250保持℃8分钟。电子碰撞电离用质量检测器设置为30-600 M / Z使用。传输线以恒定的280℃下保持,和离子源温度为300℃。

结果与讨论

潜力耐辐射奇球菌的作为蒎烯生产宿主

在本研究中,我们调查了使用耐辐射奇球菌的以甘油为底物制备单萜分子蒎烯的新型宿主。我们假设耐辐射奇球菌的可能特别适合,因为它能产生一种色素,去氧黄质,像蒎烯一样,是由GPP合成的。此外,耐辐射奇球菌的展示多种类型的应激性,我们考虑的可能性,那就得蒎烯较高的固有电阻和GPP比,例如大肠杆菌.此外,耐辐射奇球菌的具有相对较高的细胞内锰浓度(0.2–4 mM),这是蒎烯合酶的主要辅助因子[188 app ].

作为第一步,我们试图构建一个基本的蒎烯生产菌株。蒎烯的前体是GPP。这种分子是通过天然的非甲戊酸途径产生的,它作为色素分子去氧黄质的前体。蒎烯合成酶催化GPP转化为蒎烯。已经描述了几种蒎烯合成酶,我们从其中选择了蒎烯合成酶答:茅被证明是有效的大肠杆菌188 app ].对编码序列进行密码子优化耐辐射奇球菌的并置于三个启动子PPgroE和P凝灰岩以前用于基因表达的基因耐辐射奇球菌的188 app 188 app ].然后我们培养这些菌株(WT kP、WT gP和WT tP)在含有甘油的富培养基中培养72小时,但在发酵液中未检测到蒎烯。为了确保基因表达,我们进行了实时PCR。这表明基因事实上是转录的,但所有三个启动子的mRNA水平相似(图。188 app a)启动子P的使用此前曾有报道[188 app 188 app ].考虑到该启动子与其他测试的启动子差异很小,我们决定使用P为所有随后的遗传结构。为了确保蒎烯合成酶蛋白也存在于细胞中,我们表达了一个在c端带有GFP标记的蒎烯合成酶变体。我们的荧光显微镜分析证实,该蛋白确实在细胞中产生(图。188 app b)。

图1
图1

蒎烯合成酶编码基因在野生型中有表达耐辐射奇球菌的细胞。一个三种启动子PPgroE和P凝灰岩采用实时荧光定量PCR分析,b并且,通过表达蒎烯合酶基因的构建体与DNA融合,证实了蒎烯合酶的存在绿色荧光蛋白.用荧光显微镜观察细胞内的荧光。天平条:4µm

中国蒎烯生产的代谢工程策略耐辐射奇球菌的

我们的初步研究表明,成功表达蒎烯合成酶不足以产生可检测水平的蒎烯。由于我们没有理由怀疑表达的蒎烯合成酶的功能,我们考虑了不同的可能的解释基于已知的代谢途径耐辐射奇球菌的(无花果。188 app ).可见,天然GPP合成酶通过催化GPP的合成在这一过程中发挥了重要作用。而耐辐射奇球菌的已知能产生足够量的GPP用于生产去氧黄质,GPP池有可能被去氧黄质途径的后续反应所排出:GPP单元缩合生成法尼基焦磷酸盐(FPP)和香叶基香叶基焦磷酸盐(GGPP)。这些反应消耗GPP,因此与蒎烯合成竞争GPP底物。

图2
figure2

图示的蒎烯生产策略和改进,以提高产量耐辐射奇球菌的耐辐射奇球菌的碳水化合物来源包括甘油、葡萄糖、氨基酸分解代谢和细胞内丙酮酸(Pyr)的产生。Pyr与甘油醛3-磷酸(GA3P)通过酶1-脱氧转化为1-脱氧-d -木糖5-磷酸(DXP)d-xylulose-5-phosphate合成酶(dx)。沿着这一途径,异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)分子被产生。然后,GPP合酶从这两个分子中生成一个GPP分子。最后,蒎烯合成酶(Ps)通过环化GPP催化合成蒎烯。黑色箭头表示单元格内的自然路径;紫色箭头表示通路中过表达;绿色箭头表示异种表达,十字符号表示该基因在细胞内失活。途径简写如下:Ec。gpp,大肠杆菌GPP合酶基因;Dr1395, GPP合成酶;Dr0862,天然的三苯合酶

Liu和他的同事先前指出GPP合酶是必不可少的耐辐射奇球菌的,但如果辅之以大肠杆菌不催化GGPP合成的GPP合成酶IspA [188 app ].的ir results showed GPP and FPP, as well as GGPP, are the main products of the native GPP synthase enzyme ind . radioduran,而天然的GPP合酶并不仅仅产生GGPP。因此,这种不产生GGPP的菌株应该有利于蒎烯的生产,因为它通过废除去氧黄质合成,保留了GPP库和较高的碳通量。一种防止去氧黄质产生的替代方法,而不删除天然的GPP合酶D。耐辐射耐久素是通过灭活催化GGPP转化为八烯的八烯合成酶来实现的。如果DMAPP和IPP合成GPP成为瓶颈,那么GPP合成酶IspA的表达也会导致GPP库的增加。最后,已有研究表明,利用异源甲戊酸途径可以提高GPP库和萜烯的产量大肠杆菌188 app ,而非甲戊酸通路的研究耐辐射奇球菌的表明这个途径非常活跃,我们决定促进这个天然途径。可以考虑通过过表达DXS来提高整个途径的通量,通过DXP合成途径引导更多的GA3P和丙酮酸。在此基础上,我们决定将编码GPP合酶和八烯合酶的基因灭活,并制备表达蒎烯合酶和GPP合酶IspA和/或DXS的质粒。

评估工程耐辐射奇球菌的生产蒎烯的菌株

根据我们对新陈代谢的分析耐辐射奇球菌的,我们构建了一些除了表达蒎烯合酶外,还表达大肠杆菌GPP合成酶和/或过表达DXS。这是在野生型和本地GPP合成酶(∆dr1395)或三苯合酶(∆dr0862灭活。随后用GC-FID检测这些菌株在富油培养基中的蒎烯生成情况,用GC-MS确认最终样品中的蒎烯异构体(见表)188 app 和无花果。188 app ).

表2蒎烯产量耐辐射奇球菌的经过72 h摇瓶发酵
图3
图3

不同重组物产生的蒎烯量耐辐射奇球菌的菌株在含甘油的富培养基中摇瓶生长72 h

如上所述,表达答:茅野生型菌株(WT kP)的蒎烯合成酶没有导致产生可检测水平的蒎烯。当大肠杆菌引入GPP合成酶(WT P-I),检测出0.5 mg/L的蒎烯产量。这似乎表明菌株(WT kP)的GPP池是不够的,而DMAPP和IPP向GPP的转化确实是蒎烯生产的瓶颈。

然后我们在该菌株中过表达DXS,产生WT P-I-D,预计这会增加1-deoxy-的产生d-xylulose -5-磷酸(DXP)从丙酮酸(比利牛斯)和3-磷酸甘油醛(GA3P),从而通过非甲羟戊酸途径增加的通量。先前已经表明,这种途径的酶中,只有这种酶的过表达可以增加生产GPP和类胡萝卜素的耐辐射奇球菌的重要的[188 app ,但在我们的实验中,它并没有导致显着高的蒎烯效价。

既往研究表明,非甲戊酸通路在耐辐射奇球菌的可支持分批补料发酵生产203.5 mg/g干细胞质量的类胡萝卜素分子[188 app ].这些结果表明GPP的高流量进类胡萝卜素合成途径,导致deinoxanthin生产。因此,它应该是相对于蒎烯合成破坏这一途径有利。为了测试这一点,我们构建了两个菌株,其中基因编码天然GPP合酶(dr1395)和八烯合酶(dr0862)均灭活。如上所述dr1395突变体只能通过补充大肠杆菌通过表达蒎烯合酶,该菌株(∆dr1395P-I)能够产生1.8 mg/L的蒎烯,与野生型背景(WT P-I)中获得的滴度相比,提高了3.6倍。当进一步过度表达DXS酶时,在菌株中∆dr1395P-I-D我们记录的滴度略高,但差异无统计学意义。如上所述,代入耐辐射奇球菌的GPP合酶与大肠杆菌防止GGPP的形成,GGPP进入脱氮质生物合成途径。因此,它可以防止通过脱氮质合成排出GPP池,但也可以防止GGPP的可能积聚。另一方面,它可能会减少GPP的数量。

为了更直接地灭活去氧黄质途径,我们灭活了基因dr0862,编码三苯合酶。在评价表达蒎烯合成酶的菌株的蒎烯产量时大肠杆菌GPP合成酶(∆dr0862P-I),我们看到滴度进一步增加到2.1 mg/L,是观察到的1.5倍dr1395突变体(∆dr1395P-I)。这表明,突变的主要有益效果是防止deinoxanthin形成,不妨碍GPP转化为FPP和GGPP的催化由耐辐射奇球菌的GPP合酶本身。在该菌株中,DXS的附加表达式(∆dr0862P-I-D)增加非甲戊酸途径的通量,导致蒎烯效价(2.6 mg/L)小幅但显著增加。

以往的报道表明,蒎烯合成酶和GPP合成酶融合形式的表达导致了蒎烯产量的增加大肠杆菌,在c端含有蒎烯合酶的融合形式使滴度提高了6倍[188 app ].我们构建了包含答:茅蒎烯合酶(N端或C端)和大肠杆菌GPP合成酶。然后我们测试了融合蛋白在dr0862突变体过表达DXS(∆dr0862P:我和∆dr0862两种融合蛋白都是活性的(至少在蒎烯合酶活性方面)大肠杆菌,含有C末端蒎烯合酶的变体(∆dr0862I:P-D)表现最好,但并未导致蒎烯滴度的进一步提高。

为了初步评估工程菌株,我们使用了一种富含甘油的培养基。为了排除甘油是一种劣质底物的可能性,我们比较了甘油被葡萄糖或甘油和葡萄糖混合的各种介质中的生长和蒎烯的产生(图)。188 app ).这表明在培养基中甘油比葡萄糖支持更高的蒎烯滴度。

图4
装具

一个增长和b蒎烯的生产耐辐射奇球菌的在葡萄糖和甘油补充的培养基中。耐辐射奇球菌的在含有5 g葡萄糖、5 g甘油(各2.5 g)的丰富培养基中,在30°C摇瓶中培养72 h。所有的实验都是生物学上的三组重复

植物对蒎烯的抗性和降解耐辐射奇球菌的

先前的研究表明,蒎烯对真菌和细菌有毒。蒎烯对各种物种(如新型隐球菌(0.12 g / L),白色念珠菌(3.12 g / L),耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(4.15 g / L)棒状杆菌属glutamicum(< 2.5 g/L),表明该单萜对微生物具有较高的毒性[188 app 188 app 188 app ]另一方面,据报道,蒎烯毒性是微生物细胞工厂生产蒎烯的主要问题之一[188bet亚洲体育平台188 app ].此外,通过外排泵的过度表达来增强蒎烯抗性大肠杆菌该菌株中的突变通过以下方式提高了蒎烯的产量:大肠杆菌188 app ].

考虑到蒎烯生产将受到影响,由于其毒性作用的可能性,我们发现它的相关调查在蒎烯公差耐辐射奇球菌的dr0862P-I-D压力。这是通过在浓度为1 - 5 g/L的蒎烯异构体培养基中添加外源性的蒎烯异构体完成的。我们也评估大肠杆菌在相同的培养基中培养EcpsB菌株,以比较菌株对蒎烯的抗性。生长48 h后,蒎烯对细胞的影响最明显的是延长了延迟期。耐辐射奇球菌的显示出对α蒎烯的高电阻,和生长仅轻度在最高测试浓度(5克/升)的影响。相比之下,大肠杆菌即使在最低浓度(1 g/L)下,EcpsB菌株也受到强烈的影响,滞后时间延长了14 h。对两种菌株,β-蒎烯毒性更强。在的情况下耐辐射奇球菌的,在1 g/L时滞后期略有增加,在5 g/L时滞后期增加12 h。为大肠杆菌当β-蒎烯浓度较低时,β-蒎烯的滞后期增加(略高于α-蒎烯),当浓度为2.5 g/L时,β-蒎烯的生长完全受到抑制。188 app ).

图5
figure5

植物对蒎烯的抗性D.抗辐射剂∆博士0862 P-I-D和大肠杆菌EcpsB菌株。菌株在含不同浓度的富培养基中生长一个α蒎烯(∆dr0862PID应变),bβ蒎烯(∆dr0862PID应变),cα蒎烯(大肠杆菌EcpsB应变),dβ蒎烯(大肠杆菌在微量滴定板中跟踪EcpsB菌株)48小时。显示了不同蒎烯浓度下的生长曲线。实验是用三个生物复制品进行的

然而,研究结果表明耐辐射奇球菌的对α-和β-蒎烯具有较高的耐受性。从耐受性数据可以明显地看出,松香产生的蒎烯量耐辐射奇球菌的dr0862P-I-D菌株远低于抑制浓度,因此不太可能对蒎烯的生产产生负面影响大肠杆菌蒎烯生产菌株,对蒎烯的敏感性高于耐辐射奇球菌的.在之前的研究中,Sarria等人报道说大肠杆菌显示出对低于4.3 g/L的α-蒎烯浓度的抗性,而β-蒎烯(高达10 g/L)对其生长没有影响。相反,我们的结果表明,α-蒎烯和β-蒎烯均抑制其生长大肠杆菌EcpsB。造成这种差异的原因目前尚不清楚,但可能与生长条件的差异有关。

单萜烯分子对细胞有不同的作用,可引起毒性影响,其中包括抑制酶活性、防止生物膜形成、降低哺乳动物细胞线粒体活性[188 app ,膜流化变化[188 app 都得到了很好的研究。根据单萜对不同细胞的毒性作用机制,探讨了多种蛋白质的保护和抗应激机制耐辐射奇球菌的再加上其膜和细胞壁的特殊多层结构可能是观察到的更高的耐受性的原因[188 app ].

为了排除蒎烯在细胞内代谢的可能性,我们进行了长期发酵实验(120 h),其中α-和β-蒎烯添加到细胞中耐辐射奇球菌的生长介质。由于在整个实验中测定的蒎烯量与对照样品几乎相同,没有接种耐辐射奇球菌的,我们得出蒎烯不被代谢的结论(附加文件188 app :图S2)。

此外,为了研究蒎烯在细胞中积累的可能性,我们在十二烷中发酵后重新悬浮生物量,并通过超声波作用破坏细胞。样品的GC-FID分析不允许检测到蒎烯,表明大部分或全部生成的蒎烯转移到细胞外培养基中。

在最小甘油培养基中生产蒎烯

接下来,我们想评估是否可以在以甘油为主要碳源的最小介质中产生蒎烯。为此,我们制作了含有25 g/L甘油的最小培养基,该培养基不含蛋白胨和酵母提取物的复杂碳源。在此培养基中,得到产蒎烯最好的菌株耐辐射奇球菌的dr0862P-I-D产蒎烯3.2 mg/L,甘油产率为0.13±0.04 mg/g, 72 h摇瓶产率为45µg /h188 app ).此外,我们在最低培养基中测试了不同浓度的甘油(10、15和25 g/L),以评估蒎烯产量对培养基中甘油浓度的依赖性(图)。188 app ).

图6
figure6

不同浓度的甘油在最小甘油培养基中产生蒎烯耐辐射奇球菌的dr0862P-I-D

在这种情况下,我们观察到较低的搅拌速度和较高的十二烷百分比(20%而不是10%)对于优化发酵中的蒎烯生产和提取是必要的(附加文件188 app :图S3)。多年来,使用甘油作为发酵碳的主要来源一直是一个有吸引力的场所,而且不同分子的生产,如1-丙醇[188 app ],γ-松油烯[188 app ],柠檬烯[188 app 和各种酶[188 app 已经报道过利用细胞工厂从甘油中提取甘油。关于耐辐射奇球菌的,据我们所知,这是第一份描述使用基于甘油的最低培养基(不含蛋白质来源和酵母提取物)的报告,我们的结果显示使用该细菌从甘油生长和生产萜烯分子的潜力。

蒎烯生产耐辐射奇球菌的大肠杆菌

在这项研究中,我们报告了在摇瓶培养的最低甘油培养基中,通过以下方法获得的3.2 mg/l蒎烯的最大产量:耐辐射奇球菌的.在以往的蒎烯生产研究中,Kang等188 app 能构造一个c . glutamicum菌株由GPP合酶、蒎烯合酶表达而来答:茅正过表达dx二磷酸异戊烯异构酶。这个工程c . glutamicum菌株可产生0.177 mg/L的蒎烯。在最近的一篇关于蒎烯生产的报道中,吴晓敏等人188 app 设计一个Rhodobacter sphaeroides产蒎烯的菌株。GPP合成酶和蒎烯合成酶融合蛋白在大肠杆菌中的表达r . sphaeroides结果表明,该菌株的蒎烯含量为0.098 mg/L,修饰次数多,产量为0.5 mg/L。这些蒎烯生成效价表明耐辐射奇球菌的可能是生产蒎烯的合适宿主。然而,在本研究中获得的滴度低于在高度工程化的实验室中获得的最高滴度大肠杆菌应变(166.5 mg / L)。此蒎烯生产效价为大肠杆菌菌株经多次操作和诱变获得(表188 app ).为了解决有无问题耐辐射奇球菌的是否天生就是生产蒎烯更好的宿主大肠杆菌,我们构建了一个更基本的大肠杆菌生产菌株,可以媲美我们最好的基因构成耐辐射奇球菌的生产菌株(∆dr0862P-I-D),只表达蒎烯合成酶和甲戊酸途径酿酒酵母.这大肠杆菌在相同的条件下对该菌株进行了蒎烯生产评价耐辐射奇球菌的菌株大肠杆菌该菌株在富甘油培养基和最低甘油培养基中分别产生0.9 mg/L和0.65 mg/L蒎烯。这两个数量比在培养基中观察到的最高滴度低2.9倍和4.9倍耐辐射奇球菌的.虽然这当然是一个人为的比较,但它确实支持耐辐射奇球菌的可能是生产单萜(如蒎烯)的有用宿主生物(表188 app ).

表3生产蒎烯的微生物工程菌株

耐辐射杜兰菌只产生β-蒎烯异构体

答:茅蒎烯合成酶在大肠杆菌,它导致了生产蒎烯的异构体的混合物(42%的α-和58%β蒎烯)[188 app ].相反,当我们表达了这种蒎烯合酶耐辐射奇球菌的质粒,我们专门观察了β-蒎烯的形成(附加文件188 app :图S4)。此前有报道称,蒎烯合酶与大肠杆菌GPP合酶允许两种异构体以50:50的比例产生大肠杆菌188 app ].另外,对于这个融合蛋白(∆dr0862I:P-D),我们只观察到β-蒎烯的产生耐辐射奇球菌的这可能表明耐辐射奇球菌的可能改变蒎烯合成酶的行为,导致β-蒎烯的独家生产。

视角

在这项研究中,我们证明了这一点耐辐射奇球菌的可以通过基因工程生产蒎烯。这种细菌对有毒分子、各种压力源的高抗性,以及它在各种碳源上生长的能力,可以使耐辐射奇球菌的适合生产蒎烯的候选原料。这种生产装置将通过利用木质纤维素化合物和有营养的城市/工业废料生产出有价值的第二代生物燃料。然而,为了使这在经济上可行,有必要进一步发展耐辐射奇球菌的蒎烯生产菌株。可能的策略包括评估替代的GPP合成酶或其突变体,以防止FPP副反应,使用突变技术,蒎烯运输修饰,微调细胞中的蛋白质水平和氧化还原平衡。此外,还应评估优化甲戊酸途径、增强上游途径以及在生产过程中优化生长条件的潜力。研究表明,高密度培养用于类胡萝卜素的生产耐辐射奇球菌的能显著提高萜烯分子的产量[188 app 188 app ,这种方法也可用于蒎烯的生产。

结论

据我们所知,本研究是第一次报道单萜生产耐辐射奇球菌的使用最小的甘油培养基。通过灭活八烯合酶和表达答:茅蒎烯合酶,大肠杆菌在摇瓶培养的最低培养基中,GPP合酶和过度表达DXS,3.2 mg/L蒎烯,产率为0.13 mg蒎烯/g甘油,产率为45µg蒎烯/h。在类似的设置中大肠杆菌EcpsB菌株产0.65 mg/L蒎烯,产0.026 mg/ g甘油。我们的研究结果显示了应用的潜力耐辐射奇球菌的作为生产蒎烯的细胞工厂。

可用性数据和材料

本研究中生成或分析的所有数据均包含在本文及其附加文件中。

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下载参考

致谢

我们感谢Aaron John Christian Andersen,丹麦技术大学生物技术和生物医学系代谢组学核心经理,感谢他在GC-MS分析方面的帮助。

资金

这项工作得到了诺和诺德基金会(NNF10CC1016517)对IM的资助。

作者信息

从属关系

作者

贡献

SHH设计并完成了所有实验。SHH, CJ, IM, HM, MB分析数据。嘘,CJ写了手稿。IM编辑了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

写给Mandana Bebahani的信件。

道德声明

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称,这项研究是在没有任何商业或财务关系的情况下进行的,这些关系可以被解释为潜在的竞争利益。

额外的信息

出版说明

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

补充信息

附加文件1:表S1

.用于载体构建和实时PCR的寡核苷酸列表。图S1.蒎烯合成酶基因密码子序列的优化耐辐射奇球菌的质粒中。图S2.蒎烯降解或消耗耐辐射奇球菌的在120 h。耐辐射奇球菌的在添加了20 mg/L蒎烯异构体的培养基中生长,120 h后用GC-FID对残留的蒎烯进行定量。未接种的蒎烯补充培养基作为对照。图S3.使用不同浓度十二烷(10%和20%)的影响一个在富人和b最小甘油介质和各种搅拌速度(70、100、180、250转/分)对蒎烯生产的影响耐辐射奇球菌的dr0862P-I-D图S4。GC-FID色谱图。一个α-蒎烯标准品,bbeta-pinene标准,cβ-蒎烯生产由耐辐射奇球菌的,d-蒎烯和-蒎烯的生产大肠杆菌.图S5。蒎烯合成酶的表达大肠杆菌不同浓度IPTG对EcpsB的影响。诱导4小时后SDS-PAGE。

权利和权限

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Helalat, s.h., Jers, C, Bebahani, M。et al。代谢工程耐辐射球菌用于从甘油生产蒎烯。活细胞的事实20.187 (2021). https://doi.org/10.1186/s12934-021-01674-4

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关键字

  • 蒎烯
  • 生物燃料
  • 耐辐射球菌R1
  • 代谢工程
  • 单萜
  • 甘油