跳到主要内容

酶法生产呋喃甲酸积木的工艺参数优化

摘要

背景

2,5-呋喃二甲酸(FDCA)是绿色塑料的前体,因为其结构与对苯二甲酸相似,对苯二甲酸是油衍生聚合物的常见前体,并且可能从植物生物质中获得的糖中产生。羟甲基糠醛氧化酶(HMFO)据报道,由于它可以将生物基5-羟甲基糠醛(HMF)转化为FDCA构建块,因此是一种很有前途的FDCA生产生物催化剂。这种三步氧化反应通过二甲酰基呋喃和2,5-甲酰基呋喃甲酸(FFCA)发生中间体。已经为开发HMFO变体做出了一些努力,通过提高其对反应中间体的活性来提高FDCA产量。但是,对于操作条件如何影响这些酶反应,仍有有限的见解。最佳反应条件的设置将使和潜在的问题,阻碍有效的工业化生产这种生物塑料前体使用HMFO作为生物催化剂。

结果

在本工作中,影响性能的几个参数Methylovorussp HMFO氧化HMF的野生型酶分析,其V367R和W466F单变异,V367R/W466F双变异,I73V/H74Y/G356H/V367R/T414K/A419Y/A435E/W466F (8BxHMFO)八元组变异。结果表明,HMFO酶对HMF的氧化受pH的影响很大,不同的改良变种的最适pH值不同。此外,酶在高过氧化氢浓度下不稳定,它们的活性被FFCA中间体以ph依赖性的方式抑制。通过向反应介质中添加过氧化氢酶,去除氧化过程中形成的过氧化氢,并控制底物的用量,限制反应中累积的FFCA的数量,可以有效地克服这些限制。野生型HMFO及其变体对pH、过氧化氢和FFCA的不同行为,强调了将每种变体作为一种具有其自身操作条件的单独酶来考虑最终工业化fca生产的重要性。

结论

这项工作提供了那些参数的信息,这些参数决定了HMFO的高产量FDCA。通过使用最稳定的酶在最适宜的pH值下氧化HMF,用过氧化氢酶去除过氧化物,通过控制底物和/或酶浓度来避免FFCA积累,这些因素的解决使得fca的产量得以提高。上述研究结果将有助于规划这些转换的未来规模,并将为HMFO变型的设计提供新的观点,在HMF转换为FDCA期间提供更有效的性能。

背景

2017年的一项全球分析估计,石化行业生产的原始塑料总量超过8亿吨[1.].这种生产产生了大量不可再生化石资源的温室气体排放,由于回收利用有限,造成了土地和水污染。因此,用从可再生原料中提取的可生物降解聚合物取代这些油基塑料是可持续生物经济发展的必要条件[2.].最具前景的生物基塑料聚合物之一是聚(乙烯-2,5-呋喃二甲酸酯)(PEF) [3.,4.].PEF可以作为传统聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)的绿色替代品,因为它具有相似甚至更好的性能[5.,6.].PEF的兴趣在于其组合物,因为它是通过使用可再生结构块2,5-呋喃二羧酸(FDCA)酯化的乙二醇形成,其可以从衍生自木质纤维素生物量的糖中获得[7.,8.].

从木质纤维素原料生产FDCA的过程通常包括两个步骤。首先,从植物多糖中提取的单糖(通常是果糖)被脱水,形成平台化学5-羟甲基糠醛(HMF)。其次,HMF通过其醇和醛基团的连续三个氧化步骤转化为FDCA,首先分别生成二甲酰呋喃(DFF)或羟甲基呋喃羧酸(HMFCA),然后生成甲酰呋喃羧酸(FFCA)作为反应中间体(图)。1.) [9,10].对于HMF转化为FDCA的不同化学方法已经进行了描述,然而,它们通常会导致低产量和选择性,并且需要高温和压力,以及使用金属盐和有机溶剂,这使得该过程昂贵和污染[11,12].因此,在绿色工业的背景下,这些过程的生物催化替代品是非常有趣的,因为反应可以在环境友好的条件下使用温和的和生物可降解的催化剂[13].

图1
图1

5-羟甲基糠醛(HMF)转化为2,5-呋喃甲酸(FDCA)。可能的路线,通过2,5-二甲酰呋喃(DFF)或2,5-羟基甲基呋喃羧酸(HMFCA)中间体,以获得2,5-甲酰呋喃羧酸(FFCA)和FDCA。羟甲基糠醛氧化酶(HMFO)和芳基醇氧化酶(AAO)催化的反应用满箭头表示。AAO与过氧化氢酶结合(分解H2.O2.在反应中产生的)也显示了[25

已经对使用酶催化和全细胞催化的FDCA生产进行了各种研究[8.,14,15].为此,人们提出了几种氧化酶用于从HMF中生产FDCA。然而,由于大多数都局限于醛或醇氧化,通常需要多酶级联反应来完成反应[16,17,18,19,20.,21,22].这往往限制了整个过程的产量,因为需要在每一种酶的操作条件之间建立共识。到目前为止,只有两种酶类型——羟甲基糠醛氧化酶(HMFO)Methylovorussp MP688 [23] 和假单胞菌物种(24和芳醇氧化酶(AAO)侧耳属eryngii25已经报道了将HMF转化为FDCA的三个氧化步骤。这两种酶都是葡萄糖-甲醇-胆碱氧化酶/脱氢酶(GMC)超家族中含有fad的酶[26对伯芳醇和水合芳醛均有活性。由于它们对醇底物的偏好,它们通过DFF和FFCA中间体将HMF氧化成FDCA(图)。1.).然而,与AAO相比,HMFO在工业化生产FDCA方面具有一些优势。首先,细菌的HMFO很容易过度表达大肠杆菌以可溶的活性形式存在的[24,27相比之下,真菌中的AAO通常是作为包涵体产生的大肠杆菌因此需要体外激活[28(一个耗费时间和金钱的过程)。然而,可溶性产物p . eryngii与使用Komagataella pastoris(syn。毕赤酵母属pastoris)已于最近报道[29,尽管还需要更详细地分析其高糖基化对糠醛氧化的影响。其次,FFCA的氧化是HMF酶法生产FDCA的限制步骤,对HMFO来说更有效,因为AAO氧化FFCA需要较长的反应时间,且被H高度抑制2.O2.25].此外,最近已采用一种具有成本效益的生物反应器工艺扩大HMFO的生产[30.在考虑将其作为生物催化剂进行工业应用时,这是一个关键因素。

由于其在FDCA生产、活性位点的结构和诱变研究方面的应用前景广阔MethylovorusDijkman等人的HMFO31研究发现,V367R、W466F和V367R/W466F的变体可以作为改进的生物催化剂。这些工程酶比野生型(WT)酶能更快地氧化FFCA (HMF转化的限速反应)。此外,在后续的研究中,结合计算预测和基因重组方法,设计了具有8个突变(I73V/H74Y/G356H/V367R/T414K/A419Y/A435E/W466F)的多变体(8BxHMFO),作为催化过程中更健壮、更稳定的酶[32].然而,关于HMF氧化成FDCA的操作条件(使用上述HMFO WT和衍生变体)的研究很少,在将其作为工业生物催化剂之前,需要重点分析它们在这些转化过程中的行为。

在这项工作中,综合研究了不同的参数,可以影响性能MethylovorusHMFO在从HMF生产FDCA中已经进行了HMFO WT及其V367R、W466F、V367R/W466F和8BxHMFO变种。因此,我们评价了pH对酶稳定性和活性的影响,反应产物和副产物的抑制作用,底物初始浓度,辅因子依赖性,以及氧反应活性。这可以优化每种酶变体的操作条件,并使最相关的候选酶在工业化规模的FDCA生产中的应用更接近。获得的信息将为HMFO型酶的未来研究提供有用的见解,也将有助于开发新的HMFO变体,以增强HMF的FDCA生产。

结果和讨论

pH对FDCA生产的影响

首先,在pH 6.5–9.0范围内培养72小时后,通过测量酶的剩余活性(在标准底物香草醇上)来分析酶的pH稳定性(图。2.A) since it has reported thatMethylovorus酶和其他HMFOs在超出此范围24小时后完全失去活性[24].HMFO WT和8BxHMFO在整个pH范围内保持稳定,保持其初始活性的70–80%。V367R保留~ 其80%的活性在pH 6.5和8.0之间,以及~ pH值为9.0时为40%。在W466F和V367R/W466F变体中观察到类似的行为,因为它们在pH值7.5–8.0时保持更高的活性,但在pH值9.0时失去了大部分活性。V367R/W466F变体表现出特别不稳定,因为它丢失> 在所有测试的pH值下,其活性的50%。

图2
figure2

pH的影响(一个)和H2.O2.(b)对HMFO稳定性的影响,以及pH对HMF生产FDCA的影响(c)及FFCA (d).一个在25°C条件下,酶在100 mM B&R缓冲液(pH 6.5-9)中孵育72小时后,剩余活性显示pH稳定性。bH2.O2.随着H的增加,72 H后酶的残留活性显示出稳定性2.O2.(0-30毫米)在50毫米Tris/HCl, pH 7.5。以香草醇为底物,测定了其活性。中FDCA的百分比(指初始底物浓度)cd在HMF或FFCA的24-H反应后显示出HMFO WT和变体(4-H与8bxHMFO)的反应,不同pH值。在28℃和180rpm振荡,使用1.5mM基材和2.5μm酶,50mM NaPi(pH6.5)或Tris / HCl(pH7.5,8.0和9.0),在28℃和180rpm振荡中进行反应。显示了三次重复实验的平均值和标准偏差值

最近报道了WT HMFO生产FDCA对pH值的高度依赖性[24].因此,我们在这里对不同的变异进行了评估。为此目的,在28°C条件下,在50 mM NaPi (pH 6.5)或50 mM Tris/HCl (pH 7.5-9.0)条件下进行24小时酶解反应,并在24小时后通过高效液相色谱(HPLC)分析1.5 mM HMF或FFCA的生产(图)。2.分别是C和d)。对于8BxHMFO变体,考虑4 h反应后的产率,因为在24 h时,在所有pH值下都观察到总转化率。HMFO WT生产FDCA的最佳pH值为6.5。令人惊讶的是,所有HMFO变体都将这一最优pH值转移到8.0-9.0,以氧化两种底物。在HMF和FFCA转换过程中观察到最大半衰期的pH值1.)与pH值一致,在pH值下,每种酶在24小时反应中获得最高的FDCA产率(图)。2.c和d)。

表1不同pH值下,HMF和FFCA (1.5 mM)在48小时反应生成FDCA过程中HMFO WT和变体(2.5µM)的半衰期(h)

H的影响2.O2.FDCA生产的副产品

在HMF氧化成FDCA的过程中,氢的三等价物2.O2.是由HMFO产生的,因为反应是通过两个糠醛中间体进行的(图)。1.).因此,另一个需要考虑的方面是H2.O2.会影响酶的稳定性或反应本身。

来研究H2.O2.HMFO WT及其变体在0-30 mM h中孵育72 h2.O2.在pH为7.5的Tris/HCl溶液中,在25℃下,用香草醇测定它们的残留活性(图2)。2.b).所有酶均受H2.O2.W466F和V367R/W466F突变体在所有H位点上保留了< 20%的初始活性2.O2.浓度化验。与此相反,8BxHMFO多重变异在整个H中保持了至少50%的活性2.O2.范围,而HMFO WT和V367R变体的活动始终低于50%2.O2.浓度高于3mm。

为了消除H2.O2.关于FFCA氧化反应的报告,如AAO [25,在1.5-18 mM h存在的48小时内评估HMFO WT从FFCA生产的FDCA2.O2.(附加文件1.:图S1)。然而,与没有外部H的FDCA相比,没有明显的差异2.O2..H2.O2.通过添加过氧化氢酶来去除催化过程中产生的酶,以增加酶的稳定性。过氧化氢酶的作用在低底物浓度(~ 1.5 mM)下比较温和,但在较高的HMF浓度下更相关,如下所述。

H2.O2.用AmplexRed®/辣根过氧化物酶(HRP)偶联测定HMFO与FFCA反应产生的含量,并与HPLC测定的FDCA含量进行比较(图)。3.).结果表明,fca和H的化学计量量2.O2.结果表明,HMFO氧化FFCA的反应发生在H2.O2.释放。这与AAO较慢的催化反应形成了对比,因为缺少H2.O2.的形成,被认为是通过单加氧酶型机制发生的[25].这一差异使得HMFO氧化FFCA的效率高于AAO,而AAO需要更长的反应时间。

图3
图3

H的比较2.O2.以及HMFO氧化FFCA过程中产生的FDCA。反应在28°C, 50 mM Tris/HCl, pH 7.5, FFCA (1.5 mM)和HMFO WT(2.5µM)之间进行。产品,FDCA和H2.O2.,分别用HPLC和AmplexRed/HRP法分离反应混合物后定量。平均值和标准偏差值显示

FFCA中间体对FDCA生产的影响

虽然HMFO能够将HMF氧化成FDCA,但其对FFCA的较低活性限制了整个反应的效率[23,24].为了取代对产物形成的反应,我们评估了增加HMF或FFCA的数量对HMFO WT生产FDCA的影响(图)。4.分别是A和b)。在最高底物浓度(15 mM)下,HMF的FDCA产率急剧下降。随着FFCA含量的增加,观察到类似的抑制作用,这表明反应受到了这种反应中间体的抑制。在过氧化氢酶存在的情况下,随着底物浓度的增加,可以观察到相同的抑制效果,尽管有更高的FDCA产率,在6 mM HMF时达到最高(图)。4.一个)。

图4
装具

由不同HMF (一个)及FFCA (b)浓度和过氧化氢酶效应。在没有或存在过氧化氢酶的情况下,HMFO WT (2.5 μ M)通过增加HMF(左)和FFCA(右)浓度(1.5-15 mM)产生FDCA。反应(48小时)在50 mM Tris/HCl中进行,pH为7.5,温度为28℃。平均值和标准偏差值显示

用AmplexRed®/HRP连续测定HMF和DFF氧化的稳态动力学。所有变体的饱和剖面被这两种基质丢弃了任何抑制作用(附加文件1.:图S2和表S1)。然而,由于FFCA在底物上的活性要低得多,因此需要一种终点法来分析FFCA氧化的动力学。由于FFCA的FDCA产率的重要差异取决于pH值,因此这些动力学测量是在pH值6.0到9.0之间进行的,并添加过量的过氧化氢酶以确保酶的稳定性。HMFO WT处理48小时后停止反应,改进HMFO变种处理30分钟后停止反应,并通过HPLC对形成的FDCA进行定量(图)。5.).两种HMFO WT及其变体均显示出强烈的抑制作用,令人惊讶的是,这种抑制作用高度依赖于ph值。为了更好地了解这种抑制作用,在添加FFCA(时间0 h)和48 h后停止反应之前,测量了(用香草醇)HMFO WT的残留活性。在动力学曲线中使用的不同底物浓度(附加文件1.图S3a和b)。结果表明,在检测到抑制的FFCA浓度下,从酶和FFCA放在一起的那一刻起,酶的活性就失去了。为了了解这种抑制是否可以恢复,将酶与15 mM FFCA孵育5分钟后,在50 mM Tris/HCl中透析过夜,pH为7.5。然而,所有酶都没有活性(数据未显示),表明FFCA的抑制是不可逆的。这些数据表明FFCA会在活性位点或通路上结合,阻止酶在后续的催化循环中发挥作用。

图5
figure5

pH对HMFO WT及其变体氧化FFCA动力学曲线的影响。反应率(v/[Ez]为每摩尔酶每时间所产产物的摩尔数,以分钟为单位−1在50 mM NaPi (pH 6.0-6.5)或Tris/HCl (pH 7.0-9.0)条件下,在25℃,过氧化氢酶存在的情况下,HMFO WT及其V367R、W466F、V367R/W466F和8BxHMFO变异随FFCA含量的增加而得到。分别在48小时和30分钟内对HMFO WT和变体进行FDCA生产定量

由于在不同pH值下观察到的高抑制(图。5.),只能计算每种酶和pH的表观动力学常数(表2.).HMFO WT在pH 6.0和pH 7.0-8.0范围内的催化效率最高。对于所有的酶,当动力学在更碱性的pH下进行时,抑制发生在更高的底物浓度,而且,8BxHMFO在任何pH下都比V367R/W466F和其他变体表现出更好的催化效率。FFCA的这种pH依赖的抑制与长期HMF和FFCA反应中在不同pH值下观察到的效率是一致的(图)。2.c和d),当酶的FFCA抑制作用较弱时(在观察到的表观效率最高的pH范围内),是这些转化的最佳pH值。

表2表观催化效率(k/K,毫米−1最小值−1在不同pH值下,HMFO WT和变体对FFCA的氧化

的影响啊2.集中于FDCA的生产

FFCA的高酶抑制阻止了饱和HMF浓度下的反应评价。然而,我们能够评估氧饱和度(氧化酶所需的第二个底物)对HMFO WT及其变体产生FDCA的影响。为此,将酶与6 mM HMF和过量过氧化氢酶在28°C下混合,用O2.,对应1.22 mM浓度[33,并将FDCA的产率与使用大气O2.,对应于0.25mm的浓度,48-H反应后(附加文件1.:无花果S4a)。虽然在HMFO WT的情况下,在高氧时观察到一些改善2.浓度,对于HMFO变体,更有效的FFCA氧化,在这两种条件下得到了相似的结果。这表明当前的反应在大气氧下已经饱和2..尽管如此,通过增加o来获得额外的改进能够使用更高的衬底浓度,用于缩放过程的重要点,可以获得缩放过程。2.向反应介质扩散。在这个意义上,连续流动微反应器技术被报道为一种安全且可扩展的氧化反应方法[34,35和不同的反应器设计,如简单的流动反应器,管中反应器,搅拌管反应器和连续搅拌槽反应器2.-依赖的酶,其氧转移速率高于批量反应[36,37,38,39,40].

添加FAD对FDCA生产的影响

有研究表明,在HMFO WT反应中加入FAD可以获得更高的FDCA产率[23]以防止辅因子解离使酶最终失活。虽然这一效应是基于在20µM FAD存在的情况下,4 mM HMF(和20µM HMFO) 24小时反应中95%的FDCA收率得出的,但该研究缺少不含FAD的对照(4 mM HMF和20 μM HMFO)来证明这一效应。因此,为了确认/抛弃FAD的积极作用,我们在pH 6.5 50 mM NaPi下对HMFO WT和pH 8.0 Tris/HCl变体进行了HMF (6 mM)与20 μM FAD或不含FAD的反应。FDCA的产量和酶的残余活性(使半衰期,t1/2随访48 h3.和额外的文件1.:图S4b)。HMFO WT和V367R没有观察到差异,而在W166F突变的突变体上添加FAD时,观察到轻微增加(8BxHMFO为1.1倍,W466F和V367R/W466F为1.5倍)。由于FFCA氧化的效率在没有和有FAD的情况下是相似的(附加文件1.:表S2)辅因子的轻微影响可以归因于当添加FAD时这些变体的稳定性更高(半衰期比没有辅因子时高1.2 - 1.5倍)。这些结果对于含有W466突变的变异是有意义的,因为这个残基接近黄素环,它的去除会影响蛋白质的稳定性[31].

表3 FAD或/和过氧化氢酶对催化性能参数的影响- fdca浓度(mM)和产率(%),酶半衰期(t1/2)和总营业额(TTN)——用于HMFO WT和变体从HMF (6 mM)生产FDCA

无论如何,有必要说明的是,FAD的效果远低于添加过氧化氢酶的效果(表1)3.和额外的文件1.:图S4b)。H的去除2.O2.对所有酶的稳定性和FDCA产量都有积极的影响。大多数突变体的半衰期提高了1.5 - 3倍,W466F高达9倍,而HMFO WT和V367R和8BxHMFO突变体的半衰期显著提高。在这些条件下,变种V367R和8BxHMFO在反应48小时后,6mm HMF完全转化为FDCA。此外,尽管添加过氧化氢酶和FAD增加了所有酶的半衰期,但只有HMFO WT的FDCA产量增加(而其变体的FDCA产量与仅添加过氧化氢酶时观察到的相似)。最后,经确认,在HMF对照组中,添加或不添加过氧化氢酶或FAD时,只产生微量的HMFCA(< 1%),不包括氧化糠醛的过氧化氢酶或FAD的任何活性(附加文件)1.:图S5)。

优化了FDCA生产条件

综合以上结果,对HMFO酶生产FDCA的条件进行了优化。在分析的变异体中,V367R和8BxHMFO最适合该工艺的可扩展性,因为它们具有更高的稳定性和更好的性能。反应在pH 8.0 (50 mM Tris/HCl)下进行,因为这是这些变体生产FDCA的最佳pH值(图。2.).通过添加过量的过氧化氢酶,酶的稳定性得到了保证,在这些条件下,酶的半衰期更高(见表)3.).不包括增加海地武装部队,因为如上文所示,福利无关紧要,而且辅助因素的高昂费用限制了其用于工业应用。

考虑到之前实验中使用的底物浓度相对较低,我们探索了增加HMF浓度(最高可达12 mM,因为更高浓度的FFCA积累会导致酶抑制,图。5.).然而,尽管使用更高的HMF浓度,但在反应6天后,最终的FDCA产物的FDCA产物的最终量差异达到<7.5mm的FDCA1.:图S6a)。此外,在这些条件下,酶的稳定性随着时间的推移而急剧下降4.和额外的文件1.:图S6b)。

表4催化性能参数-FDCA浓度(mm)和产率(%),残余活性和总转产率(TTN) - 对于从6-12mm HMF的FDCA的产生(包括6 mm初始后6 mm重新用量浓度)通过V367R和8BXHMFO变体

因此,利用V367R和8BxHMFO在与6 mM HMF反应结束时的高残留活性,我们决定在2天后第一次转化完成时,在反应中补充额外的6 mM HMF和过量的过氧化氢酶(图)。6.a).通过这种方式,在6天内获得了近10 mM的FDCA,总营业额(TTN)超过1.1万(见表)4.).由于FFCA在这些条件下的积累会导致酶失活限制最终产物的浓度,因此测定了较低的酶剂量(1.25µM)(图1)。6.b).在这些条件下,预计FFCA的产生会较慢,且积累较少,导致更多的酶能够完成转化,直到FDCA。用这个量的酶,在反应4天后再添加底物和过氧化氢酶,不再观察到转化率。通过这种方法,在酶失活前的第12天获得了近12 mM的FDCA, 8BxHMFO和V367R变异株的TTN值分别为26,000和27,000(表1)4.).因此,利用这两种变体在优化条件下的高稳定性,我们能够通过重新添加底物来克服中间产物FFCA的抑制,使fca的产量翻倍。通过应用这些反应条件,FDCA的产率≥90%,便于下游程序获得纯的FDCA。然而,为了在工业相关条件下对产品净化进行更现实的评价,进一步的反应升级是必要的。

图6
figure6

使用两种不同的V367R和8BxHMFO剂量优化HMF转换。一个与2.5 μ M酶反应,2h后再加HMF/过氧化氢酶。b通过降低酶剂量(至1.25 μ M)来提高FDCA产量,并在4天后再加HMF/过氧化氢酶。在50 mM Tris/HCl中,pH 8.0,过氧化氢酶存在的情况下,HMF (6 mM浓度,2或4天后再加6 mM添加)与V367R(黑色)和8BxHMFO(红色)的变体进行反应,显示了FDCA的产量(品系)和残余酶活性(折线)。采用高效液相色谱法对FDCA生产进行定量,用香香草醇在50 mM Tris/HCl, pH 7.5中测定残留活性。显示了三次重复实验的平均值和标准偏差值

结论

工业过程中的生物催化剂必须满足特定的特性,以确保产生的生物过程的可行性和适用性。如酶稳定性、辅因子需求、反应条件和底物范围等方面必须为工业应用进行优化[41.].在这里,我们已经确定了HMFO的几个局限性,可以阻止从HMF有效地生产FDCA,例如在高浓度H2.O2.,对FFCA中间体的强烈抑制。然而,通过向反应混合物中加入过氧化氢酶并控制底物的剂量,可以克服来自HMF的FDCA的酶促产生的上述限制。其他方面,如o2.扩散到反应介质中对于进一步优化这些过程也很重要。在工业环境中使用HMFO变体时,应考虑上述发现。它们还将为其他HMFOs的表征以及开发新的变体铺平道路,使HMF能够更高效地生产FDCA。

材料和方法

化学品

HMF由AVA Biochem提供。DFF、FDCA、FAD、过氧化氢酶、HRP、香草醇购自Sigma Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)。FFCA购自TCI美国公司(美国波特兰)。AmplexRed®从Invitrogen(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)获得。

基因、质粒和定点突变

编码HMFO的基因MethylovorusSP MP688(NCBI登录号WP_013440946)由ATG Biosynthethic(Merzhausen,Germany)合成,然后亚克隆到PET23B(+)质粒(Novagen)中。使用PET23B-HMFO质粒作为模板,通过全质粒PCR进行HMFO的简单变体。向前和反向引物设计与含有所需突变的DNA区域的相对股线互补。前向合成引物(取代核苷酸的粗体粗糙,含有突变的三重态)的序列为5'-GCA AGC GCT资本利得税TTC TGG GTG AAC AAG C-3'用于V367R和5'-C GTC GGC GGT GTTTTT.CAT GCG AG-3'用于W466F。V367R/W466F以V367R变体为模板,采用W466F引物。模板DNA与Dpn我(罗氏)。大肠杆菌将质粒通过热休克转化DH5α细胞。质粒纯化从大肠杆菌使用高纯质粒分离试剂盒(Roche)在100µg/mL的LB氨苄西林中培养DH5α。ATG生物合成公司(Merzhausen,德国)合成了含有突变I73V、H74Y、G356K、V367R、T414K、A419Y、A435E和W466F的八联HMFO变体(8BxHMFO),并将其亚克隆到pET23b(+)质粒(Novagen)中.通过测序证实了突变的引入。

HMFOs的酶的产生和纯化

将构建的质粒转化表达重组蛋白大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS细胞。将过夜培养的细胞置于含氨苄青霉素100µg/mL、氯霉素34µg/mL的LB培养基中,以1:30稀释,37℃,200 rpm培养至OD500nm.为1.0。用0.1 mM异丙基β-诱导细胞d-1-硫代半乳糖苷在16°C和150 rpm下保存72小时。4℃,7000 rpm离心5 min,收集细胞并冷冻,以获取溶菌酶的表达。细菌颗粒resuspended在裂解缓冲(50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值8.0,补充与EDTA 10毫米和5毫米二硫苏糖醇)和0.1毫克/毫升的对待DNase在4°C(罗氏)30分钟。细胞提取后得到细胞破坏通过声波降解法(10 1分钟的周期在4°C),离心13000 rpm和4°C为30分钟,上清液30000 rpm, 4℃超离心1小时,以消除不溶性碎片。得到的可溶部分保存在−20°C直到其纯化。

原生HMFO和变体按照先前描述的HMFO WT相同的协议纯化[24].两个连续的阴离子交换色谱步骤,首先用资源Q 6-mL(GE Healthcare)柱,然后用单Q 5/50GL 1-ML柱获得纯酶的纯级分。纯化过程后,通过分析SDS-PAGE(v/v)聚丙烯酰胺分离凝胶(另附文件1.:图S7)。

HMFOs的光谱性质

用Cary4000分光光度计在250 ~ 700 nm范围内记录纯化蛋白的紫外可见光谱。将酶经热处理(95℃5 min)和离心45 min得到的折叠酶和游离黄素的光谱记录下来,使用已知的FAD (ε)消光常数计算黄素i带的消光系数450海里= 11300毫米−1厘米−1) [42.)(附加文件1.:表S3)。每个变异的消光系数被用来估计蛋白质浓度。

pH值和H2.O2.原生HMFO及其变体的稳定性

通过在不同pH(6-9)的布列顿-罗宾逊缓冲液中孵育纯化的酶,估计其pH稳定性。测定H2.O2.,纯化的酶在0 ~ 30 mM H的存在下孵育2.O2.在50毫米三盐酸,pH 7.5。样品在25°C下孵育,在25°C下,用3 mM香草醇在50 mM Tris/HCl中氧化,pH 7.5,测定0、24、48和72 h的残留活性。每种酶在不同时间和pH或H时获得的活性最高2.O2.条件取为100%,其余措施的剩余活性百分比参照此值。

HMFOs生产FDCA

pH对HMF和FFCA氧化的影响是通过分析每种酶(2.5µM)与HMF或FFCA (1.5 mM)在50 mM NaPi (pH 6.5)和50 mM Tris/HCl (pH 7.5、8.0和9.0)中孵育后的FDCA产量来确定的。H的影响2.O2.HMFO WT (2.5 μ M)与HMF (1.5 mM)在不同浓度的H2.O2..FDCA: H2.O2.化学计量学通过HPLC定量FDCA(见下文)和H2.O2.使用AmplexRED®/ HRP。通过分析酶(2.5μm)与HMF(6mm)和过氧化氢酶过量(10-25 u / ml)孵育后的FDCA产量来研究氧气的影响,并用1.22mm的o鼓泡反应2..通过在酶(2.5 μM)和6 mM HMF (6 mM)中分别添加或不添加FAD (20 μM)来检测辅因子添加的影响。

所有反应(除非有说明)均在50 mM NaPi (pH 6.5, HMFO WT)和50 mM Tris/HCl (pH 8.0, HMFO变体)中进行,条件为28°C,持续振荡(180 rpm)。在所有情况下,溶液在相同的条件下处理,但没有酶作为阴性对照。

通过在加入HCl之前在不同时间(通常为0,4,24和48小时或更长的反应中的每24小时)后,测量沿反应的HMFO的残余活性。作为时间函数的活动衰减是从EQ计算的。1.允许半衰期的估计(Eq。2.):

$ $ HMFOactivity \;左(\ \ % \右)= HMFO act_, {0} \ \ cdot e ^{- \λt} $ $
(1)
$t_{1/2} = $ frac{ln\left(2 \right)}{\lambda}$$
(2)

在哪里λ活度衰减是常数吗1/2是酶的半衰期。

产品标识

底物转化后,在不同时间(通常为0、4、24和48小时,或在较长的反应中每隔24小时)取150µL等分试样,并通过添加pH值为2–3的1 M HCl停止反应。使用离子交换SUPELCOGEL C-610H柱(300)通过HPLC分析糠醛氧化 × 7.8 mm,9µm粒径,SUPELCO)。用5mmH洗脱化合物2.所以4.为流动相,流速0.6 mL/min, 30°C,检测波长264 nm。FDCA、HMFCA、FFCA、HMF和DFF的保留时间分别为21、27、30、42和52 min(附加文件)1.:图S8)。分别用0.05、0.1、0.2、0.4、0.75和1.5 mM溶液对反应中可能存在的各组分进行标定。H2.O2.在加入盐酸之前,使用过氧化物酶偶联测定进行定量。在本实验中,HRP (6 U/mL终浓度)与AmplexRed®试剂(75 ng/mL终浓度)在H2.O2.产生一种粉红色的产物(间苯二酚;ε563海里= 52000−1厘米−1).使用已知H浓度的校准曲线进行定量2.O2..得到的平均值的标准差总是≤5%。

动力学分析

通过监测H的生成,计算了HMF和HMFOs氧化DFF的稳态动力学参数2.O2.在不同底物的氧化过程中,使用hrp -偶联分析,最终底物为AmplexRed®在50 mM Tris/HCl, pH 7.0,如前所述[24].氧化FFCA被孵化在末世模式下测量不同浓度的FFCA酶-25毫米(0.4)(0.3 - -1.5µM,取决于酶)与过氧化氢酶补充过量(汽车U /毫升)在50 mM NaPi 25°C, pH值6.0 - -6.5,或50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值7.0 - -9.0,在连续的震动。WT HMFO在48小时后停止反应,HMFO变体在30分钟后停止反应,并按上述方法用高效液相色谱法对产物进行定量。fca或H2.O2.形成(v/[Ez]);酶浓度(µmol)反应时间(导致最小−1单位)。

在所有情况下,动力学参数是通过拟合不同醇或醛浓度下的初始反应速率,以米克利斯-曼腾方程(Eq。3.)使用Origin软件。

$ $ \压裂{{v_{0}}}{左\ [E \]} = \压裂{{k_左{猫}\ [S \右]}}{{k_ {m} +左\ [S \右]}}$ $
(3)

在哪里k催化常数是多少K是米凯利斯-曼腾常数。

当无法估计明显的动力学参数时,速率之间的线性关系(min−1),底物浓度(mM)作为催化效率(k奥林匹克广播服务公司/ [FFCA])。

数据和材料的可用性

支持本文结论的所有数据都包含在文章及其支持信息中。其他信息可根据要求由相应作者提供。

缩写

阳极氧化铝:

芳基 - 醇氧化酶

FDCA:

2, 5-Furandicarboxylic酸

FFCA:

5-Formylfurancarboxylic酸

GMC:

葡萄糖-甲醇-胆碱氧化酶/脱氢酶(酶超家族)

羟甲基糠醛:

5-Hydroxymethylfurfural

HMFCA:

5-Hydroxymethylfurancarboxylic酸

HMFO:

羟甲基糠醛氧化酶

高效液相色谱法:

高效液相色谱法

合:

辣根过氧化物酶

k:

催化常数

k/K:

催化效率

K:

米氏常数

PEF:

保利(ethylene-2 5-furandicarboxylate)

宠物:

保利(ethylene-terephthalate)

TTN:

总转化率

参考文献

  1. 1.

    Geyer R, Jambeck JR, Law KL,《所有塑料制品的生产,使用和命运》。Sci放置2017;3:e1700782。

    文章谷歌学术搜索

  2. 2.

    生物质转化为选定的化学产品。Chem Soc Rev. 2012; 41:1538-58。

    中科院文章谷歌学术搜索

  3. 3.

    黄氪,全W,李世英,金女士,朴yk。可持续生物塑料:用于生物基下一代聚合物PEF的生物构建块生产的最新进展。北京化工大学学报(自然科学版);

    中科院文章谷歌学术搜索

  4. 4.

    Loos K,张R,Pereira,agoStinho B,Hu H,Maniar D,Sbirrazzuoli N,Silvestre AJD,Guigo N,Sousa Af。PEF合成,性质和终生的观点。前化学。2020; 8:585。

    中科院文章谷歌学术搜索

  5. 5。

    帕佩佐治广州,Tsanaktsis V, Bikiaris DN。利用可再生资源单体合成聚(呋喃二甲酸乙酯)聚酯:与PET、PEN的热性能比较。Phys Chem Chem Phys. 2014; 16:7946-58。

    中科院文章谷歌学术搜索

  6. 6。

    Burgess SK, Leisen JE, Kraftschik BE, Mubarak CR, Kriegel RM, Koros WJ。与聚(对苯二甲酸乙酯)相比,聚(呋喃甲酸乙酯)的链流动性,热和机械性能。大分子。2014;47:1383 - 91。

    中科院文章谷歌学术搜索

  7. 7。

    2,5-呋喃二羧酸的生物合成。在:Varjani S, Binod P, Kumar S, kare SK,编辑。生物合成技术与环境挑战。柏林:施普林格;2018.

    谷歌学术搜索

  8. 8.

    刘华,杜军,刘凯,王涛,刘磊。生物催化合成2,5-呋喃甲酸的研究进展。应用生物技术。2020;104:527-43。

    中科院文章谷歌学术搜索

  9. 9.

    胡一,何艾,刘学勇,夏军,徐建新,周淑英,徐建明。5-羟甲基糠醛生物催化转化为高价值衍生物的研究进展与展望。ACS Sustain Chem Eng. 2018; 6:15915-35。

    中科院文章谷歌学术搜索

  10. 10.

    Saikia K, Rathankumar AK, Kumar PS, Varjani S, Nizar M, Lenin R, George J, Vaidyanathan VK。5-羟甲基糠醛生物转化研究进展:挑战与展望。J Chem Technol Biotechnol. 2021。https://doi.org/10.1002/jctb.6670

    文章谷歌学术搜索

  11. 11.

    赵雪梅,刘东东。5-羟甲基糠醛(HMF)合成2,5-呋喃二甲酸(FDCA)的研究进展。绿色化学。2018;20:5427-53。

    中科院文章谷歌学术搜索

  12. 12.

    赵丹丹,苏涛,王玉英,Varma RS, Len C.催化氧化5-羟甲基糠醛的研究进展。摩尔Catal。2020;495:111133。

    中科院文章谷歌学术搜索

  13. 13.

    Domínguez de María P, Guajardo N.呋喃的生物催化价化:内在不稳定底物的机会。Chemsuschem。2017;10:4123-34。

    文章谷歌学术搜索

  14. 14.

    Troiano D, Orsat V, Dumont MJ。2,5-呋喃甲酸生产中的生物催化研究现状。ACS Catal。2020;10:9145 - 69。

    中科院文章谷歌学术搜索

  15. 15.

    Lalanne L, Nyanhongo GS, Guebitz GM, Pellis A.呋喃基可再生单体和聚合物的生物技术生产和高潜力。Biotechnol放置2021;48:107707。

    中科院文章谷歌学术搜索

  16. 16。

    Carro J,Ferreira P,Rodríguez L,Prieto A,Serrano A,Balcells B,ArdáA,Jiménez Barbero J,Gutiérrez A,Ullrich R,Hoffrichter M,Martínez AT.5-羟甲基糠醛通过真菌芳香醇氧化酶和非特异性过氧化物酶的转化。FEBS J.2015;282:3218–29。

    中科院文章谷歌学术搜索

  17. 17。

    通过三种真菌酶的联合作用制备2,5-呋喃二羧酸(FDCA) -对苯二甲酸的替代品。微生物。2018;6:5。

    中科院文章谷歌学术搜索

  18. 18.

    麦肯纳SM, Leimkuhler S, Herter S, Turner NJ, Carnell AJ。酶级联反应:用氧化酶串联合成呋喃甲酸(FDCA)和羧酸。绿色化学。2015;17:3271-5。

    中科院文章谷歌学术搜索

  19. 19.

    吴树华,刘强,张飞,尹海霞。基于连续酶反应的5-羟甲基糠醛生物合成2,5-呋喃甲酸的新途径。应用生物化学。2020;191:1470-82。

    中科院文章谷歌学术搜索

  20. 20.

    秦永忠,李义明,宗明华,吴辉,李楠。酶催化5-羟甲基糠醛(HMF)选择性氧化及其与2,5-二甲酰呋喃的分离。绿色化学。2015;17:3718-22。

    中科院文章谷歌学术搜索

  21. 21.

    麦肯纳SM, Mines P, Law P, Kovacs-Schreiner K, Birmingham WR, Turner NJ, Leimkühler S, Carnell AJ。HMF连续氧化为FDCA和周质醛氧化酶(PaoABC)的固定化和稳定。绿色化学。2017;19:4660-5。

    中科院文章谷歌学术搜索

  22. 22.

    Jia HY, Zong MH, Zheng GW, Li N.一锅酶级联反应H2O2内循环合成呋喃甲酸。Chemsuschem。2019;12:4764-8。

    中科院文章谷歌学术搜索

  23. 23.

    Dijkman WP, Groothuis DE, Fraaije MW。酶催化5-羟甲基糠醛氧化制呋喃-2,5-二羧酸。Angew化学2014;126:6633-6。

    文章谷歌学术搜索

  24. 24.

    Viñambres M,Espada M,Martínez AT,Serrano A.用于生产呋喃二甲酸的新型羟甲基糠醛氧化酶的筛选和评估。应用环境微生物学。2020;86:00842–920.

    文章谷歌学术搜索

  25. 25.

    Serrano A, Calviño E, Carro J, Sánchez-Ruiz MI, Cañada FJ, Martínez AT。芳醇氧化酶将羟甲基糠醛完全氧化为呋喃甲酸。Biotechnol生物燃料。2019;12:217。

    文章谷歌学术搜索

  26. 26.

    Cavener博士,GMC氧化还原酶。一个新定义的具有不同催化活性的同源蛋白质家族。摩尔生物学杂志。1992;223:811–4.

    中科院文章谷歌学术搜索

  27. 27。

    Dijkman WP, Fraaije MW。一种5-羟甲基糠醛氧化酶的发现和特性MethylovorusMP688 sp压力。应用环境微生物学。2014;80:1082-90。

    文章谷歌学术搜索

  28. 28。

    Ruiz Dueñas FJ、Ferreira P、Martínez MJ、Martínez AT。体外激活、纯化和鉴定大肠杆菌表达芳基 - 醇氧化酶,一个独特的H.2.O2.第酶。蛋白质表达Purif. 2006; 45:191-9。

    文章谷歌学术搜索

  29. 29。

    Jankowski N, Koschorreck K, Urlacher VB。来自的芳基醇氧化酶2的高表达侧耳属eryngii毕赤酵母属pastoris用于香料和生物活性前体的生产。应用微生物生物技术。2020;104:9205-18。

    中科院文章谷歌学术搜索

  30. 30.

    Román R, Loncar N, Casablancas A, Fraaije MW, Gonzalez G.通过两阶段补料批次方法高水平生产工业相关氧化酶:克服阿拉伯糖诱导的分解代谢物抑制大肠杆菌系统。应用微生物生物技术。2020;104:5337-45。

    文章谷歌学术搜索

  31. 31.

    5-羟甲基糠醛氧化酶的结构基础研究。ACS Catal。2015;5:1833-9。

    中科院文章谷歌学术搜索

  32. 32.

    Martin C, Ovalle Maqueo A, Wijma HJ, Fraaije MW。通过将计算预测与新型高效库设计相结合,创造出更强大的5-羟甲基糠醛氧化酶。Biotechnol生物燃料。2018;56。

    文章谷歌学术搜索

  33. 33.

    round SA, Wilde FD, Ritz GF:溶解氧3.0) .U.S。水资源调查地质调查技术,第9卷,A6章,第6.2节。2013.https://doi.org/10.3133/tm9a6.2.

  34. 34.

    Gemoets HPL,SU Y,Shang M,Hessel V,Luque R,NoëlT.液相氧化化学在连续流动微反应器中。Chem SoC 2016年45:83-117。

    中科院文章谷歌学术搜索

  35. 35.

    流式生物反应器作为生物催化过程强化的辅助工具。生物科技趋势》。2018;36:73 - 88。

    中科院文章谷歌学术搜索

  36. 36.

    引用本文:王志军,王志军,王志军。生物催化反应在流动反应器中的应用。Org Process Res Dev. 2012; 16:1013-6。

    中科院文章谷歌学术搜索

  37. 37.

    生物催化氧化酶:间歇到连续。化学工程学报2012;90:726-31。

    中科院文章谷歌学术搜索

  38. 38.

    Ringborg RH, Pedersen AT, Woodley JM。在管式流动反应器中氧依赖酶动力学的自动测定。ChemCatChem。2017; 9:3285-8。

    中科院文章谷歌学术搜索

  39. 39。

    Pedersen AT, de Carvalho TM, Sutherland E, Rehn G, Ashe R, Woodley JM。氧依赖生物催化用连续搅拌细胞反应器的特性。Biotechnol Bioeng。2017;114:1222-30。

    文章谷歌学术搜索

  40. 40.

    van Schie MMCH, Pedroso de Almeida T, Laudadio G, Tieves F, Fernández-Fueyo E, Timothy N, Arends IWCE, Hollmann F.连续流动微反应器中Green Note反式2-己烯的生物催化合成。北京化工大学学报(自然科学版)2018;

    文章谷歌学术搜索

  41. 41.

    Schmid A, Dordick JS, Hauer B, Kiener A, Wubbolts M, Witholt B.工业生物催化的今天和明天。大自然。2001;409:258 - 68。

    中科院文章谷歌学术搜索

  42. 42.

    紫外可见光谱学作为研究黄酮类蛋白的工具。在:查普曼SK,里德GA,编辑。黄素蛋白协议。风险:胡玛纳出版社;1999.1 - 7页。

    谷歌学术搜索

下载参考

致谢

通过其通过其信息资源(Urici)的信息资源单位,通过CSIC开放访问公开支持倡议承认对出版费的支持。AVA Biochem(瑞士)被承认为HMF供应。

资金

这项工作由H2020 BBI-JU (https://www.bbi-europe.eu) EnzOx2 (h2020 - bbi ppp - 2015 - 2 - 720297;https://www.enzox2.eu)项目、西班牙科学与创新部GENOBIOREF (BIO2017-86559-R)项目(由FEDER基金联合资助)、CSIC项目PIE-201620E081和CSIC“可持续塑料走向循环经济”跨学科平台(SUSPLAST)。

作者信息

从属关系

作者

贡献

misr进行了实验并写出了第一份手稿草稿。并对实验结果进行了修正。AS和ATM撰写了最终版本的手稿。所有作者都对得到的讨论和结论做出了贡献。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

给安吉尔·t·Martínez或安娜·塞拉诺的信。

道德声明

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

竞争利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

额外的信息

出版商的注意事项

Springer Nature在公布的地图和机构附属机构的管辖权主张方面保持中立。

补充信息

附加文件1:表S1。

HMF、DFF和FFCA氧化的稳态动力学参数。表S2。FAD对FFCA氧化的影响。表S3。HMFO WT和变体的光谱性质。图S1。H的影响2.O2.从FFCA生产的FDCA。图S2。HMF和DFF氧化动力学曲线。图S3FFCA对HMFO动力学和残余活性的影响。图S4。氧、FAD和过氧化氢酶对FDCA生产的影响。图S5。HMF控制没有HMFO的反应。图S6。HMFO变体与不同HMF浓度的反应。图S7。SDS-PAGE纯化的HMFOS。图S8。hmf衍生糠醛的高效液相色谱分离。

权利和权限

开放获取本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中,除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中,并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途,你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本,请浏览http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.创作共用及公共领域专用豁免书(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)适用于本文提供的数据,除非在数据的信贷额度中另有说明。

再版和权限

关于这篇文章

通过CrossMark验证货币和真实性

引用这篇文章

Sánchez Ruiz,M.I.,Martínez,A.T.和Serrano,A.优化酶法生产呋喃二甲酸构建块的操作参数。活细胞的事实20.180 (2021). https://doi.org/10.1186/s12934-021-01669-1

下载引用

关键字

  • 酶催化
  • 羟甲基糠醛氧化酶
  • 催化剂
  • 酶工程
  • 2, 5-Furandicarboxylic酸产品
  • 5-Formylfurancarboxylic酸中间
  • 反应pH值
  • 过氧化氢的副产品
  • 酶抑制
  • 反应优化