高度特异性的功能表征L.阿拉伯糖转运蛋白的Trichoderma Reesei.

背景

已经研究了木质纤维素生物质作为第二代生物燃料和其他增值产物的原料。生物燃料生产的一些方法利用纤维素酶和半纤维素酶在发酵之前将木质纤维素生物量转化为一系列可溶性糖，例如酵母如酵母的微生物酿酒酵母酿酒酵母．其中一种糖是L.-阿拉伯糖，它不能被酵母自然利用。第一步L.--Axinose分解代谢是其进入细胞的运输，酵母缺乏特定的运输扣，可以执行这项任务。

结果

我们确定了Trire2_104072Trichoderma Reesei.作为一个潜在的L.-阿拉伯糖转运体的表达谱。这个转运体在2007年就被描述为D.-木糖转运体XLT1。木糖转运体的电生理实验非洲爪蟾蜍光滑的卵母细胞和酵母异体表达表明，Trire2_104072具有高亲和力L.- 与a的arabinose symporterK._{米yD.F4.y2Ba}价值在范围内\（\ sim \） 0.1–0.2 mM. It can also transportD.-木糖，但亲和力低(K._{米yD.F4.y2Ba}\（\ sim \） 9 mM). In yeast,L.-阿拉伯糖的转运受到轻微的抑制D.一个但不是由D.-葡萄糖的含量是抑制糖的五倍。与已知的L.--Arabinose转运蛋白透露，Trire2_104072的表达使酵母能够吸收L.- 低细胞外的条件下的速率最高L.阿拉伯糖浓度。尽管Trire2_104072对L.--abinose，它的增长t . reesei缺失突变体仅在低水平时受影响L.阿拉伯糖浓度。

结论

由于其高亲和力L.-阿拉伯糖和低抑制D.-Glucose或D.-Xylose，TRIRE2_104072可以作为改善使用酵母菌菌株的良好候选者。发现一个高度特定的L.-阿拉伯糖转运体也增加了我们对主要代谢的认识t . reesei．缺失菌株的表型表明其他运输扣的参与L.-阿拉伯糖在这个物种中的运输。

木质纤维素生物质作为生物过程的原料得到了相当大的关注。它是可再生的，在世界各地都很丰富，它作为原料的使用不会干扰粮食生产，就像用于制造第一代生物燃料的含淀粉原料一样。木质纤维素生物质主要由多糖和木质素组成。该多糖包括植物细胞壁多糖(纤维素、半纤维素、果胶)和贮藏多糖(淀粉、菊粉)，其中前者对生物加工原料特别重要[1]．将木质纤维素生物质转化为生物燃料等增值化合物的一种方法是酶解后发酵。对发酵步骤研究最多的生物是酵母酿酒酵母酿酒酵母因为它自然产生大量乙醇，具有长期的工业用途，并且耐受生长抑制剂（例如乙酸）在生物量预处理期间产生的[2那3.]．

木质纤维素水解产物的糖组合物取决于植物原料的类型。单焦点中的主要糖，被认为是主要的可再生能量作物，是己糖D.葡萄糖和戊糖D.木糖和L.阿拉伯糖(4.那5.]．经济上竞争的生物燃料过程需要完整的基板利用，但野生型酿酒酵母不能消耗这些戊糖[6.]为了避免这个问题，许多研究已经研究了酵母的代谢工程，以利用D.木糖和L.-Arabinose（参考文献中审查。[7.那8.])。利用D.-Xylose已经获得更多的注意，如在许多生物量中，它的存在于较高的丰富L.阿拉伯糖(8.那9.]．然而，来自食品工业的一些富含果胶的废物生物量（例如橙皮，甜菜浆）含有较高量的L.阿拉伯糖比D.木糖(10.]．由于木质素含量低，减少了预处理的需要，这些生物质作为工业原料引起了人们的兴趣[11.那12.]．它们也以低成本大量提供，它们的利用不会干扰食品生产[11.那12.那13.]．

除了途径工程外，几项研究都集中在寻找有效的摄取系统D.木糖和L.-arabinose(参阅参考文献[9.])。酵母的一些内源性糖转运蛋白可以运输这些糖，但具有低亲和力，因此抑制了运输D.葡萄糖(9.那14.那15.]．虽然有人指出，运输目前不是在限制因素D.木糖或L.- 制导出发酵，高亲和力戊糖转运蛋白可以在底物浓度低的条件下改善生长并且能够同时使用D.-葡萄糖和戊糖[8.那9.那16.]．已经对几种异源戊糖转运体进行了表征，以研究它们是否适合用于这一目的[9.]．L.到目前为止，从酵母中发现了--Axabone转运蛋白[15.那17.那18.)、真菌(16.那19.那20.]， 细菌 [21.那22.那23.那24.]来自植物拟南芥蒂利亚纳[15.那25.]．然而，许多这些转运体在酵母中表达水平低，并受到抑制L.- 阿布宁糖运输D.葡萄糖。[9.]．

Trichoderma Reesei.是一种子囊菌真菌，以分泌大量纤维素酶和半纤维素酶而闻名。由于其腐生的生活方式，它可以在许多生物质衍生的糖上生长，包括L.阿拉伯糖。尽管它的基因组已经被预测包含大约50-100个糖转运编码基因[26.那27.那28.]少于10个运输司机在功能上表现出[14.那26.那29.那30.那31那32那33]．增加我们的知识t . reesei糖转运体和识别新L.- 在生物技术应用中具有潜力的-Abinose运输扣，我们开始调查L.阿拉伯糖转运蛋白的t . reesei．

我们通过分析之前发表的一项研究的转录组数据开始了我们的研究，该研究调查了t . reesei转录因子xyr1和ARA1在存在的基因表达上L.- arabinose和D.半乳糖。XYR1是纤维素酶和半纤维素酶表达的主调节器t . reesei随着另一种转录因子，ACE3 [34那35]．另一方面，ARA1已被发现调控相关基因的表达L.- arabinose和D.-半乳糖代谢，以及一些与果胶代谢有关的基因[36]．Xyr1也参与了调节L.-阿拉伯糖代谢，两者的缺失支持了这一事实XYR1.和ara1是删除所必需的t . reesei增长L.阿拉伯糖(36]．此前已经观察到XYR1的调控靶点包括糖转运体[34那37]．由于ARA1在其他真菌中的遗传和功能性直肠调节糖转运蛋白的表达，我们也有兴趣了解这是这种情况t . reesei[38那39]．由于在原文中未分析或讨论转运蛋白表达t . reeseiARA1 [36，我们分析了储存的数据集，以确定糖转运基因上的高表达L.- araabone和直接由ARA1调节，因此可能在运输中发挥作用L.阿拉伯糖。

高度表达了几种已知的和推定的运输车L.依赖于ARA1或xyr1的-阿拉伯糖。为了缩小我们的搜索范围，我们进行了系统发育分析，并调查了被观察到对戊糖利用很重要的序列决定因素的存在[9.]．TRIRE2_104072被确定为潜在的一个L.阿拉伯糖转运蛋白。此次运输商之前在我们的研究所在2007年在一项研究中确定了一个t . reesei筛选cDNA文库的克隆，允许酵母生长D.-木糖，但其动力学D.-木糖或其运输其他糖的能力没有被研究[14.]．因为这是第一次D.-木糖转运体鉴定自t . reesei，命名为XLT1 (D.-XyL.OSE.T.在发现这个传送器之后，还有其他几个传送器D.- 已经鉴定了XYLOSE转运蛋白t . reesei[26.那29.那32]．到目前为止，没有具体L.-阿拉伯糖转运体已从t . reesei，虽然其中一个缺失菌株D.据报道，Xylose转运蛋白有生长缺陷L.- arabinose和一D.- 葡萄糖转运蛋白已被证明有次要L.-Abinose运输活动[29.那40]．

因此，我们决定将TRIRE2_104072评估为可能的L.阿拉伯糖转运蛋白。为此，我们选择了酵母和爪蟾Trire2_104072的功能表征模型系统。酵母已被广泛用于表征真菌和植物来源的转运体，在Trire2_104072的原始研究中也使用了酵母[14.]．电生理双电极电压钳(TEVC)方法[41它利用了非洲爪蛙的卵母细胞非洲爪蟾蜍光滑的，也已被用于电生糖转运蛋白的表征（例如糖/质子交钥者）。由于其用于真菌运输扣的表征已经罕见，我们决定为此目的测试其适用性。这项研究导致了关于TRIRE2_104072的有趣结果，它可以作为改善利用酵母菌株的新工具。

TRIRE2_104072高度表达L.-阿拉伯糖依赖于ara1

识别潜力L.-阿拉伯糖转运体，我们分析了已发表的糖转运体基因表达的转录组数据集[36]．在Benocci等人的研究中，t . reesei菌株QM9414及其\（\三角洲\）XYR1.那\（\三角洲\）ara1和\（\三角洲\）XYR1.\（\三角洲\）ara1缺失突变体培养在含L.阿拉伯糖或D.- 作为唯一的碳源，进行转录组分析[36].我们为分析选择的一组基因包括来自t . reesei(参见“方法“）。表达水平和日志₂所选传输程序获得的折叠更改显示在附加文件中1：图S1。

从数据中可以看出，在亲本QM9414菌株中，多个转运体在这些碳源上都有高水平的表达(附加文件)1:图S1a)。当这种菌株成长时L.--Axabinose，具有最高表达水平的转运蛋白基因是迄今为止远远不具象腺化的TRIDE2_82309，D.-Xylose Transporter Trire2_104072（XLT1）[14.]，D.葡萄糖/D.-木糖转运体Trire2_50894 (str1）[26.那29.),D.-葡萄糖促进剂Trire2_47710 (stp1）[30.那42]．TRIRE2_82309和TRIRE2_104072在缺乏ARA1的突变体中下调str1在缺乏XYR1的突变体中下调(Additional file1:图印地)。与这些在缺乏ARA1或XYR1时表达下调的基因相反，stp1在双缺失突变体中出现了上调。其他转运体基因在突变株上有差异表达L.-Arabinose是纤维二糖/乳糖转运蛋白TRIRE2_3405（crt1）[30.那33那43，在XYR1缺失的情况下下调D.木糖/D.- 营养/ Cellobiose Transporter Trire2_69957 [44]，由XYR1或ARA1调节L.阿拉伯糖。

关于D.- 在该碳源上高度表达TRIRE2_82309和STP1（附加文件1:图S1a)。有趣的是，STP1被证明能够运输D.- 糖乳糖和少量L.-阿拉伯糖在以前的研究中[40]．与L.-Arabinose培养，TRIRE2_82309和TRIRE2_104072在缺乏ARA1的菌株中下调（附加文件1:图印地)。trire2_62380（str3）[26.和Trire2_22912 (hxt1）[45]在两种碳源上的调控有些相似，前者在没有ARA1的情况下上调，而后者在没有XYR1的情况下上调(附加文件1：图S1B）

Trire2-U 82309和Trire2-U 104072在L.- 在缺乏ARA1的突变体中进行 - 制导和下调，这是与之相关的基因的阳性调节因子L.-Arabinose新陈代谢[36，表明他们可能参与了L.- 制导到代谢t . reesei．由于Trire2_104072仅在L.-arabinose和ARA1的调控更为严格L.-与Trire2-U 82309相比，我们决定在进一步分析中重点关注它。

Trire2_104072同源于L.阿拉伯糖转运蛋白的青霉钙菊属um.

Trire2_104072的基因编码位于支架上t . reeseiQM6a基因组组装(位置68870-70589)[46]．同一基因组区域包含另一个假定的转运体Trire2_56684和一个假定的转录因子Trire2_104075。这个区域是Stappler等人所描述的光调节星系团的一部分。47]，还含有纤维素酶基因cbh2和EGL2.．

对比分析了trre2_104072的序列t . reeseiQM6A和RUT-C30（Trirerutc30_33630）基因组在我们以前的另一个研究中观察到的情况下，序列注释之间的差异显示出序列注释之间的差异t . reesei膜转运体CRT1 [33那46那48]．从QM6A基因组注释中发现的核苷酸序列更短。它仅包含7个外显子，而RUT-C30版本中包含一个在N-Terminus中的额外外显子。另外，第二外显子较长，如图2所示。1一种。由于其长度较短，蛋白质的QM6A版本通过TMHMM预测[49不包含12个跨膜结构域(TMD)，这是主要促进超家族(MFS)糖转运蛋白的特征(图。1b）。估计RUT-C30版本在CCTOP或Phobius建模时包含12 TMD [50那51[TMHMM预测中的TMDS 3-4的预测概率低于0.5（图。1C）。蛋白质的N-末端细胞内部分相对较短，而C末端细胞内尾部较长并且含有三个赖氨酸残基，预计是UBPRED服务器的中等信心的泛素型位点[52]．在前一份报告中使用的cDNA序列（GenBank登录号AY818402）的翻译与RUT-C30版本相同，不同之处在于它在第11 TMD处包含P388H突变（图。1b) (14.]．从现在开始，P388H突变的版本将被称为XLT1，而RUT-C30基因组注释的版本将被称为Trire2_104072。

数字1D显示了TRIRE2_104072与据报道的其他转运仪的系统发育对准，该转运仪能够能够运输L.- 在酵母中表达时的arabinose。TRIRE2_104072组合在一起与最近发现的青霉钙菊属um.L.-Arabinose Transporter Arat（与BLASTP的64％同一性）[16.]．这两个运输器，以及另外两个L.- 来自丝状真菌的碱性转运蛋白（粗糙脉孢菌LAT-1和Myceliophtora thermophilaLAT-1 [20.])还有一个来自L.-Abineose-发酵酵母（Ambrosiozyma MonoSpora.LAT1）[18.那53]形成他们自己的分支。三个L.-阿拉伯糖转运体(Pichia Guilliermondii那Scheffersomyces稳定炎和Kluyveromyces Marxianus.[15.那54)和来自植物的四个转运体拟南芥蒂利亚纳[25.也形成了自己的分支。这些转运体都属于同一个单系大枝，但有些转运体聚集在不同枝下。例如,答:monosporaLAT2 [18.那53]，trire2_82309和N. Crassa.XAT-1[19.]在以前讨论过主要的思考之外的小组在一起。虽然最初发表为一个L.-Arabinose Transporter [18.， Lat2后来被发现是一个L.-阿糖醇和利糖醇转运体而不是L.-Arabinose Transporter [53]．除了GAL2，它在图1中形成了自己的疏水板。1D，另外两个酿酒酵母运输工具已经被发现能够运输L.-arabinose (Hxt9, Hxt10) [15.]．然而，由于它们在支持增长方面的效率较低L.-abinose而不是gal2 [15.，他们被排除在分析之外。

基于氨基酸序列的糖转运蛋白的衬底特异性预测已被证明是困难的。然而，至少四种序列决定簇对于戊糖运输和D.-葡萄糖抑制已被证实。为了补充系统发育分析，我们调查了如图所示的转运体中存在的这些基序。1d.在四个序列行列式中，前三个位于第一个TMD，第四个位于第7个TMD。第一个序列行列式是G-G / F-X-X-X-G被发现参与运输能力的主题（GAL2中的残留物81-86）D.木糖(55].带有此图案的运输工具如图所示。1d，这部分对齐显示在附加文件1:图S2。这个基序最后一个甘氨酸之前的苯丙氨酸残基(Gal2的85位)在所有这些转运体中都是保守的。据报道，该残体的诱变作用有所改善L.- Gal2和Arabinose运输D.葡萄糖运输t . reeseiSTP1，还可以减少D.葡萄糖和D.木糖运输P. GuilliermondiiMgt05196和D.木糖运输大肠杆菌XylE [40那42那56那57]．

第二个序列决定簇是苯丙氨酸残基（GAL2中的位置87），其遵循第一序列图案的最后最后甘氨酸[54]．在更喜欢的运输车中D.-木糖作为底物，苯丙氨酸被酪氨酸取代[54]．图中的转运体。1根据这个基序，D可以分为两个分支，大多数转运体在这个位置上有苯丙氨酸或酪氨酸。这个残基在除Trire2_104072(在这个位置有谷氨酸)之外的所有转运体中都被天冬氨酸跟随。这种残基由天门冬氨酸突变为丙氨酸，被发现可以消除D.葡萄糖和D.TRIRE2_63966中的多氧化糖传输[32]．第三个序列决定簇，已被证明可以在特异性中发挥作用L.-Arabinose，是Gal2中89位的酪氨酸[58].该残基突变为异亮氨酸改变了K._{米yD.F4.y2Ba}Gal2 for.L.-阿拉伯糖从335毫米降至99毫米，降低了K._{米yD.F4.y2Ba}的值L.- arabinose和D.-葡萄糖从176增加到15 [58]．

第四个序列决定簇是376 in位置的天冬酰胺酿酒酵母Gal2 (TMD 7)，被认为是重要的D.-Glucose抑制[9.]．芦笋被苯丙氨酸所取代，所有转运液中具有第二个主题（F87.)，除了在这个位置上仍有天冬酰胺的两种(S.智慧炎阿拉特和k . marxianusAxt1)。这种从天冬酰胺到苯丙氨酸的残基突变被发现可以消除D.减少-葡萄糖的转运K._{米yD.F4.y2Ba}为了D.- 在Gal2中为Xylose [59]．其他研究也显示了这种残基对不同转运体的重要性[32那40那56]．除了tmd1和tmd7中的序列决定因子外，tmd6还包含一个motif (YFFYY在Gal2中)，它已被证明对戊糖运输很重要[32那40那56那57那60].有趣的是，所有具有第二序列决定因素的转运蛋白(F87.)也有缬氨酸在这个主题的第一个位置(附加文件1:图S2)。在XLT1 (Gal2的452位)中突变为组氨酸的脯氨酸残基在大多数转运体中都是保守的，并且没有被组氨酸取代。只有这些运输者N. Crassa.LAT-1，M. Thermophila.LAT-1和TRIRE2_104072拥有图1所示的所有序列确定剂。1d.重要序列行列式的存在和与特定序列的同源性L.-阿拉伯糖转运体进一步提示Trire2_104072可能作为一种L.阿拉伯糖转运蛋白。

电生理方法分析Trire2_104072的功能

我们利用电生理TEVC方法对Trire2_104072进行了功能表征x光滑的卵母细胞。该基因被连接成x光滑的表达载体，使我们能够在体外转录mRNA，然后将其注入卵母细胞。由于QM6a版本不具有MFS典型转运体的12个TMDs，我们使用该基因的RUT-C30版本进行功能分析。用Trire2_104072 mRNA注射卵母细胞，检测不同糖的转运活性。与对照组注射水的卵母细胞不同(数据未显示)，注射Trire2_104072 mRNA的卵母细胞被运输D.-木糖，和预期的一样L.- arabinose和D.-葡萄糖，通过分析电流轨迹(图。2一种）。迹线还表示L.-阿拉伯糖产生的电流比D.木糖或D.- 葡萄糖，表明这种糖以最高率运输。由此引起的电流D.- 葡萄糖低于那些L.- arabinose和D.木糖。为了进一步研究TRIRE2_104072的选择性，我们在不同糖存在下测量电流（图）存在电压（I-V曲线）的函数（图。2b）。看到了显着更高的负电流L.-阿拉伯糖(−350 nA，−50 mV)如图所示。2C，但其他糖的电流，包括D.-木糖，在这个电压下很小。水注射卵母细胞的I-V曲线中未见糖诱导电流(图)。2C）。糖诱导的电流的存在表明，运输是电力的，并且TRIRE2_104072用作糖/质子交响者。

动力学研究表明，TRIRE2_104072是一种高亲和力的转运蛋白L.- arabinoseK._{米yD.F4.y2Ba}的\(0.207下午\ 0.079 \)mm（平均值±标准差，N = 3) at pH 5.5 and − 50 mV, as shown in Fig.3.一。关于D.-木糖，它是一种低亲和力的转运体K._{米yD.F4.y2Ba}的\(9.16下午\ 3.35 \)mM在相同条件下(图。3.b）。这一世_最大限度价值L.- arabinose和D.木糖是−\（355 \ PM 72 \）pH 5.5和−50 mV时，nA和−72.3±22.3 nA。电流作为质子浓度的函数遵循Hill动力学K._0.5的\（68.9 \ PM 55.1 \）nM (pH 7.3±0.47)在−50 mV时，存在5 mML.-Arabinose（图。3.C）。对于质子的这种高亲和力导致TRIRE2_104072即使在pH 9下也要保留约25％的最大传输活性（图。3.d). Trire2_104072对质子的亲和力与观测到的类似美国maydis蔗糖转运体Srt1 (K._0.5Trire2_104072的pH为7.3，K._{米yD.F4.y2Ba}Srt1的pH为7.7)[61]．

在不同电压下的动力学分析显示在较低电压下获得更高的运输速率（附加文件1:图S3a-c)。两组间的电压依赖性无显著差异一世_最大限度在基板之间（附加文件1：图S3D）。关于依赖的K._{米yD.F4.y2Ba}对电压的价值，看到相反的趋势L.- arabinose和质子，虽然实验之间的变化很高（附加文件1：图S3E-F）。由于电压变得更加低谐化，pH依赖的山坡系数增加（附加文件1：图S3G）。为山坡系数获得的值低于1，表明负合作效力。

I–V测量期间的曲线形状表明，该运输机显示出预稳态电流（附加文件1:图S4a)。前稳态电流只发现来自某些共流体，它们被认为是由空转运体对电压跳变的反应引起的[62那63]．电荷运动被从电流中提取出来，发现它们被抑制了L.阿拉伯糖(附加文件1：图S4b）。为了进一步研究这一现象，我们测量了在不存在电荷的情况下，不同pH值下的电荷移动L.阿拉伯糖。电荷运动随质子浓度增加，直至pH 6.5-7，之后他们开始再次减少（附加文件1：图S4C-D）。v的依赖_0.5和问_最大限度两组受检卵母细胞在pH值上的变化趋势相似，但幅度不同1：图S4E-F）。最大电荷转移可用于计算转运蛋白周转率，表明每单位时间运输的糖分子的数量。营业额数L.- arabinose和D.Xylose是\(60.2下午\ 16.7 \)S.^-1和\(12.3下午\ 2.85 \)S.^-1（平均值±标准偏差，N= 3）在pH 5.5时。对于其他运输液，例如，已经获得了类似的值。人格1（28秒^-1),答:芥STP1 (59^-1）[64那65]．

Trire2_104072在酵母中的特性

我们还用Trire2_104072在酵母中进行了实验，以补充电生理研究。我们包括XLT1 (Trire2_104072^P388H.)，由于脯氨酸突变为组氨酸可以认为是一种自由基置换，这可能会影响转运特性。结果菌株的吸收能力L.对-阿拉伯糖进行吸收实验^14.C-labeledL.阿拉伯糖。这L.与空白pFL60质粒转化的对照菌株相比，Trire2_104072或XLT1的表达明显提高了-阿拉伯糖的摄取率(图)。4.一种）。表达TRIRE2_104072的菌株大约具有比表达XLT1的菌株的更高的运输速率。如果吸收的是测试L.-Axabinose被其他糖抑制，我们测量了L.- 在竞争测定中在其他糖的存在下吸收的吸收，其中竞争糖存在于五倍过量的情况下（图。4.b） .未发现任何抑制作用D.葡萄糖(下午\ (0 \ 8.2 \)％，平均值±标准偏差），但D.-Xylose似乎有点抑制（\（10.9 \ PM 6.3 \）％）。正如预期的那样，L.--Arabinose本身抑制了运输。获得类似的抑制百分比用于XLT1（D.葡萄糖:\（4.5 \ PM 17.6 \）％，D.-Xylose：13.4±7.9％），表明P388H突变不影响底物特异性。分析L.- 酵母中的arabinose运输动力学显示出一些类似的结果爪蟾结果，如图2所示。4.C。V._最大限度和K._{米yD.F4.y2Ba}的值\(1.49下午\ 0.07 \)nmol毫克_CDW^-1闵^-1(平均±标准差)和\(0.102下午\ 0.020 \)MM在pH6.5处获得。这K._{米yD.F4.y2Ba}在酵母中获得的价值大约是在卵母细胞中获得的价值的一半。

然后，我们将这两种转运体与其他一些已发表的转运体进行比较L.阿拉伯糖转运蛋白:P. Chrysogenum.AraT,N. Crassa.LAT-1，P. GuilliermondiiAxt1，答:芥STP7 Trire2_82309和酿酒酵母gal2。所有基因均由相似的表达载体（2μm，URA3选择)和与PGK1促进者除外GAL2，它表达了ADH1启动子。除了酵母表达之外，所有基因都是密码子优化的答:monosporaLAT1和答:芥STP7，使用cDNA序列。数字5.展示了金额L.- 用酵母细胞悬浮液作为时间的函数，伴有0.167毫米的函数L.-表达Trire2_104072、XLT1和P. Chrysogenum.阿拉特能够吸收更多的量L.-阿拉伯糖与其他菌株相比。因为Trire2_104072对两者都有很高的亲和力L.- arabinose和质子，我们也做了更高的实验L.-阿拉伯糖浓度较低，pH值较低，也较好地反映实际发酵条件。数字5.b显示两个条件的结果，并且可以看出，表达TRIRE2_104072，XLT1或表达的菌株P. Chrysogenum.AraT显著增高L.-在两种试验条件下，阿拉伯糖的摄取率均高于对照菌株（pFL60）(P.< 0.005)．表达的菌株答:芥STP7在较高的情况下也显着吸收L.-阿拉伯糖浓度及较低pH (P.< 0.01)。这一结果与先前确定的最适pH值为4 [25.]．答:monosporaLat1在该条件下也有略高的吸收率，但不显著高于对照菌株。在两种条件下，表达Trire2_104072的菌株的摄取率均显著提高(P.< 0.005)，且与对照菌株相比有显著的吸收率。

Trire2_104072不是生长所必需的t . reesei在L.- rabinose.

鉴于我们的调查结果，我们对Tride2_104072在增长期间的作用感兴趣t . reesei在L.-阿拉伯糖。阿拉伯分解体系t . reesei被认为是由L.-阿拉伯糖或其下游代谢物阿拉伯糖醇，由L.阿拉伯糖通过D.-木糖还原酶XYL1[66]．我们假设由于诱导物排除，在没有Trire2_104072的情况下，Arabolytic系统的诱导可能会破坏。

为了验证我们的假设，我们删除了Trire2_104072的基因编码t . reesei应变M44。通过PCR确认缺失，验证缺失盒整合正确，Trire2_104072开放阅读框缺失(数据未显示)。此外，我们用RT-qPCR证实了Trire2_104072的表达缺失。为此，首先在以山梨醇为碳源的最低培养基上培养亲本和缺失菌株。山梨醇可以被认为是一种中性碳源t . reesei，因为它既不抑制或诱导纤维素酶或半纤维素酶生产[67].在达到足够的生物量后D.-Glucose或L.在稍后收获菌丝体之前，将-Arabinose加入1％浓度中。如附加文件所示1：图S4a，TRIRE2_104072表达高度诱导L.-阿拉伯糖培养基在亲本菌株中表达，而缺失菌株中几乎没有表达。这些表达式值对应于一个日志₂折折\（8.12 \ PM 0.23 \）在亲属的菌株之间L.- arabinose和D.-Glucose，并到日志₂折叠 - 删除和父母菌株之间的折叠变化 - 8.07±0.83L.-阿拉伯糖(平均值±标准差，\ (n = 2 \)）.要查看ARA1的调节是否受到影响，我们分析了细胞外的基因编码的表达\ \ upbeta \ ()牛乳糖,bga1，谁的表情L.-阿拉伯糖主要由ARA1调节[36]．然而，该基因的表达没有显著差异，因为它被诱导约3-4 log₂比较时折叠两种菌株L.- arabinose和D.葡萄糖(附加文件1:图S5a)。

为了进一步研究缺失的效果，我们将总蛋白质分泌和缺失和野生型菌株的生长进行了比较。尽管没有TRIRE2_104072，但在最小培养基上没有看到蛋白质产生的差异，1％L.-阿拉伯糖为碳源，或在以4%乳糖为碳源的废谷物提取物(SGE)培养基上(数据未显示)。废谷物提取物阿拉伯木聚糖含量高，已被我们用作生产纤维素酶和半纤维素酶的附加诱导剂[68那69]．在板上生长时，缺失菌株在最小培养基上没有改变的表型，1％L.-Arabinose（数据未显示）。在液体培养物中，父母和缺失菌株在最小培养基中同样地增长L.阿拉伯糖,D.半乳糖,D.-1％浓度为10％（附加文件1：图S5B）。小的增长改善，主要是由于滞后时间较短，被观察到1％D.-葡萄糖作为碳源，但我们没有进一步研究，因为效果很小(附加文件1：图S5B）。

由于这些通常使用的糖浓度大大高于(己糖为55.5 mM，戊糖为66.6 mM)K._{米yD.F4.y2Ba}Trire2_104072的值L.-阿拉伯糖(0.1-0.2 mM)，添加0.01%浓度相同的糖重复实验。这个浓度对应于己糖的0.555 mMD.葡萄糖和D.- 戊糖和0.666mm的戊糖D.木糖和L.阿拉伯糖。在这个浓度中，我们看到了缺失菌株的生长缺陷L.-Arabinose，而其他碳源的生长相似于1％浓度观察到（附加文件）1:图S5c)。类似的实验在L.-阿拉伯糖浓度范围为0.01 - 0.2%，表明该生长缺陷在浓度为或低于0.05%时观察到，对应于3.33 mM(附加文件1:图S5d)。这些实验证明了Trire2_104072具有高亲和力L.阿拉伯糖转运蛋白在t . reesei它只需要在一个很窄的浓度范围内生长。

虽然糖转运体在结构上是保守的，但它们的低序列相似性不允许仅根据序列判断底物特异性。转录组分析已被证明是有用的鉴定真菌糖转运体。在本研究中讨论的先前发表的转运蛋白中，PcAraT、NcLAT-1、PgAXT1和NcXAT-1是通过转录组技术鉴定的[16.那19.那54那70]．几种真菌转录因子的鉴定进一步促进了Transporter的鉴定，这些转录因子只在特定碳源上调节基因表达[71]．ara1，调节L.- arabinose和D.半乳糖代谢t . reesei，是这种转录因子的一个例子[36]．

由于XYR1和其他多种转录因子t . reesei已经被证明可以调节糖转运体的表达，我们假设ARA1也是如此。四个基因(Trire2_104072, Trire2_82309, Trire2_50894/)str1Trire2_47710 /stp1）表达最高L.- arabinose，两者在下调\（\三角洲\）ara1突变体（TRIRE2_104072，TRIRE2_82309）和其中一个\（\三角洲\）XYR1.突变体(str1）.我们注意到这些基因以类似的方式显着下降\（\三角洲\）ara1和\（\三角洲\）XYR1.QM9414突变体在以前的研究[72]．本研究以玉米秸秆或大豆皮为碳源，分析了基因在生长过程中的表达。在玉米秸秆上生长4 h后，Trire2_104072和Trire2_82309基因表达下调\（\三角洲\）ara1菌株和STR1\（\三角洲\）XYR1.应变（参见参考文献中的附加文件4[72])。用大豆壳作为碳源也得到了类似的结果，不同之处在于str1也在下调\（\三角洲\）ara1突变体。然而，该菌株的下调程度较弱\（\三角洲\）XYR1.突变体(日志₂在−7.8和−2.1之间进行比较\（\三角洲\）XYR1.或者\（\三角洲\）ara1突变体，分别和亲本菌株在4 h时间点)。

因为我们对细节感兴趣L.-Arabinose Transporters，我们将我们的研究专注于完全由ARA1调节的两种运输工具的研究，因为STR1和STP1都被证明运输D.葡萄糖(26.那30.那42]．STR1同时传输D.-木糖，但与D.葡萄糖(26.]．尽管它具有很高的亲和力D.- 葡萄糖，已经建议参与其中D.木糖和L.-阿拉伯糖转运，因为其缺失导致这些糖的生长缺陷[26.那29.]．

与其他高表达的基因相反L.-阿拉伯糖，第四个基因(Trire2_47710/stp1)在双缺失突变体中表达上调。双缺失突变体无法在上面生长L.阿拉伯糖(36[因此这可能是饥饿反应的一部分。与先前与培养的培养物相比，STP1已经观察到饥饿期间的上调，其同源物HGT-1N. Crassa.在饥饿期间也上调[30.那73]．另一种转运体Trire2_121482/STR2在双缺失突变体中也观察到类似的上调，在另一项研究中发现，Trire2_121482/STR2在饥饿条件下表达最高[26.]．然而,无论是stp1或者str2被上调\（\三角洲\）ara1或者\（\三角洲\）XYR1.\（\三角洲\）ara1在生长时发生突变D.- 糖乳糖，尽管这些突变体也不能在该碳源上生长。在这种情况下，新陈代谢D.- 由于STP1本身已被证明能够运输，但糖糖可能更受影响而不是其运输D.- 高水平表达并表达[40]．

从我们搜索特定的STR1和STP1排除后L.阿拉伯糖转运蛋白的t . reesei，只剩下Trire2_104072和Trire2_82309。根据系统发育和序列分析排除了Trire2_82309。我们对Trire2_104072的假设被TEVC分析证实是正确的，我们在那里观察到L.高亲和力的-阿拉伯糖运输。Trire2_104072及其p388h突变体XLT1也具有L.酵母中的-阿拉伯糖转运体。Trire2_104072的表达导致了较高的摄取率，但这种差异可能是由于P388H突变以外的其他原因(如XLT1密码子缺乏优化)。关于L.-阿拉伯糖吸收动力学，Trire2_104072似乎类似P. Chrysogenum.AraT,答:芥STP7和P. GuilliermondiiAXT1，如表所示1．它们都是高亲和力的L.- rabinose伴侣K._{米yD.F4.y2Ba}值范围为0.1-0.3毫米。有趣的是，已经确定了具有较高亲和力的运输扣（答:monosporaLat1,答:芥STP4和STP14)。由于已发表的研究中使用的表达系统(菌株、表达结构、融合标签)和检测条件(如pH值)的细节不同，直接比较V._最大限度值是不可能的。在一份报告中，将荧光蛋白或腺苷酸激酶包含在融合伙伴中增加了运输速率3-20倍，尽管在一些研究中没有差异或相反方向的差异，但在标记和非标记的转运仪之间看到了[53那74那75]．

在表中列出的几个运输商1被测试的L.- 在这项研究中吸收的arabinose。在两种不同的条件下测试了摄取，因为我们担心低底物浓度和高pH值是由于其高亲和力而有利于TRIRE2_104072L.阿拉伯糖和质子。然而，在两个测试条件下，它的表现都优于其他转运体。缺乏L.Trire2_82309的-Abinose运输将支持其对戊糖醇运输的参与，如系统发育分析的基础上假设，或在其他糖的运输中。基于表中列出的动力学值1那P. Chrysogenum.AraT,N. Crassa.LAT-1和P. GuilliermondiiAxt1应该能够吸收L.-Abinose比TRIRE2_104072更高，但情况并非如此。在原始出版物中，N. Crassa.LAT-1用GFP标记[20.]，这可能会增加上文所述的运输速率[53]．这LAT-1本研究中表达的cDNA序列也经过了密码子优化，与原始出版物中使用的cDNA序列相反[20.]．这也是一个例子P. Chrysogenum.一只老鼠和P. GuilliermondiiAXT1[16.那54]．的序列答:芥STP7.和答:monosporaLAT1和原始出版物中使用的是一样的，但是答:芥STP7.受到不同启动子的控制[18.那25.]．这些结果强调，从酵母摄取实验报告的动力学值受到表达和测定条件的强烈影响。

此外，测定方法和表达条件对其影响V._最大限度值，也有报道称pH值会影响K._{米yD.F4.y2Ba}运输商的价值[61那76]．此外，膜电位还受pH的影响，这反过来也会影响测量结果。在酵母吸收实验中不能控制膜电位，但在卵母细胞电生理研究中，TEVC可以很好地控制膜电位。卵母细胞被固定在一个特定的电压下，不受ph值的影响。TEVC方法的缺点是，它只能与电致转运蛋白一起使用，这些蛋白会移动净电荷，例如糖/质子同向转运体和离子通道。糖/质子协同机制允许糖以消耗质子穿过细胞膜所消耗的能量为代价，以降低其浓度梯度。这使得细胞内代谢酶与其底物的饱和，即使细胞外浓度很低[9.]．这在腐生真菌的自然环境中是有益的，在那里糖的浓度很低，这可以解释为什么许多真菌糖转运体似乎是共体，而大多数酵母糖转运体是被动的促进剂[45那77]．表中列出的大多数运输工具1使用质子Symport作为其机制，因此可以使用电生理学进行研究。

表中列出的一些运输工具1对其他一些糖有更高的亲和力L.阿拉伯糖,这表明L.-阿拉伯糖不是它们的主要底物。此外，大多数所列转运体都能转运其他糖类L.-阿拉伯糖，除了P. Chrysogenum.阿拉特和M. Thermophila.lat1(见表中的参考文献1）.据报道，它的运输能力L.- arabinose是常见的答:芥STP糖转运体:在STP家族的13个功能性成员中，除了一个以外，所有成员都有一些L.-Abinose运输活动[25.]．的t . reesei转运体Trire2_47710 (STP1)也被证明有轻微的L.- arabinose摄取活动，虽然L.- arabinose只是略微抑制D.-葡萄糖转运，因此被认为是该转运体的低亲和力底物[40那42]．这些结果表明了运输能力L.-Abinose可能在MFS单糖转运蛋白中普遍存在，并且需要动力学研究来研究哪些运输扣实际上是特定的L.阿拉伯糖。

关于运输器的抑制特性，低抑制L.- 阿布宁糖运输D.-Trire2_104072中观察到的葡萄糖是显著的（表1）2）.如前所述，抑制L.- arabinose和D.木糖运输D.-Glucose是酵母pentose利用的问题[9.].尽管上述残基的突变改善了Gal2的抑制特性(N376)，突变变体受到20-30%的抑制D.-葡萄糖，当其含量高出两倍时[58]．与Trire2_104072最接近的同系物L.-阿拉伯糖转运体，P. Chrysogenum.AraT，被两者抑制D.葡萄糖和D.-Xylose虽然它可以运输这些糖[16.]．具有与TRIRE2_104072最相似的抑制特性的运输器是答:芥STP7，其被更严重的抑制D.- Xysy比含义D.葡萄糖(25.]．其他列出的转运体大多受到强烈的抑制D.-Glucose或D.- 氧化糖，尽管抑制剂和底物的比例在研究之间强烈变化[15.那20.那54]．

基于其动力学参数和抑制特性，TRIRE2_104072可以是代谢工程目的的良好候选者。但是，如Bracher等人所示。[16.在比较PCARAT和SCGAL2的实验中，高亲和力，低容量转运仪作为唯一的表达L.-阿拉伯糖转运体可能限制生长速度相比，低亲和力，高容量的转运体的表达。另一方面，仅依赖低亲和转运体的过程在糖浓度降低时发酵速度减慢，其低特异性导致戊糖仅在之后才被消耗D.-葡萄糖被消耗掉了[78]．一种解决方案是同时表达高亲和性和低亲和性转运体，但由于许多高亲和性转运体利用糖/质子共转运机制，人们对无效循环的形成提出了担忧[78]．这是因为同位体允许糖在浓度梯度上的积累而牺牲ATP，而促进剂只是平衡浓度梯度。然而，我们观察到，在厌氧发酵过程中，表达Gal2和PcAraT的菌株比单独表达Gal2的菌株表现得更好，因此这些担忧可能只是理论上的[58]．在某些情况下，降低ATP产量（例如，通过徒劳的周期或利用权威者而不是促进者）可能是有益的，因为较少的ATP将针对生物量的形成[79]．还必须考虑由主动运输机制本身引起的能量负担，特别是在厌氧条件下。一种表达PCARAT作为唯一的菌株L.-阿拉伯糖转运体在厌氧条件下无法生长，可能是由于没有达到维持细胞所需的ATP生成速率[16.那58]．用更高的运输速率来表达一个同情者可能会解决这个问题。

除了可能成为改进的工具L.- 制导出发酵酿酒酵母，发现一个高度具体的L.-阿拉伯糖转运体也能照射到L.- 制导到代谢t . reesei．L.-Abinose存在于真菌的自然栖息地，作为细胞壁多糖的一部分，如阿拉伯辛酰亚胺，阿拉伯半乳酰亚胺和阿拉伯南纳，其中第一是在半纤维素中存在的果晶体和果胶中的其他部分[1那80]．负责它们降解的酶在反应中表达L.-Arabinose或其下游代谢物L.阿糖醇,66那80]．这L.-Arabinose响应是由Xyr1和ARA1内核的[36]．为了消除增长，需要删除这两个监管机构L.阿拉伯糖或D.-木糖，而单独缺失ARA1则抑制生长D.-Galactose [36]．ARA1的正交N. Crassa.（ARA-1）已被确定，其删除导致完全消除增长L.- arabinose和D.-半乳糖，而生长D.-木糖未受影响[38]．Downregulation的L.- 在中观察到--Abinose Transtor Lat-1\（\三角洲\）ARA-1突变和菌株LAT-1缺失被发现无法摄取L.- arabinose并减少阿拉伯兰的增长[38那70]．在t . reesei，删除先前提到的D.葡萄糖/D.发现-Xylose Transioner Trire2_50894（str1）严重降低两者的生长D.木糖和L.-阿拉伯糖及其糖醇衍生物[29.]，这可能表明它也有L.-阿拉伯糖转运活性。

关于TRIRE2_104072的重要性t . reesei，它似乎它在低位下发挥着更突出的作用L.- 我们在研究中注意到的浓度。在较高的浓度下，其功能可能由其他传送器（例如str1）补偿。已经表明1毫米L.-阿拉伯糖足以导致木聚糖酶基因的诱导t . reesei[66]，低于我们观察到生长缺陷（3.33毫米）的极限。这些结果表明糖迁移率t . reesei比我们之前认为的更精细。

哪些转运体负责促进生长还有待研究D.木糖和L.- arabinose在\（\三角洲\）XYR1.和\（\三角洲\）ara1突变体。我们可以假设STR1能够补偿trre2_104072运输活性的损失\（\三角洲\）ara1变异，但可能不是低变异L.阿拉伯糖浓度。同样的，Trire2_104072可以弥补STR1转运活性的损失\（\三角洲\）XYR1.突变体。然而，基因组t . reesei具有许多可能能够运输的非特征性转运体D.木糖或L.阿拉伯糖。

在这项研究中，t . reeseiD.-Xylose Transporter Trire2_104072显示为功能L.阿拉伯糖转运蛋白。对已发表的转录组数据的分析表明，Trire2_104072在含L.--abinose，其表达依赖于调节的转录因子ARA1的存在L.- arabinose和D.半乳糖代谢t . reesei．两个模型系统的研究，爪蟾和酵母，揭示了Trire_104072的运输L.-阿拉伯糖具有高亲和力D.-亲和度低的木糖。它对质子也有很高的亲和力，这确保了它可以在相对较宽的pH范围内工作。该缺失突变体仅在低浓度时存在生长缺陷，其生理作用为高亲和力转运体L.阿拉伯糖。在最初发现它的时候，Trire2_104072是第一个D.-木糖转运体的发现t . reesei，现在它成为第一个特定的L.-阿拉伯糖转运体，已从这个物种的特征。值得注意的是,L.TRIRE2_104072的-Abinose运输不太抑制D.葡萄糖和D.-木糖比其他已知的L.阿拉伯糖转运蛋白。因此，该转运载体对酵母代谢工程优化戊糖利用具有重要意义。

微生物介质，栽培和化学品

酵母菌株在富YPD培养基(1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%蛋白胨)中培养D.-葡萄糖)或合成完全(SCD-Ura)培养基(0.67%酵母氮基不含氨基酸，2%D.-Glucose，SC-URA辍学混合物）[81]．两种培养基都补充了2％琼脂制备固体培养基。酵母在30℃下生长，在250ml烧瓶中以50ml体积振荡230rpm。

对于生长和蛋白质生产的研究，t . reesei在含有15g / l kh的最小培养基上栽培₂宝_4.， 5 g/L (NH_4.）₂所以_4.， 1 mL/L的微量元素库存(FeSO_4.\ \ cdot \ ()7小时₂o 5 g / l，mnso_4.\ \ cdot \ ()H₂o 1.6 g / l，znso_4.\ \ cdot \ ()7小时₂O 1.4 g/L, CoCl₂\ \ cdot \ ()6小时₂o 3.7 g / l）具有指示碳源。SGE-乳糖介质是补充有40g / L乳糖的最小培养基，20g / L废籽粒提取物，100mM PIPPS和8.6g / L柠檬酸二铵，硫酸铵含有5.4g / L Na₂所以_4.．将两种媒体调整为pH 4.8，并在高压灭菌MGSO后_4.和cacl.₂分别加入2.4mm和4.1mm的最终浓度。固体培养基补充有20g / l琼脂和Triton X-100（适当时）以限制菌丝体的涂抹。用于制备孢子悬浮液，t . reesei在马铃薯右旋糖琼脂平板上生长3-5天，将孢子收集到含有0.8％NaCl的溶液中，0.025％吐温20和20％甘油，并将所得悬浮液储存在-80℃。

采用24孔平板培养进行蛋白生产和基因表达研究。孢子接种2\ \ cdot \ ()10.^5.每孔4 mL培养基中加入cfu/mL浓度，在informat微管培养箱中，28°C, 800 rpm摇晃，投掷3mm (Bottmingen，瑞士)。生长图谱使用Bioscreen C培养箱(Oy Growth Curves Ab Ltd, Helsinki, Finland)完成，每孔200µL培养基，孢子浓度与24孔平板研究相同。在28°C连续振荡(正常速度，最大振幅)下孵育。在24孔平板培养和生物筛选培养中，每个菌株分别使用3个和5个重复孔。

除非另有说明，否则从Merck Kgaa（Darmstadt，德国）和来自Thermo Fisher Scientific（Waltham，Ma，Ma，USA）的分子生物学试剂获得的化学品。L.-阿拉伯糖从Merck(达姆施塔特，德国)获得，乳糖从VWR(赫尔辛基，芬兰)获得L.鼠李糖和L.-Sorbose是从Fluka（夏洛特，NC，USA）获得的。

分子生物学方法

用KAPA HiFi聚合酶(Roche, Basel, Switzerland)进行高保真PCR，用DreamTaq聚合酶(酵母，大肠杆菌)或与Phire聚合酶(t . reesei）.用赛莫-费雪科学公司或NEB公司(Ipswich, MA, USA)的限制性内切酶进行限制性消化。大肠杆菌转化通过电穿孔完成，酵母转化通过Gietz和Woods描述的LiAc/ssDNA/PEG方法完成[82),t . reeseiPenttilä描述的转换等等。[83]．体外用MMESSAGE MMACHINE T7套件进行转录。引物是从Thermo Fisher Scientific获得的，他们列入了额外的文件1S1:表。

质粒和菌株构建

编码TRIRE2_104072和TRIRE2_82309的基因被命令为具有密码子优化的合成基因，用于酵母（Geneart，Thermo Fisher Scientific）中的异源表达。对于TRIRE2_104072，我们使用了来自RUT-C30基因组组装的版本（TRIRER-C30_33630; GENBANK ETS04871.1）。对于TRIRE2_82309（TRIRER-C30_26932，GenBank ETR97140）QM6A和RUT-C30基因组组件中的版本是相同的。用于TRIRE2_104072和TRIRE2_82309的酵母表达质粒用酵母MOCLO工具包构建[84]将含有pMA-T骨架基因的质粒以及MoClo质粒pYTK-2、-11、-51、-67、-74、-82和-84用酶消化BSA.I-HF®v2与T4连接酶连接(均来自NEB)。正如Lee等人所描述的那样，该反应在热循环器中同时进行[84]．得到的质粒，B11037和B11554（表3.)，用引物SaSS-19和-20测序。

基因编码P. Chrysogenum.ARAT（PC20G01790，GenBank Cap85508.1），P. GuilliermondiiAxt1（GenBank GZ791040.1）和N. Crassa.lat1 (NCU02188, GenBank XP_959582.3)是经过密码子优化的酵母表达合成基因(Twist Biosciences, San Francisco, CA, USA)。将基因通过Gibson组装(NEB)连接到pFL60上，得到的质粒(B11394、B11395和B11396)经引物SaSS-98和-99测序验证。

质粒B1687、B2013（pFL60）、B2251、B2253和B10862来自我们机构的菌株收集PGK1推动者和终结者，URA3酵母的选择基因及其2 μ m复制起源85]．B1687包含了XLT1与pFL60相似的pAJ401主链中的基因PGK1推动者，URA3和2μm的原点[14.].B2251包含答:monosporaLAT1修饰pFL60载体中的基因[18.]．B10862包含了答:芥STP7.PFL60中的基因，由vtt博士从含质粒的vtt博士建造STP7.cDNA由Ruth Stadler博士(University Erlangen-Nürnberg, Erlang, Germany)提供。B2253包含GAL2受控制的基因ADH1pVT100-U载体的启动子[86]．将酵母表达质粒转化到酵母菌株H2805中（CEN.PK2-1D：垫子\（\ upalpha \）URA3-52他3-\（\三角洲\）1leu2 - 3112trp1 - 289MAL2-8^CSUC2）在缺乏尿嘧啶的合成完全培养基上选择了转化体。

的表达式x光滑的卵母细胞，将卵母细胞表达载体Pol1修饰成与酵母MoClo系统兼容的表达载体。为了修饰MCS，将Pol1质粒进行酶切生态ri和BamHI在连接含有BSA.I位点，被同样的酶消化。该片段由SaSS-43和-44寡聚体退火构建。Pol1的mocloo兼容版本被命名为B10213BSA.I和两个生成的片段(Pol1包含一个内生片段BSA.我网站）凝胶纯化。用Trire2_104072插入物连接骨干片段，从PMA-T骨架中释放出来BSA.I.用T7启动子引物和SaSS-57引物对质粒B10219进行测序。

通过放大5'和3'侧翼区域来构建TRIRE2_104072的删除向量t . reesei具有引物Sass-101，-104，-155和-156的基因组DNA。根据套件指示，用易于DNA套件（Thermof Serior Scientific）制备基因组DNA。使用酵母菌菌株FY834，用酵母同源重组构建缺失载体[87那88]．为此，扩增子与PRS426骨架一起转化为酵母[89，被消化了生态ri和Xba我和凝胶提纯，并用Pyr4.如地主斯基描述的那样准备的碎片等等。[69]．将所得转化子聚集在一起，用玻璃珠提取质粒，然后用质粒微预处理转化成质粒大肠杆菌．从转化菌种中提取质粒，用T27、T60、T552、T553等引物进行酶切和测序验证。将含有正确序列(B11697)的质粒转化t . reesei生产菌株M44 [69]．利用引物T27、T60、SaSS-166、SaSS-167、SaSS-168和SaSS-169对转化菌种进行筛选，验证与Trire2_104072位点的正确整合。将正确的菌落纯化成同核体，再用PCR进行筛选。研究使用了由两个不同的转化子产生的孢子悬浮液，以及由M44制成的两个独立的孢子悬浮液作为生物复制。

mRNA的制备和x光滑的卵母细胞注射

含有Trire2_104072 CDS的基于pol1的质粒通过以下方法线性化：新人道I和体外转录成mRNA。转录后，根据试剂盒说明用LiCl沉淀纯化产物。

如Clemencon等人所述，卵母细胞通过手术获得[90]．简而言之，成年女性x光滑的青蛙被麻醉，用3-氨基苯甲酸甲酯甲磺酸盐（1g / L在冰水浆液中），用手术除去卵母细胞。卵母细胞悬浮在改性的Barth的培养基中²⁺(喜忧参半+ Ca²⁺；88 mM NaCl, 1 mM KCl, 2.4 mM NaHCO_3.1.57 mM MgSO_4.\ \ cdot \ ()7小时₂O、 0.66毫米纳米_3.， 0.75 mM CaCl₂10mM HEPES），其补充有青霉素和链霉素，卵母囊与镊子分离成3-4毫米。

用胶原酶处理卵泡细胞。用MBM-Ca冲洗卵母细胞²⁺(喜忧参半+ Ca²⁺没有CaCl₂)，然后将其悬浮于同一缓冲液(NB4, SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany)中，在摇床中孵育1小时。孵育后，重复洗涤和胶原酶处理步骤。最后用MBM+Ca冲洗卵母细胞²⁺和健康的阶段V-VI卵母细胞被挑选。

将卵母细胞用30ng体积或相同的水分注射30ng Tridle2_104072 mRNA。注射用Nanoject II微内注射器（Drummond Scientific，Broomall，Pa，USA）进行。注射后，卵母细胞悬浮在MBM + Ca中²⁺并在17℃下孵育3-7天。

电生理实验x光滑的卵母细胞

双电极电压钳（TEVC）技术用于电生理表征，该方法将卵母细胞的膜电位钳制到特定电压，并通过记录底物诱导的膜电流变化来测量转运[41]．测量完成了由2通道灌注系统组成的TEVC设置，OC-725C Oocyte钳位放大器（Warner Instruments，Hamden，CT，USA）和Axon Digidata 1440A数字转换器（Molecular Devices，San Jose，CA，USA）。系统用卵母细胞模型单元校准。微电极填充3米KCl，电阻在0.5-5米之间ω\ (\ \)被使用。使用pClamp软件套件(Molecular Devices)进行分析。ND-96无钠缓冲液(100mm胆碱，2 mM氯化钾，1 mM氯化钙₂\ \ cdot \ ()2 h₂o，1 mm mgcl₂\ \ cdot \ ()6小时₂O, 3 mM HEPES)进行实验。每个实验都使用至少来自两种不同青蛙的三个卵母细胞，除了稳态前动力学使用来自两种不同青蛙的两个卵母细胞。

对于目前的痕迹记录，卵母细胞灌注ND-96 (pH 7.4)并在−50 mV钳位。对于每种糖，先向卵母细胞灌注ND-96 (pH 7.4)直到电流稳定，然后再灌注ND-96 (pH 5.5)直到电流稳定，最后灌注ND-96 (pH 5.5)含5mm糖。然后注入ND-96 (pH 7.4)使电流恢复到基线。使用pClamp软件套件的Axoscope程序记录产生的电流轨迹。

使用pClamp软件套件的Clampex程序记录I-V曲线。在−50 mV下钳住卵母细胞，灌注测试液直至电流稳定，然后在−150 ~ 50 mV范围内采用200 ms步进变化的膜电位。对于每次测量，首先用缓冲液单独记录，然后用同样的缓冲液记录待分析的糖。每个测试电压在无糖情况下获得的稳态电流都从有糖情况下获得的电流中减去。在测量之间，注入pH 7.4缓冲液稳定卵母细胞。

通过在pH 5.5中记录具有5mm糖溶液的I-V曲线来测量选择性。对于动力学实验，I-V曲线录像用不同的糖浓度与pH5.5缓冲液进行。对于pH依赖实验，使用ND-96进行I-V曲线录制（5毫米L.-Arabinose）调整到不同的pH值。通过将所获得的电流除以在实验期间在-50mV中获得的最高负电流的所得电流计算归一化电流。动力学参数L.- arabinose和D.通过将归一化电流拟合作为底物浓度至michaelis-menten的函数来计算XylosysylyseyLose（Eq。1),\ (I_{马克斯}\)=最大电流，[S.] =衬底浓度和\ (K_m \)=米氏常数。周转数的计算(见下)，采用非归一化电流进行拟合，得到\ (I_{马克斯}\)．装配是用nls使用默认的高斯-牛顿算法。这K._{米yD.F4.y2Ba}和一世_最大限度数值以均数±标准差表示。

类似地计算pH依赖性的动力学参数，但数据适用于Hill方程（EQ。2),N是山丘系数和\（k_ {0.5} \）质子的浓度在哪里一世达到最大电流的一半\ (I_{马克斯}\)．

在不加糖的ND-96缓冲液中，采用不同pH值的I-V曲线分析了预稳态动力学。如前所述，稳态前电流被隔离[63]．稳定状态电流与时间相对于获得适配在以下Boltzmann关系的电荷转移（Q）集成（方程式。3.),问：=总电荷,\（q_ {hyp} \）=超极化极限下的电荷转移，\ (Q_ {dep} \)=在去极限的电荷转移，\（Q_{max}\）=\（q_ {dep} - q_ {hyp} \）那Z.=明显的价,V.=电压,\ (V_ {0.5} \)=电荷转移中点的电压，F=法拉第常数,R.=气体常数和T.=温度。运输替换数量定义为\ (I_{马克斯}/ Q_{马克斯}\)[63),\ (I_{马克斯}\)从米歇里斯-曼腾获得的最大电流是否适合动力学测量和\（Q_{max}\）值是在pH 5.5不加糖的情况下通过I-V曲线测量得到的。

糖吸收化验

放射性^14.颈- 1 -L.Moravek Biochemicals (Brea, CA, USA)的-arabinose (MC 2019，批号165-155-054- a - 2002015 - sb)用于运输实验。如前所述进行零反式吸收测定[33]．简单地说，在指数期收获酵母细胞，用冰水洗涤，在冰水缓冲液中重悬，得到40-60 OD/mL的细胞悬液。检测缓冲液为100 mM磷酸钾缓冲液(20°C pH 6.5)，但在pH较低的实验中使用100 mM柠檬酸钠缓冲液(20°C pH 4.5)除外。取等量的细胞悬液和糖溶液于28°C水浴中保存5分钟后，将40µL细胞与20µL 3x糖溶液放入锥形底玻璃管中混合。在所需的孵育时间后，用10ml冰水淬灭反应。用预湿Whatman GF/C滤纸过滤混合物(GE Healthcare, Helsinki, Finland)，再用10ml冰水冲洗试管。滤纸转移到装有4 mL Ultima Gold XR液体闪烁鸡尾酒(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)的闪烁小瓶中，用TriCarb 2810tr闪烁计数器(PerkinElmer)计数。空白测量糖与细胞表面的非特异性结合:20\（\ Upmu \）L 3x糖溶液和40\（\ Upmu \）将L细胞移液到10mL冰冷的水中，以与正常样品类似的方式处理。为了确保摄取在线性范围，比较了从两个不同的时间点获得的摄取率。

摄取率的计算方法是用空白计数除以反应时间(min)、酵母用量(OD)和放射性原液比活性(cpm/nmol)。OD与CDW的关系为0.252 mg_CDWod^-1．每个样品使用2至3个技术重复。特定摄取率定义为摄取率减去空白质粒对照菌株的摄取率。动力学结果采用非线性最小二乘的R包拟合Michaelis-Menten方程nls．

RNA提取和RT-qPCR

RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen，Hilden，德国）用于提取真菌总RNA。合并三种复制孔的培养物，并进行RNA提取，如前所述进行[33]．然后，用DNA酶I处理1μgRNA并用锚定的寡聚-DT引物与转录器第一链CDNA合成试剂盒（ROCHE）对其进行逆转录。QPCR用Sybr Green I Mix（Roche）与Trire2_104072一起完成bga1作为目标基因SAR1.和gpd1作为参照基因。的使用SAR1.为此目的，先前已提出建议[91]．引物在附加文件中列出1S1:表。

结果分析了\（\三角洲\）\（\三角洲\）C_P.李艾塔克和施密格的方法[92]．根据EQ计算折叠变化。4.,在那里δC_p \ (\ \)是之间的区别\ (C_p \)获得靶基因和参考基因的值（\（c_ {p，target} - c_ {p，control} \））.算术平均值\ (C_p \)使用内参基因的值。这个词\（2 ^ { - \ delta c_p} \）被定义为表达水平。获得的折叠变化是进一步的₂-转变了。

表达数据分析

表达数据来自基因表达式omnibus（Geo）数据库（登录号GSE104606）[93]，并与Benocci等发表的结果相关[36]．在文章中，t . reeseiQM9414及其\（\三角洲\）XYR1.那\（\三角洲\）ara1和\（\三角洲\）XYR1.\（\三角洲\）ara1突变体作为孢子接种到含2%的复合培养基中D.- 果糖作为碳源。生长20小时后（28°C，250rpm），用25mm洗涤菌丝体并转移至最小培养基L.- arabinose或25毫米D.- 作为碳源作为碳源。在最小培养基中孵育后，从菌丝体样品中提取RNA，用于RNA测序2小时。使用Illumina技术进行RNA测序[36]．

t . reesei选择已发表的糖转运蛋白用于分析。还包括少量推定的糖转运蛋白，其在先前的研究中表达了有趣的性质。已推出出版的糖运输车D.-葡萄糖转运体Trire2_22912 (HXT1) [45]，D.-Xylose促进器Trire2_63966（XLTR1）[32]，D.葡萄糖/D.-Xylose Transioners Tride2_50894（str1）[26.那29.]，trire2_121482（str2）[26.]和Trire2_62380 (STR3) [26.]，D.-Glucose / Cellobiose PropiLator Trire2_47710（STP1）[30.那42]，D.-半乳糖醛酸转运体Trire2_69026和Trire2_106330 [11.]，推定的乳糖转运仪TRIRE2_79202和TRIRE2_77517 [94，纤维二糖转运体Trire2_67752 [31]，D.木糖/纤维二糖D.- 营运运输机Trire2_69957 [44]和纤维二糖/乳糖转运体Trire2_3405（CRT1）[30.那33那43]推测的糖转运蛋白是Trire2106556，它是N. Crassa.低亲和力D.-Glucose Transioner GLT-1 [73， Trire2_82309已被证明在纤维素酶诱导条件下上调[95]，已经显示的TRIRE2_56684还被证明是含有纤维素酶的轻型基因组群的一部分cbh2和EGL2.其启动子已被证明与XYR1结合[37那47和最接近同源物Trire2_46819(与BLASTp同源性72%)N. Crassa.纤维仿生酸转运蛋白CLP-1/CBT-1t . reesei[96那97]．还报告了TRIRE2_56684和TRIRE2_46819在最近的报告中被转录因子AZF1调节[98]．但由于Trire2_63966在所有条件下的表达水平都较低，因此在图中略去。

系统发育分析

转运蛋白的氨基酸序列是从GenBank获得的（登录号被列入附加文件1：表S2）。使用肌肉进行序列比对[99]通过100个引导运行的最大似然方法进行系统发育分析[100.]．这两个步骤都是用MEGA X软件完成的[101.]．这棵树是用猿R包[102.]．对准的可视化是用的硕士学位使用肌肉方法包r [103.]．

本研究中生成的数据集可由通讯作者在合理的要求下获得。

伯尔尼大学的多丽丝·伦奇教授因使用她的青蛙设施而得到认可。PD博士Ruth Stadler因提供STP7 cDNA而被承认。彼得·理查德博士因构建并提供了B10862质粒而受到认可。此外，Matthias Hediger教授还感谢瑞士国家科学基金会(Swiss National Science Foundation Grant Sinergia #CRSII5 180326)对转运体电生理功能研究的支持。

该工作由芬兰学院资助（资金裁决第298392号决定）。Matthias Hediger教授承认瑞士国家科学基金会的电生理学研究给予Sinergia＃Crsii5 180326。

从属关系

1. 芬兰有限公司，Tietotie 2,02150，Espoo，芬兰的VTT技术研究中心

   Sami Havukainen，Mari Valkonen＆Christopher P. Landowski

2. 薄膜运输探索实验室，伯尔尼大学，弗莱堡大学伯尔尼大学，3010，瑞士伯尔尼

   Jonai Pujol-Giménez & Matthias A. Hediger

3. 瑞士伯尔尼Freiburgstrasse 15, 3010伯尔尼大学Inselspital生物医学研究部

   Jonai Pujol-Giménez & Matthias A. Hediger

贡献

SH设计了一些结构，进行了克隆，进行了分析并起草了手稿。JPG进行了获取卵母细胞的手术，参与了电生理学研究，并帮助起草了手稿。MV设计了表达Trire2_104072和Trire2_82309的构念，并对手稿进行阅读和评论。MH策划了这次合作，阅读并评论了手稿。CLP编辑了手稿，规划了合作并设计了一些研究。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

通讯作者

对应到克里斯托弗·p·Landowski．

伦理批准和同意参与

所有使用x光滑的动物符合瑞士动物福利法，并由当地兽医授权批准（AMTFürVeterinärwesenKantons伯尔尼;许可证号码：BE60 / 2018）。

同意出版物

不适用。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

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