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虾青素高产合成的代谢工程Xanthophyllomyces dendrorhous

摘要

虾青素是一种类胡萝卜素,在食品、化妆品和制药工业中有许多有用的资产。目前,它主要通过化学合成生产。然而,这一过程会导致生物可同化形式(3R, 3'R或3S, 3'S)占少数的对映体混合物。微生物生产(3R, 3'R)虾青素Xanthophyllomyces dendrorhous由于其快速的增长速度和易于大规模生产,是一个有吸引力的替代方案。为了增加x dendrorhous虾青素产量,随机突变菌株能够产生6至10 mg/g干质量;然而,它们往往是不稳定的。另一方面,也获得了定点突变株,但它们只增加了非虾青素类胡萝卜素的产量。本文深入分析了虾青素生物合成过程中代谢碳流的汇聚,并结合虾青素的生物学特性x dendrorhous具有可用的代谢,基因组,转录组和蛋白质组学数据,以及随机和定向突变体获得的知识,导致类胡萝卜素产量增加,我们提出了新的代谢工程目标来增加虾青霉素生物合成。

介绍

由于它们对人类健康的益处,类胡萝卜素患有生物技术重要性。它们是强大的抗氧化和抗炎剂,以及有效的UV辐射保护剂。此外,它们是视黄醇(维生素A)的前体和参与细胞再生的其他衍生物。因此,类胡萝卜素对食品,化妆品和制药行业有趣[123.4.5.].在生物技术潜力最大的类胡萝卜素中,有叶绿烯、番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄质和虾青素[16.7.].

虾青素(3,3 ' -二羟基-β, β ' -胡萝卜素-4,4 ' -二酮)可能是最有趣和最有价值的类胡萝卜素之一。据报道,它的抗氧化活性分别比β-胡萝卜素和α-生育酚高10倍和100倍[8.9.10].据估计,到2020年底,Carotenoids的营业额将销售额约为15.5亿美元。虾青素的销售额占总数的29%,年增长率为2.3%[11].2025年夏季斯坦属销售额估计为25.7亿美元[12].合成虾青素的价格在2500美元/公斤左右,而天然高纯度虾青素的价格上涨到10万美元/公斤左右[131415].

天然虾青素与人工虾青素的价值差异是由各来源所产生的对映体混合物的组成而产生的,这也与它们的生物活性有关。虾青素有三种可能的立体异构体:(3R, 3'R)、(3R, 3S)和(3S, 3S)。天然虾青素主要是(3S, 3’s)或(3R, 3’r),而合成虾青素包含所有三种可能的对映体形式(3R, 3’r), (3R, 3’s)和(3S, 3’s)的混合物,分别以1:2:1的比例[161718].由于对映体的混合,合成虾青素的生物活性相对较低[171819].另一方面,天然虾青素的对映体形式可能因生物而异;(3R, 3’r)是虾青素的主要立体异构体Xanthophyllomyces dendrorhous(无花果。1)(1720],而(3S,3的)形式主要由Haematococcus pluvialis[1721].

图1
图1

一种虾青素的化学结构(3R,3R)异构体所产生x dendrorhousB.虾青素生物合成途径的总体方案x dendrorhous.参与代谢途径的基因,酶和底物分别以红色,蓝色和黑色显示

Bernhart等人[16]分析了不同虾青素立体异构体在土壤中的自然积累Meganyctiphanes norvegica,以及两种不同种类的鲑鱼:大西洋鲑鱼(大西洋鲑)及太平洋鲑鱼(雄鱼tshawytscha).他们观察到(3S, 3S)-虾青素比(3R, 3'R)立体异构体(11-18%)积累更多(77-85%)。然而,Foos等人[17]报道了(3R, 3'R)和(3S, 3S)立体异构体(分别为90%和96%)在彩虹(雄鱼mykiss)及海洋(萨尔莫·特鲁塔)鳟鱼。同样,一项人类研究表明,对(3R, 3'R和3S, 3'S)立体异构体的吸收也相似[19].

就生物活性而言,施用于淋巴细胞和小鼠腹膜渗出物的非酯化(3S,3和3R,3'R) -22],促进细胞增殖,杀伤细胞,具有细胞毒和吞噬活性。非酯化(3S, 3S)立体异构体的免疫调节效应略高于其他异构体。(3R, 3'R)-虾青素作为脂质过氧化物还原剂在虹鳟鱼中具有比活性[23],抗氧化剂能够延迟老化[24],并在鸡体内增加免疫球蛋白和脾细胞增殖[25].

Xanthophyllomyces dendrorhous天然产约97%的非酯化(3R, 3'R)-虾青素[1426].相比之下,H.生红球藻产生(3S,3'S)以高产率 - 虾青素,但它是由棕榈酸,硬脂酸或亚油酸酯化[13141718],这需要通过脂肪酶水解在它可以同化之前。由于分子的复杂性和生物同化能力的复杂性,虾青蛋白酯的同化可能是可变的[161719].Storebakken等。[18]报道大西洋鲑鱼对虾青素二棕榈酸酯(47%)的吸收低于游离虾青素(64%)。

目前,虾青素大多是化学合成的;然而,微生物的来源是众所周知的。从前面几段可以推断,这种色素的主要生产者是酵母x dendrorhous还有微藻H.生红球藻[1122627282930].然而,由于难以获得足够的生物量及其低颜料产率,因此虾青素的微生物产生比合成素较低,因此来自适当的微生物来源的虾青剂是目前的生物技术挑战[11231].到目前为止,生物工程方法包括培养基和生物反应器优化[30],以及改良过度生产菌株的建设[123132],已经进行了测定。代谢工程酿酒酵母假丝酵母utilisPichia Pastoris.x dendrorhous增加了植物体内的番茄红素和β-胡萝卜素的含量,但并没有增加虾青素的生物合成[130333435].

在这里,我们设想新的代谢工程目标产生x dendrorhous能够将碳代谢通量转向虾青素生物合成的菌株。为此,随机和定向的基因改造x dendrorhous从基因表达的后果分析了其他酵母对虾青素产率的影响。

Xanthophyllomyces dendrorhous生物学

酵母x dendrorhous(也称为红法夫酵母在其大静脉状态下)是一种底漆,其响应于环境应力引起的脂氧化酸氧化而异常产生Xhortophyll [3637].除了颜料,x dendrorhous基因组编码大量的抗氧化酶,如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶[38].x dendrorhous生命周期是同宗配合并且特征在于母细胞与富多元醇介质中的芽(paedogamy)配合。交配后,非septated担子(holobasidium)与单核担孢子产生上其顶点形成[3738].这些担孢子导致二倍体营养细胞[394041.],尽管单倍体菌株已被鉴定为[42.].不像担子酵母,x dendrorhous在有性阶段不显示单细胞向丝状生长的转变。

几个基因组序列的阐明x dendrorhous株(19.5兆碱基,并且在CBS 6938菌株6385个蛋白质编码基因)显示每个基因的内含子的非典型高率(7.4-7.5)3842.].另外的基因组分析还揭示了两种主要的乙酰辅酶a衍生的生物合成途径,萜类和脂肪酸生物合成[42.].萜类化合物在x dendrorhous一样,在任何其他真菌,通过甲羟戊酸途径合成,并通常与麦角固醇合成结束。然而,如图中的接下来的部分,甲羟戊酸途径中x dendrorhous分叉,导致类胡萝卜素和甾醇途径。与其他雌激素的真菌不同,参与甾醇和类胡萝卜素生物合成的基因x dendrorhous未在集群组织。

虾青素的生物合成中x dendrorhous

虾青素来源于异戊二烯生物合成途径(图。1b)。糖酵解被引入到甲羟戊酸途径后,得到焦磷酸异戊烯基(IPP)[乙酰CoA产生的1720].IPP可通过双功能IPP异构酶(IDI).随后,通过FPP合成酶的作用合成香叶基焦磷酸(GPP)和法炔基焦磷酸(FPP)。ERG20).然后,用GGPP合酶介导的FPP与FPP的IPP连接(CRTE.),导致香叶酰香叶酰焦磷酸(GGPP)。两种GGPP分子通过四烯-β-胡萝卜素合酶(crtYB)会产生八烯。随后,用四种脱氢酶(CRTI.)合成番茄红素。二烯-β-胡萝卜素合成酶催化的两个环化步骤(crtYB)最终产生γ-胡萝卜素和β-胡萝卜素。虾青素的形成涉及虾青素合成酶氧化β-胡萝卜素(CRTS.)和细胞色素P450还原酶(CRTR.) [43.44.45.46.47.].虾青素生物合成后,脂蛋白将分子运输到生物膜中进行储存和细胞保护[6.].

甘油醛3-磷酸和丙酮酸也有助于甲戊酸途径,因为这些化合物的代谢通量产生乙酰辅酶a [48.49.50.].然而,丙酮酸和乙酰辅酶a也是氨基酸和脂肪酸的前体,也是三羧酸循环的底物(图)。1b)[51.].虽然这些衬底不能被排他地专用于虾青素合成,能够强调酵母,无论调制发酵条件或添加前体和辅因子,以改善虾青素的产率[3049.].

Xanthophyllomyces dendrorhous,尽管它具有高的虾青素积累能力,但显示出一些限制,阻碍了其合成[2652.].在甲戊二醇酯途径内,羟甲基戊齐芳基还原酶(HMG1),该途径的主要供应者(图。1B),是由产物调控的,因此,它是阻碍碳通量的限制性步骤[53.].此外,3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA,上述还原酶基板的积累对细胞有毒,这解释了参与其合成的基因的低表达水平。第二限制步骤是通过甲羟戊酸激酶催化的反应(ERG12)其表达受类异戊二烯产物调节的,主要是焦磷酸香叶酯和法尼基焦磷酸[54.].

在虾青素生物合成途径,植物-β-胡萝卜素合酶(crtYB)由于表达量低,也是虾青素积累的瓶颈[3355.56.57.58.].同样,细胞色素P450还原酶(CRTR.)已观察到参与虾青素生物合成最后一步的催化作用[51.56.59.60.61.].此外,当分解代谢物阻遏被诱导的类胡萝卜素的生物合成被失活。在x dendrorhous,Mig1已被鉴定为类胡萝卜素生物合成的分解代谢阻遏物[62.].

表格1显示了直接参与虾青素生物合成的酶和编码基因,以及它们的亚细胞定位x dendrorhous。

表1参与虾青素生物合成的基因/酶x dendrorhous

生物技术生产虾青素的研究x dendrorhous

Xanthophyllomyces dendrorhous是虾青素生产中应用最广泛的微生物,因为使用适当的底物,它是虾青素的主要类胡萝卜素(约占总量的85%)[26].然而,由酵母产生的虾青素产量低(在200 - 400µg/g的干生物量之间变化)和培养基成本高,阻碍了其作为大规模来源的使用[203046.63.].此外,虾青素的化学合成,就过程中所使用的物料而言,最终收率为8% [64.].这一值高于生物生产中的虾青素x dendrorhous相对于所采用的衬底,其成品率介于0.02至0.03%之间[163.65.66.].

为了使微生物生产更具竞争力,显然有必要提高产量[12303163.].优化了营养和操作发酵条件,以促进虾青素的生物合成x dendrorhous,其中碳源浓度(15.0 ~ 35.0 g/L)、氮(0.5 ~ 3.0 g/L)、pH(5.5 ~ 6.0)、温度(18.0 ~ 22.0℃)、溶解氧(20%以上)[293065.67.68.69.7071.],白光(177 μmol光子/m2×s) (1372.]和接种量(5-10%)[69.].溶解氧已经阐明作为最重要的因素之一x dendrorhous发酵。Wu等人。[73.,通过转录分析表明,25%的溶解氧供应导致2.5倍的crtYBCRTI.表达,增加1.5倍CRTR.CRTS.表达。关于营养要求,葡萄糖和硫酸铵是当用高C / N摩尔比(通常在40和76之间)时最大化虾青蛋白产生的优选碳(C)和氮气(N)源。45.46.51.].此外,谷氨酸和酵母/麦芽提取物增加了C/N对虾青素生物合成的同化[74.].

其他增加虾青素产量的策略x dendrorhous和其它酵母,甚至更希望的比发酵优化,被随机[生成75.76.或网站定向[303355.77.]过度生产突变菌株[8.3047.49.75.79.].

物理化学诱变x dendrorhous增加虾青素合成

已建立了随机诱变分离类胡萝卜素过剩的方法x dendrorhous菌株。这些策略包括酵母细胞暴露于物理和化学诱变剂[8.78.79.80],例如紫外线和伽玛辐射,1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(NTG) [8.45.79.8081/或甲烷磺酸乙酯(EMS)[2945.].由于这些策略会导致大量的突变菌落,因此有必要采用有效的选择方法来确定最佳突变体[68.79.].虾青素和/或甾醇生物合成抑制剂的培养基中,如β紫罗兰酮,二苯胺,酮康唑,咪康唑,2-甲基咪唑,克霉唑,烟碱,制霉菌素,洛伐他汀,吡啶,和NN-二乙胺有助于选择过量产生高于野生型水平类胡萝卜素的突变体,因为突变体增强的代谢途径(类胡萝卜素或生物合成前体)可以克服抑制剂引起的影响[78.79.].

桂丽等[4.)获得x dendrorhous通过EMS暴露酵母细胞,菌株Y119能产生6.4 mg虾青素/g干生物量。郑焕等[8.和Ang等[78.]报道了用NTG分别产生JH1和M34菌株。JH1的虾青素产量在干生物量4 mg/g以上,而M34的产量仅为0.5 mg/g,是野生型的2 ~ 50倍。这些结果表明随机诱变方法的输出具有很大的可变性[1772.].

以获得基因上的稳定x dendrorhous菌株,Chun等[82]进行了重组方法,在第一个实例中,本地菌株受到NTG的化学诱变。经抗霉素A诱导后,产生的菌株产生的类胡萝卜素高于1.6 mg/g的干生物量[46.79.]由于其化学性质,改变了电子传输链,因此,线粒体。这些生理学造成激活细胞防御机械,即类胡萝卜素的生物合成[79.].在选出最好的突变体后,它们通过原生质体融合进行基因回交,以消除有害的突变。所产生的杂交种大多稳定,能高产类胡萝卜素,产量大于2 mg/g的干生物量。

随机突变可能对细胞生理、活力、生长和代谢能力产生不可忽视的负面影响[45.79.83].由于活性细胞修复机制,这些突变体是不稳定的并且经常失去过量生产能力[79.8485].替代战略,以发展稳定的突变是敲除和/或使用基因位点特异性的分子工具[直接或间接地参与了虾青素合成的表达3075.86].

代谢工程x dendrorhous

提高代谢工程工具的可用性对发展的发展产生了重大影响x dendrorhous过度生产虾青素的菌株[1230313249.868788].这些菌株的设计原则是最大限度地从基本底物向虾青素生物合成路线的碳流,最大限度地减少不必要的副产物的产生(图。1b)[3149.51.88].通过发现代谢途径的关键酶和瓶颈,已经实现了将碳通量转向虾青素生物合成[313351.74.],优化相关基因的表达水平,从而增加细胞中虾青素的储存[3349.51.74.86].

除了可用性x dendrorhous基因组序列(42.,包含积极选择标记的高效综合载体,如nptII(G418)或hph(潮霉素),已开发(图。2).这些载体被用来敲除或过表达在强组成启动子控制下的基因。近年来,基因工程策略已在我国实施x dendrorhous增加异戊二烯的积累和随之产生的类胡萝卜素的生物合成[1230313249.868788].此外,Cre /LOX-P系统被用于在集成后去除选择标记x dendrorhous基因组[59.].这些分子工具,除了特征性遗传途径之外x dendrorhous,刺激了丰富的代谢工程文学[12303149.].

图2
figure2

代谢工程x dendrorhous类胡萝卜素生产过剩。一种酵母基因工程敲击与淘汰战略的代表。B.过度表达HMG1CRTE.crtYB用于高产量的植二烯[58.].C基因工程的x dendrorhous用于虾青素的高产生产。集成多个副本crtYBCRTS.分别增加β-胡萝卜素的产量及其向虾青素的转化[3389].D.高产量虾青素生产的代谢工程和常规诱变[66.].crtYBCRTS.基因使用遗传蛋白(G418)和潮霉素整合(hph)作为选择标记。然后,使用200μg/ ml NTG进行随机化学诱变。将化学诱变重复几轮,直至获得最大虾青素超额偿付器。获得的最佳应变,AXJ-20 /crtYB,能够产生9.7mg / g的干生物质以上

在下一节中,对阴极射线管讨论了编码类胡萝卜素生物合成途径的酶的基因家族。

过度表达/灭活的crtYB基因

代谢工程的主要目标之一是crtYB,这是一种编码四烯-β-胡萝卜素合成酶的基因1),具有植物环酶和β-胡萝卜素合成酶活性的双官能酶,负责植物和β-胡萝卜素合成[54.56.58.89].

叶绿烯是虾青素生物合成途径中的第一个类胡萝卜素(图。1b)。这种类胡萝卜素具有越来越多的市场,作为皮肤保护器和食品补充剂[90].x dendrorhous是这种化合物的潜在天然来源(表2,无花果。1B). Pollmann et al. [58.]引入的遗传修饰x dendrorhous以获得较高的产率。为了实现这一目标,CRTI.,以阻止碳流动,并允许植物烯积累(图。1b)。八氢番茄红素生物合成是由集成的4个拷贝进一步提高HMG1(编码羟甲-CoA还原酶)。此外,16个副本crtYB和4份CRTE.介绍了(图2B).由此产生的菌株能产生7.5 mg /g生物量的phytoene。在小规模的连续培养中,获得了更高的效率,叶绿素产量超过10 mg/g生物质。这一结果高于任何其他报告的生物体[58.],表明潜力x dendrorhous用于类胡萝卜素生物合成[30].

表2菌株x dendrorhous酿酒酵母通过基因工程过度生产类胡萝卜素/虾青素

探索敲门的后果crtYB带着一个nptII- 镶嵌综合盒,Visser等人。[33孤立的白人群体无法合成类胡萝卜素,这证明了胡萝卜素的重要性crtYB.这一结果证实了Verdoes等人的工作[55.是谁发现的crtYB是类胡萝卜素和虾青素生物合成的限制性步骤[43.44.45.47.49.].

认识到植物素-β-胡萝卜素合酶(crtYB),并保持基底肌活跃CRTI.功能,多副本crtYB被引入PR-1-104, ax dendrorhous已经过量产生β-胡萝卜素的随机突变体(1 mg/g干生物量)[89].在此遗传背景下,过表达叶绿烯-β-胡萝卜素合成酶后,β-胡萝卜素积累量比亲本高1.5倍。

在一项独立的研究中,Ledetzky等人[56.集成的2份和3份crtYB在不同菌株和,除了增加规范的类胡萝卜素,它们检测到新的类胡萝卜素的生物合成从未描述之前,3-HO-4-酮-7',8'-二氢β胡萝卜素。两种菌株能够产生大于0.7毫克类胡萝卜素干生物质,其中40%是虾青素/克。新的类胡萝卜素的生物合成由八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶可以在类胡萝卜素进行的环化反应的事实合理化。这种酶已经显示出采取八氢番茄红素和链孢作为底物催化β-玉米胡萝卜素,7,8-二氢β胡萝卜素的生物合成顺序,并且与参与CRTR.CRTS.[43.44.47.75.],3-HO-4-keto-7',8'-二氢-β-胡萝卜素(图。2b)[56.].CRTS.虾青素合成酶的编码,属于细胞色素P450家族[75.86,具有单加氧酶活性(催化β-胡萝卜素羟基化和酮化)。然而,CRTS.取决于CRTR.由于后者由于其还原酶活性,为虾青素合成酶提供必要的电子以催化基材氧合[75.86].

crtYB过度表达是增加类胡萝卜素生物合成的必要条件,但过度生产虾青素则需要过度表达虾青素合成酶(CRTS.) [75.].因此,Ledetzky等人[56.]生成一个x dendrorhous包含三个副本的菌株crtYB其中一个CRTS.,其虾青霉素生物合成增加至产生的总类胡萝卜素的70%(图。2C) [57.].

然而,所描述的类胡萝卜素合成的增加不足以与化学合成的生产成本竞争。因此,有必要探索参与虾青素生物合成代谢途径的其他基因/酶。

过度表达CRTI.基因

的基因CRTI.编码植物去饱和酶x dendrorhous,类胡萝卜素生物合成途径的第二种酶(图。1B).介绍几个副本CRTI.增加了细胞内番茄红素的积累[8991],它为酵母的粉红色生成粉红色。尽管预期β-胡萝卜素和虾青素,但它们实际上的浓度降低。然而,多烯和3-羟基-3,4-丁羟基-β,Ⅳ-胡萝卜素-4-ONA(HDCO;图。1B)中检测到[8991].这暗示了植物中过表达的phytoene去饱和酶x dendrorhous移位朝torulene生物合成(图1中的代谢通量。1b)[8089].

谢等[92],为了过度加强番茄红素,构建了一个酿酒酵母在体外异源表达的菌株进化出crtYBCRTE.CRTI.从基因x dendrorhous.他们第一次灭活crtYBx dendrorhous在将定向进化方案应用于失活细胞后crtYB,以及积极者CRTE.CRTI.,获得了能积累三烯合成酶活性的突变株,但β-胡萝卜素积累量降低。进化而来crtYBCRTE.,CRTI.被引入到酿酒酵母产生产生超过23mg番茄红素/ g干生物质的菌株。自从此以来,番茄红素积累是可能的酿酒酵母不表达虾青素合成酶(CRTS.),负责虾青素生物合成、HDCO和虾青素生物合成途径的其他有害副产物(图。1b)。

类似地,Yamada等人[93)建造了一个酿酒酵母菌株YTPH499/Mo3Crt79在96 h内产生6.01 mg β-胡萝卜素/g干生物量CRTE.,一份crtYB和一份副本CRTI..所有基因从分离x dendrorhous

根据讨论的结果,有必要找到不将碳流转移到Torulene,HDCO或不需要的副产物的合成的代谢工程替代品,但是允许虾青蛋白作为主要产物的积累。

过度表达CRTS.基因

虾青素合成酶,编码CRTS.x dendrorhous与细胞色素P450还原酶一起(CRTR.),催化虾青素途径将β-胡萝卜素转化为虾青素的最后一步。这是夏日蛋白生物合成中的限制步骤。如前所述“crtYB基因过表达/失活”部分,CRTS.单加氧酶活性(催化β-胡萝卜素羟基化和酮化)是否取决于CRTR.活动(75.86].

Gassel等[66.]进行额外副本的整合crtYBCRTS.x dendrorhous基因组增加虾青蛋白产生(图。2d)。然后,进行与NTG(200μg/ mL)的随机化学诱变。将存活的菌落暴露于相同的处理,直至分离出最大的虾青素生产者,AXJ-20 /crtYB。This strain was able to produce > 9.7 mg astaxanthin/g of dry biomass, after isolating it in 200 µg/mL triazine-containing media. Chemical mutagenesis could alter other genes involved in astaxanthin biosynthesis [66.].出于这个原因,有必要确定获得的菌株的转录和蛋白质组配置文件。

Contreras等人[75.产生了两个新的x dendrorhous包含一种(xs_1h1s)或两种(xd_2h2s)副本的菌株CRTS..对照菌株UCD 67-385的虾青素产量为128µg/g干生物量,Xs_1H1S和Xd_2H2S 96 h虾青素产量分别为154µg/g和179µg/g。x dendrorhous已被额外的副本转换CRTS.CRTE.使用Cre-LOX-P系统(图。3.).该菌株,XD-ES,能够增加上述毫克,分别0.47 mg / g和0.55干生物质/ g的β胡萝卜素及虾青素的产率[59.].然而,获得的产量还不足以与化学合成或通过随机诱变获得的改良微生物源生产的虾青素竞争。

图3
图3

整合额外的副本CRTE.CRTS.使用酶Cre /LOX-P系统 [59.].Cre -loxP重组系统允许选择标记回收持有的短暂的表情cre(编码Cre重组酶)由一个不稳定的载体控制,可选择的标记两侧loxP位点随着Cre载体被移除

CRTS.徒一起CRTR.[75.86]为了产生虾青素,有必要探索这两个基因的过度表达[49.51.].

的重要性CRTR.在类胡萝卜素代谢途径中

CRTR.编码细胞色素P450还原酶,参与虾青素生物合成途径的最后一个限制步骤x dendrorhous[61.].正如在"crtYB基因过表达/失活”部分,CRTR.为虾青素合酶提供电子,催化β-胡萝卜素氧化,从而合成虾青素[75.86].为了探究CRTR.CRTS.及其在化合物生物合成中的重要性,Alcaíno等[86]灭活CRTR.在两种野生菌株中x dendrorhous, CBSTr和T13。由于无法合成虾青素或只能合成少量虾青素,两个菌株的颜色都是苍白的,但β-胡萝卜素的积累浓度分别为114和50 mg/L。亲本菌株只能产生9 mg/L的β-胡萝卜素和100 mg/L以上的虾青素。这些结果揭示了……的重要性CRTR., β-胡萝卜素的减少导致β-胡萝卜素的积累,并同时停止虾青素的生产[86]. 此外,两种野生型菌株中产生的缺失对β-胡萝卜素产量的影响不同。这些结果还表明,即使在野生动物中x dendrorhous由于相同的基因修饰对每个工程菌株的代谢能力的影响不同,因此可能存在高度的多态性[4086].

一些作者说,它是不可能获得的x dendrorhous过度生产的突变体由于低CRTR.表达水平。有必要对其规律进行整体研究CRTR.CRTS.,它们共同作用于将β-胡萝卜素转化为虾青素,因为它们仅被单独研究[86].此外,有十三个细胞色素P450基因[94其产物为单加氧酶,可参与初级和二级代谢(如甾醇生物合成、类胡萝卜素生物合成和芳香化合物降解)。Alcaíno等[94]描述了编码属于细胞色素P450家族的另外两种单加氧酶的基因,它们参与甾醇生物合成:CYP51CYP61(分别编码羊毛甾醇14- α去甲基化酶和C-22固醇去饱和酶)。自CYP51CYP61也参与麦角甾醇的生物合成,它们有能力减少生产虾青素的可用碳通量(图。1b)。

Yamamoto等人[88报告了一个完整的CYP61删除一个x dendrorhous二倍体的压力。这一结果是一种很有前景的策略,可以减少麦角固醇的生物合成,从而增加虾青素生物合成的碳通量(图。1B),获得比亲本菌株高1.4倍的虾青素产量。这种代谢工程策略基于这样一个事实,麦角固醇,脂质生物合成的产物,是一种抑制剂ERG13HMG1,在甲羟戊酸的合成中起作用(图。1B).此外CYP61破坏野生型x dendrorhous菌株增加了HMG1虾青素生物合成过程中表达量从2倍到5倍[95].有必要深刻地研究细胞色素P450单加氧酶,因为其他一些基因可以直接或间接相关的虾青素的代谢途径[57.79.889495].

异源宿主的虾青素生物合成

虾青素生物合成已在酿酒酵母通过整合编码必要的酶机机械的异源基因。周等人。[96]生成一个酿酒酵母株(YastD-01),其能够以高收率生产虾青素(高达8.1毫克/克干生物质)的。作为第一步,他们建立了一个β胡萝卜素通过异源表达生产菌株CRTE.CRTI.crtYBx dendrorhous.随后,他们表示CRTZ.支架H.生红球藻CRTZ.编码β-胡萝卜素羟化酶,对角黄素转化为虾青素进行催化。支架编码β胡萝卜素酮酶,其催化β胡萝卜素转化为角黄素[96].两者的插入H.生红球藻基因导致了8.1毫克的虾青素/ g生物质的产率,但事实证明是(3S,3'S)立体异构体。这种基因工程方案的图形表示示于图。4..同样,江等人。[97产生了重组酿酒酵母通过引入卡拉(同源crtYBx dendrorhous) 和CRTI.从基因Blakeslea Trispora.CRTZ.金橙黄农杆菌克里斯泡囊短波单胞菌,编码β-胡萝卜素keetolase(非编码x dendrorhous基因组)CRTE.水松媒体.的转换酿酒酵母菌株仅能产生20 mg虾青素/L,且经过几轮物理诱变和对过氧化氢的适应。经过15轮筛选后,最佳菌株分批生产> 65mg虾青素/L,而在补料分批生产体系中获得的最高浓度为404.78 mg/L。

图4
装具

中国的代谢工程酿酒酵母对于虾青素(3S,3)过量生产[96].β-胡萝卜素过度级数酿酒酵母通过异质表达获得菌株CRTE.CRTI.crtYB从基因x dendrorhous.随后,CRTZ.支架从微藻H.生红球藻被表达。CRTZ.β-胡萝卜素羟化酶的编码,催化角黄素转化为虾青素。支架β-胡萝卜素酮醇酶的编码,催化β-胡萝卜素转化为角黄素

在(3R, 3’r)-虾青素过剩方面,还没有达到令人满意的水平。表格2综述了国内外虾青素生物合成代谢工程的研究进展x dendrorhous酿酒酵母.迄今为止虾青素产量最高约为10 mg/g生物量。自x dendrorhous是具有天然酶促虾青素生物合成机制的微生物,是代谢工程中最有潜力的选择。然而,仍有必要更详细地研究碳通量和存在于这个生物系统的代谢限制,这是我们在这篇综述中追求的目标。

代谢策略将碳通量增加到虾青素生物合成在x dendrorhous

目前,代谢工程是一门新兴的学科x dendrorhous尚未导致竞争性夏令生(3R,3'R)过度突变体。除了使用甲烷,柠檬酸盐,谷氨酸,琥珀酸盐,甘油和其他分子作为参与夏令生生物合成的酶的电感[3074.9899]因此,有必要确定糖代谢和碳流中的三羧酸循环对类胡萝卜素生物合成的影响[48.49.].这些信息可以用来识别参与那些增加虾青素积累通量的代谢途径的酶。

例如假丝酵母utilis酿酒酵母和其他酵母,发现HMG-CoA还原酶和GGPP合酶表达水平受到强烈限制,随后,限制了类胡萝卜素和虾青素生物合成可用的甲戊酸和类异戊二烯衍生物的水平[30313549.100].类似地,这可能是碳通量进入的原因之一x dendrorhous可以还原为类异戊二烯、脂类和类胡萝卜素的生物合成(图。1b)。

x dendrorhous,其中,phytoene-β-胡萝卜素合成酶是取代其底物GGPP生物合成虾青素代谢通量的关键因子[303133].如果没有足够的底物虾青素合成,碳通量转移到类异戊二烯和固醇的生物合成(图1b)[303142.].已经证明,编码Squalene合酶的基因的失活c . utilis同时,HMG-CoA还原酶的过度表达使类胡萝卜素的生物合成增加了2倍[303135].同样在酿酒酵母,减少监管ERG20通过灭活角鲨烯合酶并通过过度表达增加GGPP合成CRTE.,导致类胡萝卜素合成的增加[31].此外,如前面提到“Crtr在类胡萝卜素代谢途径中的重要性章节,Yamamoto等人[88证明了完全删除CYP61(C-22固醇去饱和酶x dendrorhous增加HMG1表达水平从2倍到5倍[95],进而增加虾青素生物合成的碳通量(产量超过1.4倍)。这是由于麦角甾醇生物合成的减少,这是一种抑制剂ERG13HMG1活动(无花果。1b)。此外,CYP61删除在x dendrorhous导致增加SRE1表达量(约为野生型菌株的3.5倍)[101激活萜类生物合成的代谢途径,从而产生虾青素和麦角甾醇前体。

然而,由于它们的细胞内积聚可能是有毒的,因此高产类胡萝卜素可能会影响细胞[49.52.].然而,增加宿主积累大量脂质的能力是可能的[102]使用定向进化技术[32[过过表达基因,其编码参与细胞膜柔韧性的酶。在酿酒酵母,已观察到过表达硬脂酰coa 9-去饱和酶可使积累番茄红素的能力提高30% [103),而overexpressingino2编码涉及对生理胁迫的反应中涉及的转录因子,增加了脂质和衍生物(包括番茄红素)的能力增加了10%[104].

确定哪些代谢机制会影响植物体内类胡萝卜素和虾青素的生物合成x dendrorhous,对过量产生的菌株进行了蛋白质组学和转录组学分析[76.81].barachano - torres等人[76.],利用NTG对野生型菌株进行随机诱变,获得了比亲本菌株多合成2.5-8.8倍虾青素的XR4突变体。突变株的蛋白质组学图谱与野生型菌株的蛋白质组学图谱一致90%;然而,他们发现NADP(H)依赖的谷氨酸脱氢酶1 (GDH1)和udp -葡萄糖醛酸脱羧酶下降;NADP(H)依赖性谷氨酸脱氢酶3 (GDH3)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GPDH)、二氢脂酰脱氢酶和可能的吡啶合成酶的增加。GDH1和GDH3分别参与铵态氮同化和谷氨酸生物合成[43.105106].谷氨酸最近被证明有助于碳和氮同化,这增加了虾青素的生物合成[106107].另一方面,二氢脂酰脱氢酶参与三羧酸的代谢,这就是为什么它促进活性氧的生成和随后的类胡萝卜素的生物合成,以应对氧化损伤[76.108].GPDH与糖溶解期间的高能分子生产有关,并且可能触发其他氧化反应,包括导致细胞凋亡的那些。响应于这种氧化损伤,转录夏令生生物合成中涉及的基因[44.51.].udp -葡萄糖醛酸脱羧酶与糖的代谢和同化有关,这就是它维持细胞完整性的原因[76.109].这些酶的过表达可能在过度发育菌株的产生中起重要作用。XR4突变菌株的转录组分析(能够超过2.5-8.8倍的虾青素比野生型菌株)[76.81]表明,它过表达CRTE.CRTS.,CRTI.在3级和3倍以上的控制菌株。但是,基因的表达水平如IDI变量,而crtYBCRTR.表达量甚至低于对照菌株。根据类胡萝卜素和虾青素生物合成相关基因的表达水平,CRTS.行动对虾青素生物合成至关重要CRTR.是否可以在这个过度生产者的非限制水平上表达x dendrorhous拉紧。然而,这是CRTR.表达水平可以是可变的,并且不同的突变菌株之间的限制,因为它们的多态性[4086]以及将碳通量转移到不同代谢途径的不同能力[84].

Pan等人[106结果表明,使用76:1的C/N比是提高虾青素浓度的关键x dendrorhousUV3-721突变菌株。与在低19:1 C / N比下观察到的比较,它们发现1.5至2.5倍以下的GRG2,天冬氨酸前体前体,晶状体酶,3-异丙基钠脱氢酶和二硫化物异构酶前体。他们还观察到磷酸甲基 - 吡啶激酶的六倍过度表达,3.3倍的虾青素合成酶,以及IPP异构酶和丙酮酸脱羧酶的过表达。另一方面,在这项研究中,与巴巴契等的结果不同。[76., GPDH的表达减少了10倍。这可能是由于高碳氮比作为代谢应激源诱导类胡萝卜素的产生,而不是在三羧酸循环中产生高能分子。此外,其他关键酶如丙酮酸脱羧酶、IPP异构酶和虾青素合酶的过表达与类胡萝卜素前体和虾青素的生物合成密切相关[51.59.].

培养0.368克/升谷氨酸的策略在培养基培养物中,保留了高76:1 C / N比[74.].由于GDH的活性,谷氨酸以2-酮戊二酸的形式参与三羧酸循环。正因为如此,它是碳和氮同化的活化剂,为细胞提供能量,并导致虾青素生物合成增加40% [74.76.].在此条件下,通过蛋白质组学分析发现,植物中多表达了2 ~ 2.5倍的三磷酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、甘油酸和甲酸脱氢酶、IPP脱氢酶和细胞色素P450还原酶。二氢山酚4-还原酶、3-异丙基苹果酸脱氢酶和虾青素合酶也过表达1.3 - 1.5倍。这些数据通过评估相应的表达水平得到了证实。这些酶在虾青素的初级和次级代谢中发挥着关键作用,对虾青素的生物合成具有明显的影响。这就是为什么在生成虾青素过量菌株的代谢工程过程中考虑它们是重要的[74.].

蛋白质组分析表明,通过三羧酸循环中产生的氧化应激是在增加参与虾青素生物合成基因的表达水平的一个关键因素,以及前体化合物的[51.74.76.106].Wozniak等人使用琥珀酸盐(20 g/L)作为碳源[98]诱导虾青素生物合成,得到的虾青素比以葡萄糖(20 g/L)为碳源时多2.5倍。通过转录分析表明,经过指数生长期后,琥珀酸提高了表达水平crtYB(4.2 - 4.5倍),CRTI.(1.7- 1.8倍)和CRTS.(高达1.3倍),而使用葡萄糖作为碳源[98].

此外,降低Mig1的表达水平x dendrorhous导致两倍增加crtYBCRTS.表达水平(62.].然而,据观察,表达CRTI.突变株比野生型低(−2倍)。自CRTS.CRTR.在虾青素生物合成中同时工作(图。1答案:BCRTS.过度表达和维持非限制性CRTR.表达水平(76.86],导致虾青素生物合成增加5.5倍。

Mig1是分解代谢阻遏结合特定的DNA序列称为“Mig1“在酵母中各种葡萄糖抑制基因的启动子区域的盒子[62.98].mig1联盟网站crtYBCRTI.已被确定,而在监管区域检测到两个站点CRTS.基因[98].Mig1受磷酸化调控。在没有葡萄糖的情况下,Mig1被Snf1激酶磷酸化,并分配到细胞质中。然而,在葡萄糖存在的情况下,细胞内的信号级联激活了Mig1的去磷酸化,随后Mig1向细胞核迁移,在那里它与转录辅阻遏复合物结合[110111].因此,降低Mig1的表达水平是增加虾青素合成碳流量的一种选择x dendrorhous

利用植物细胞分裂素6-苄基胺嘌呤(6-BAP)诱导的细胞分裂加速[112],Pan等人[51.]的生物量达到3.33 g/L,虾青素产量达到4.67 mg/g干生物量。经过6- bape处理的酵母的代谢组显示了糖酵解的诱导作用(尽管碳水化合物消耗的速率降低了),以及三羧酸循环的抑制,阻止了碳流转向不需要的代谢途径。6-BAP还引发氧化应激,导致海藻糖生物合成(从葡萄糖)增加和虾青素的积累,以应对高浓度的活性氧[51.113114].

6-BAP处理的转录分析x dendrorhous的虾青素生物合成基因的过表达显示出[51.].HMG1IDI表现出明显的3.5倍的过度表达,而CRTE.增加了两倍。CRTS.crtYB有1.7和增加两倍,分别[51.].CRTI.,在发酵过程的中间,表达1.35倍的表达增加,但最后它降低到其基础水平[51.].重要的是要注意维护的必要性CRTI.表达水平接近于基本水平,因为增加其活性可以将碳通量转向torulene和HDCO的生成[8991].对于甲戊酸和类胡萝卜素生物合成的碳通量最大化,6-BAP对所有这些基因的调控显著提高了后续虾青素积累的底物可用性[53.].

HMGR和NADPH的合成在甲戊酸代谢途径中对类胡萝卜素前体的合成也很重要[49.115116117].在三羧酸循环代谢工程的可能情况下,NADPH的过量生产[49.50.118],通过柠檬酸合酶、琥珀酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶的过表达,以及苹果酸脱氢酶的过量产生,增加类胡萝卜素前体的积累,推动碳通量向虾青素生物合成方向发展x dendrorhous

x dendrorhousSre1作为固醇调控元件结合蛋白(SREBP)的功能[101119].Sre1的转录因子结构域(n端结构域)具有一个DNA结合基序[120]和c端结构域(调控结构域)与一种名为SCAP (SREBP裂解激活蛋白,简称Scp1)的蛋白相互作用酿酒酵母),当细胞水平足够时,它会抑制固醇的生物合成。当固醇水平下降时,Sre1 - scp1复合物被运输到高尔基体,导致Sre1释放,并转位到细胞核。然后,参与甾醇生物合成的基因转录被激活[121],同时类胡萝卜素的生物合成减少[86].然而,SRE1缺失抑制甾醇和类胡萝卜素的生物合成[101119].gutierrez等。[119的n端结构域过表达SRE1增加1.5,表达式增加两倍ERG13HMG1.这可以作为异戊二烯过量生产的替代,以增加虾青素的生物合成。

在重组carotenoids-producing酿酒酵母,甲戊酸激酶(ERG12)和法尼基焦磷酸合酶(ERG20)最近已被确定为类胡萝卜素生物合成中类异戊二烯积累的限制因素[122].使用CRISPR / CAS9 [32122], 一种酿酒酵母能够积聚高达11倍的异戊二烯。ERG12ERG20,与酿酒酵母,可以产生虾青素生物合成的瓶颈x dendrorhous

上述基因组,转录组和蛋白质组学数据,表明必须将碳通量增加达到虾青剂生物合成。了解甲戊类化途径及其异戊二烯产品饲料类胡萝卜素生物合成[172049.51.,有必要同时过度表达HMG1ERG12ERG20IDI编码限制FPP积累的酶的基因,类胡萝卜素生物合成的主基材。尽管后者已经进行了酿酒酵母y lipolytica,这种代谢工程计划尚未进行x dendrorhous.如果FPP积累增加,则有必要进行第二步,增加直接参与虾青素生物合成途径的基因的表达[3351.55.56.57.58.59.61.].低活性crtYBCRTR.CRTS.在虾青素和它们的过表达也可以防止类异戊二烯产物的积累,从而避免了如甾醇抑制的产品的效果的合成的主要瓶颈。

在其他重要的考虑因素中,减少蛋白质的分解代谢抑制Xdendrorhous激活类胡萝卜素/虾青素生物合成的整个代谢机制,这是一个由失活引起的过程米格1.然后,增加crtYBCRTS.表达水平(62.110111].

过表达硬脂酰基-CoA 9去饱和酶(OLE1)已被证明可增加类胡萝卜素生物合成底物的积累[103或相反地,删除CYP61增加虾青素生物合成底物的可用性,避免了甾醇的抑制[88].另一方面,参与三羧酸循环的过表达酶如NADPH氧化酶、柠檬酸合酶、琥珀酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶可能增加碳通量[49.50.51.118虾青素的积累。

氧的存在,包括活性氧如H2O.2,刺激产生类胡萝卜素的虾青素和作为保护机制的响应于氧化细胞损伤[69.123124125126].鉴于此,建议关闭酶的机制来逃避活性氧,使类胡萝卜素/虾青素的生物合成成为主要的抗氧化反应。因此,关掉CTT1,它编码过氧化氢酶x dendrorhous,以及敲除编码超氧化物歧化酶的基因(SOD1)和谷胱甘肽过氧化物酶,可进一步诱导虾青素的生物合成。在x dendrorhous,四份CTT1已被发现[126].在酿酒酵母,已经发现了由基因编码的谷胱甘肽过氧化物酶的巨大多样性ure2.GPX1GPX2GTT1和/或hyr1p[126能够防止细胞内氧化损伤。

另一个潜在的强大的战略,有利于在二次代谢x dendrorhous从而促进类胡萝卜素和虾青素的生物合成就是使生物系统在整个发酵过程中处于持续的氧化应激状态。利用关于H的加法所获得的知识2O.2作为虾青素生产的诱导剂[123就有可能获得一种能够产生H2O.2自主。在担子菌门真菌的基因组中,葡萄糖-甲醇-胆碱(GMC)氧化还原酶超家族包括产生细胞外H2O.2用于降解植物结构多糖,如木质素、纤维素和半纤维素[127128].在这个超家族中可以发现葡萄糖氧化酶(GOX)、葡萄糖脱氢酶(GDH.)乙醇/甲醇氧化酶(艾灸),芳醇氧化酶(阳极氧化铝),吡喃糖2-氧化酶(P2O)、吡喃糖脱氢酶(PDH)和乙二醛氧化酶(GLX).异质地表达这些基因中的一些x dendrorhous另外,淘汰必需的还原剂(过氧化氢酶,超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶),以避免氧化损伤,可能有利于虾青素的过量生产。

结论

如上所述,有许多不同的策略来获得基因工程x dendrorhous类胡萝卜素生产的菌株高收益率[3249.56.59.61.66.].然而,β-胡萝卜素和(3R,3'R) - Xastaxanthin产率仍然低。显然有必要产生更多的知识,这些知识解决了夏令生生物合成途径的局限性[51.62.74.].

随机突变使用物理和化学试剂[8.2966.71.78.导致x dendrorhous菌株增加虾青素产量[66.].然而,靶向基因通常是未知的,这对过度生产(3R, 3’r)虾青素的新的代谢工程方案的发展是不利的。

类胡萝卜素途径的相关基因已被诱导增加虾青素的生物合成,但结果还不够。有必要像这样使其他基因失活CYP61和/或米格1.(后者涉及分解代谢抑制),此外,诱导蛋白质结构域,如SRE1n端,与类胡萝卜素/虾青素代谢间接相关[62.95110111120121].但是,有必要直接计算多重转换x dendrorhous增加(3R,3'R)的脂肪蛋白产生。虾青素产量的改善是一个要求。

新的代谢工程策略x dendrorhous(如这篇综述和其他人提出的)可以实施和研究,以获得更多和新的具体信息,直接或间接地涉及虾青素生物合成的其他调控机制,从而实现一种能够高产生产该化合物的基因修饰策略。

数据和材料的可用性

不适用。

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下载参考

确认

我们感谢来自匿名审稿帮助提高了稿件的宝贵意见。

基金

这项工作得到了COECYTJAL-Mexico(9141-2020)的支持。Alejandro Torres Haro是conacyte - mexico(783291)的博士奖学金获得者。

作者信息

从属关系

作者

贡献

AT-H收集数据并起草手稿。AT-H, JV, MRK, MA-P对数据进行分析和讨论,并准备最终稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应于Melchor Arellano-Plaza

道德宣言

伦理批准和同意参与

提交人宣布同意参加工作并根据职业道德标准进行。

同意出版

所有作者同意将作品提交出版。

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。资助方没有参与这项研究的设计;收集、分析或解释数据;在手稿的写作,或在决定发表结果。

额外的信息

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

权利和权限

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引用这篇文章

托雷斯-哈罗,A., Verdín, J. Kirchmayr, M.R.et al。虾青素高产合成的代谢工程Xanthophyllomyces dendrorhous活细胞的事实20.175(2021)。https://doi.org/10.1186/s12934-021-01664-6

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关键字

  • 虾青素
  • 类胡萝卜素
  • 生物色素
  • 代谢工程
  • Omics-based工程
  • Xanthophyllomyces dendrorhous