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结合蛋白质和代谢工程策略的生物合成褪黑素GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba

抽象的GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

褪黑素由于其在医学应用和作物改良方面的良好前景而受到广泛关注。微生物生产褪黑激素是一种更安全、更有前景的替代化学合成方法。由于与褪黑激素生物合成相关的基因簇编码的蛋白质不溶性或酶活性低,研究人员未能在普通异体宿主中产生高产量的褪黑激素。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

本研究成功地建立了一种合成褪黑激素的基因通路GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba通过组合辐射出血生物合成基因GydF4y2Ba链霉菌属albulusGydF4y2Ba和编码苯丙氨酸4-羟化酶(P4H)的基因GydF4y2Ba黄定GydF4y2Ba和咖啡酸3-GydF4y2BaO.GydF4y2Ba- 甲基转移酶(COMT)来自GydF4y2Ba奥雅萨苜蓿GydF4y2Ba.通过平衡异种蛋白的表达和添加3%的甘油,褪黑激素的产量提高了三倍。进一步进行蛋白质工程和代谢工程,以提高转化率GydF4y2BaNGydF4y2Ba-Cetylserotonin(NAS)到褪黑激素。含C303F和V321T突变的COMT变体的构建增加了褪黑素的五倍。而且,删除了GydF4y2BaspGydF4y2Ba基因增加了COMT不可或缺的辅助因子s -腺苷蛋氨酸(SAM)的供应,使褪黑激素的产量增加了一倍。最终工程菌株EcMEL8在摇瓶中产生了879.38±71.42 mg/L和136.17±1.33 mg/L的NAS和褪黑素。在2-L生物反应器中,添加色氨酸后,EcMEL8产生1.06±0.07 g/L NAS和0.65±0.11 g/L褪黑素。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

本研究建立了一种新型组合抗褪黑素生物合成的组合途径GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba并提供了改善褪黑激素分泌的替代策略。GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

褪黑激素是一种古老而普遍的分子[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba],广泛分布于几乎所有生物类群,包括微生物、植物和动物[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba].褪黑激素被认为是自然界最通用的生物信号之一,它的功能已经与有机体多样化分歧[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba].由于它的多种功能[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba],褪黑素在医学应用和作物改良方面都显示出良好的前景[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba].褪黑素作为一种非处方药和膳食补充剂已在世界范围内广泛使用多年。目前,商业褪黑素依赖于化学合成,这既不可持续,也不环保[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba].褪黑激素的微生物生产是一种更安全,更有前途的替代方案,基于对褪黑激素生物合成途径的理解[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

褪黑素的生物合成途径首次在动物身上被阐明[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba].在动物中,褪黑激素是从色氨酸通过5-羟色氨酸(5HTP)合成,五羟色胺(5HT),和GydF4y2BaNGydF4y2Ba- 乙酰苯甲酸替肽(NAS)中间体。因此,四种酶,包括色氨酸-5-羟化酶(TPH),色氨酸脱羧酶(TDC),血清素GydF4y2BaNGydF4y2Ba乙酰转移酶(SNAT)GydF4y2BaNGydF4y2Ba- 乙酰苯甲酸甲酰胺甲基转移酶(ASMT),参与催化过程[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba].在植物中,褪黑素的生物合成也从色氨酸开始,包括四个酶的步骤。然而,植物褪黑素生物合成过程与动物褪黑素生物合成过程在以下几个方面存在差异[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba].首先,酶的第一步是色氨酸脱羧,而不是像动物那样的羟化[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba].第二,随后的步骤是5-HT的合成,其通过催化色胺5-羟化酶(T5H)GydF4y2Ba15GydF4y2Ba].第三,除了ASMT,咖啡酸o -甲基转移酶(COMT)是另一种参与褪黑激素合成的酶,而咖啡酸o -甲基转移酶在动物中是缺失的。值得一提的是,COMT在转化的催化效率明显高于ASMTGydF4y2BaNGydF4y2Ba-acetylserotonin褪黑激素。催化效率(GydF4y2BaV.GydF4y2Ba马克斯GydF4y2Ba/ KGydF4y2BamGydF4y2Ba)的COMT活性是ASMT的709倍GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba,表明COMT在褪黑激素合成中起关键作用[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba].因此,在植物中,总共六个酶,即,TPH,SNAT,ASMT,TDC,T5H,和COMT,涉及褪黑激素的生物合成途径的,这表明褪黑激素的生物合成的复杂性[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba].除了经典途径,替代途径,其中血清素是第一GydF4y2BaO.GydF4y2Ba- 甲基化,由此产生的5-mt是GydF4y2BaNGydF4y2Ba-acetylated,最近被提出,进一步增加了复杂性褪黑激素生物合成途径[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba].与动物和植物的研究数量相比,关于微生物生物合成途径的研究很少,尽管褪黑素被认为最早在数十亿年前就在细菌中出现了[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba].涉及微生物中褪黑素生物合成的酶和相应基因仍然是几乎未知的。GydF4y2Ba

因此,在基因工程细菌中建立褪黑素生物合成途径所需的几乎所有基因都是从动植物中克隆出来的[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba].Germann等[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]成立于重组酵母从头褪黑激素的生物合成途径。在这项工作中,编码TPH基因是从任GydF4y2Ba智人GydF4y2Ba或GydF4y2Ba血吸虫曼森。GydF4y2Ba同时克隆了TDC和ASMT基因GydF4y2Ba智人,GydF4y2Ba编码SnAT的基因被克隆GydF4y2BaBos Taurus。GydF4y2Ba最近,罗等人。建立了重组褪黑激素生物合成途径GydF4y2Ba大肠杆菌。GydF4y2Ba编码TPH和ASMT的基因被克隆GydF4y2Ba智人GydF4y2Ba并克隆了TDC和SNAT基因GydF4y2BaCandidatus Koribacter Versatilis.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba链霉菌属griseofuscusGydF4y2Ba分别为(GydF4y2Ba21GydF4y2Ba].在其它尝试以产生在褪黑激素GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba在美国,编码SNAT和ASMT的基因从几种动物和植物中克隆出来。当这些来自哺乳动物和植物的酶在GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba,表达水平极低或表达产物是无活性的,这限制了原核细胞中的褪黑激素的高产量[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

迄今为止,尚未确定参与褪黑素生物合成中的基因簇。然而,一种负责物质激胺生物合成的基因簇GydF4y2Ba链霉菌GydF4y2Ba含有前三种基因,它们编码产生NAS的酶,NAS是褪黑激素的直接前体[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba].火山油,首先在西非豆类的种子中发现了一种色氨酸衍生的杂环生物碱。作为一种有效的乙酰胆碱抑制剂,海洋病毒含量广泛用于治疗青光眼和阿尔茨海默病,但仍有关于其原位功能和生物合成途径的研究[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25GydF4y2Ba].经过大规模筛选,研究人员发现了放线菌的水下培养GydF4y2Ba链霉菌属griseofuscusGydF4y2Ba和GydF4y2Ba链霉菌属pseudogriseolusGydF4y2Ba可以产生物理量的[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba].2014年,Liu等人[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba发现了这个基因簇GydF4y2BapsmA-HGydF4y2Ba负责毒豆碱的生物合成GydF4y2Ba链霉菌属griseofuscusGydF4y2Ba.其中,GydF4y2BaPsmHGydF4y2Ba和GydF4y2BaPsmFGydF4y2Ba需要用于NAS生物合成从5-HTP,其与褪黑激素通路共享的起始。基于所述毒扁豆碱生物合成途径,在本文中,一种新颖的生物合成途径褪黑激素产生成立于GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba.此外,采用代谢工程和酶工程策略优化生物合成途径,与第一代菌株相比,将褪黑素的生产得到11倍的11倍。GydF4y2Ba

材料和方法GydF4y2Ba

细菌菌株和媒体GydF4y2Ba

本研究中使用的所有细菌菌株列于表中GydF4y2Ba1GydF4y2Ba.GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba以Trans1-T1 (TransGen,中国北京)为宿主菌株进行质粒构建和繁殖。GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaBW25113GydF4y2Ba∆tnaAGydF4y2Ba用于蛋白表达和体内l -色氨酸羟化褪黑激素。为了有效地生物合成褪黑素,基因组修饰GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaBW25113GydF4y2Ba∆tnaAGydF4y2Ba利用λ红重组菌株[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba].含有10g / l胰蛋白胨,5g / L酵母和10g / L NaCl的Luria-Bertani(LB)培养基用于细胞培养和酶表达。改性的M9培养基(M9Y)用于来自L-色氨酸的5-HTP和褪黑激素的体内产生[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba].M9Y培养基中含有10 g/L葡萄糖、2 g/L酵母提取物、6 g/L钠GydF4y2Ba2GydF4y2BaHPO.GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba,为0.5g / L的NaCl,1g / L的NHGydF4y2Ba4.GydF4y2Bacl,3.5 g / l khGydF4y2Ba2GydF4y2Ba阿宝GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba, 246.5 mg/L MgSOGydF4y2Ba4.GydF4y2Bah·7GydF4y2Ba2GydF4y2BaO, 14.7 mg/L CaClGydF4y2Ba2GydF4y2Bah·2GydF4y2Ba2GydF4y2BaO, 27.8 mg/L FeSOGydF4y2Ba4.GydF4y2Bah·7GydF4y2Ba2GydF4y2BaO,和2g / L柠檬酸钠二水合物。含有(每升)10g葡萄糖,8g(nhGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)GydF4y2Ba2GydF4y2BaHPO.GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba, 13.3 g KHGydF4y2Ba2GydF4y2Ba阿宝GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba, 1.2 g MgSOGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba·7HGydF4y2Ba2GydF4y2BaO,1.7g柠檬酸,10ml含有的痕量金属溶液(每升5米HCl)10g FesoGydF4y2Ba4.GydF4y2Bah·7GydF4y2Ba2GydF4y2BaO, 2.25克ZnSOGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba·7HGydF4y2Ba2GydF4y2Ba1克CuSOGydF4y2Ba4.GydF4y2Bah·5GydF4y2Ba2GydF4y2BaO, 0.5 g MnSOGydF4y2Ba4.GydF4y2Bah·5GydF4y2Ba2GydF4y2Bao,0.23g naGydF4y2Ba2GydF4y2BaB.GydF4y2Ba4.GydF4y2BaO.GydF4y2Ba7.GydF4y2Bah·10GydF4y2Ba2GydF4y2BaO, 2g CaClGydF4y2Ba2GydF4y2Bah·2GydF4y2Ba2GydF4y2BaO,和0.1g的(NHGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba莫GydF4y2Ba7.GydF4y2BaO.GydF4y2Ba24GydF4y2Ba.必要时加卡那霉素50 ug/mL,氨苄青霉素100ug/mL,氯霉素17 ug/mL。GydF4y2Ba

表1研究中使用的菌株和质粒GydF4y2Ba

DNA操纵GydF4y2Ba

本研究中使用的所有质粒列于表中GydF4y2Ba1GydF4y2Ba本研究中使用的所有引物用于PCR中列出了附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2BaS1:表。从相应菌株中克隆出XcP4H (NCBI参考序列:WP_011035413.1)、TfP4H (NCBI参考序列:WP_028838552.1)、HeP4H (NCBI参考序列:WP_013332010.1)、phhB (GenBank: RMS51283.1)、folM (GenBank: EFM2067767.1)、SaPsmH (GenBank: AIA00687.1)和SaPsmF (NCBI参考序列:WP_020929557.1)基因。SaP4H (W199F突变体)(NCBI参考序列:WP_016572394.1)、CtP4H (W239F突变体)(NCBI参考序列:WP_012354318.1)、SaCOMT (NCBI参考序列:WP_016577150.1)和OsCOMT (NCBI参考序列:XP_015650053.1)基因的密码子均由Generay公司(中国上海)优化合成。所有质粒均采用Gibson组装法,使用克隆express MultiS One Step Cloning Kit (Vazyme, Nanjing China)进行组装。质粒的构建在附加文件中GydF4y2Ba1GydF4y2Ba.将参与蛋氨酸循环的天然启动子替换为Anderson启动子No。J23108 (ctgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc)和缺失GydF4y2BaDCM.GydF4y2Ba和GydF4y2BaspeGydF4y2BaD基因经λ红重组。用克隆表达试剂盒(ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit)组装目标序列。来代替GydF4y2BaMtn勒克斯,metFGydF4y2Ba和GydF4y2BametKGydF4y2Ba基因进行PCR,以获得所述上游区域,含有FRT两端,该启动子和RBS和基因的ORF的开头作为下游区域中的根抗性基因。然后,组装上述PCR产物以获得靶基因。根据λ-红色重组方案,各种GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaBW25113GydF4y2Ba∆tnaAGydF4y2Ba构建衍生物。敲门声GydF4y2BaDCM.GydF4y2Ba和GydF4y2BaspGydF4y2Ba基本上以与上面描述的相同的方式进行。目的基因用于缺失GydF4y2BaDCM.GydF4y2Ba和GydF4y2BaspGydF4y2Ba将上游区域、两端含有FRT的kan抗性基因和下游区域依次连接。GydF4y2Ba

产生褪黑素GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaBW25113GydF4y2Ba∆tnaAGydF4y2Ba

将产生褪黑激素的菌株置于100 mL LB培养基(500 mL摇瓶)中,37℃,200 rpm至ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba达到0.6。酶的诱导浓度为0.1%GydF4y2BaL.GydF4y2Ba阿拉伯糖。30°C、200 rpm、8 h后,4°C、5000×离心收获200 OD细胞GydF4y2BaGGydF4y2Ba10分钟。该感应细菌的颗粒悬浮在含有2g / L色氨酸,将4g / L甲硫氨酸20种毫升M9Y介质(50毫升烧瓶)(和3%甘油在必要时),并在30℃和200rpm下生长。样品在3小时,6小时,12小时,24小时,48小时,72小时,和96小时收集,和5-HTP的浓度,NAS和褪黑激素通过HPLC分析。乙酰辅酶A试剂盒(Solarbio,北京,中国)用于检测乙酰辅酶A. BIOSCREEN C(实验室系统赫尔辛基,芬兰)的浓度来测量的成长曲线GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaBW25113。GydF4y2Ba

5-羟色胺的生产GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaBW25113GydF4y2Ba∆tnaAGydF4y2Ba

大肠杆菌GydF4y2BaBW25113GydF4y2Ba∆tnaAGydF4y2Ba用所述的pBAD-Sa5HTP,的pBAD-Xc5HTP,的pBAD-Tf5HTP,的pBAD-He5HTP和的pBAD-Ct5HTP质粒转化。上述(生产的褪黑激素)如所描述的,并收获200 OD诱导的培养物中和悬浮在20毫升含2克/升色氨酸M9Y介质的并生长在30℃和200rpm下培养方法是相同的。样品在上述并用HPLC分析的时间点收集。GydF4y2Ba

喂养批量发酵和优化GydF4y2Ba

取细胞板上单个Ec-MEL8菌落接种于5 mL LB培养基中,37℃,200 rpm培养过夜。然后,将1% (v/v)的培养物转移到100 ml LB培养基(500 ml烧瓶)中,在37°C和200 rpm下培养约8-10小时。5% (v/v)的培养物转移到2 L的生物反应器(BXBIO,上海,中国)和1 L的加料分批培养基中。通过自动投料30% (v/v) nhh, pH控制在6.8GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba反应温度为37℃。通过1 vvm(风量/工作量/分钟)供气和自动控制搅拌速度至700转/分,溶解氧浓度保持在20%以上的空气饱和度。当初始10 g/L葡萄糖消耗后,添加500 g葡萄糖和10 g MgSO的饲喂液GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba·7HGydF4y2Ba2GydF4y2Ba每升o定期添加。当od.GydF4y2Ba600GydF4y2Ba在培养基中加入4 g/L色氨酸、6 g/L蛋氨酸和3% (v/v)甘油,在培养基中加入L-阿拉伯糖至终浓度1 g/L诱导培养。采集样品,测定生物量浓度(OD)GydF4y2Ba600GydF4y2Ba)和葡萄糖浓度(SBA-40E生物传感器分析仪(生物学研究所,山东省科学院,中国))和HPLC分析。对于优化的条件下,将培养物时诱发ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba诱导12 h后,在培养基中加入6 g/L色氨酸、10 g/L蛋氨酸和3% (v/v)甘油。GydF4y2Ba

HPLC分析和LC / MSGydF4y2Ba

L.GydF4y2Ba-色氨酸来自西格玛(圣路易斯。那USA), 5-HTP from Aladdin (Shanghai, China), NAS from Sigma and melatonin from Aladdin (Shanghai, China) were used as the standards. The standards and the supernatant concentration of tryptophan, 5-HTP and NAS were measured after dilution of the samples with methanol/water (15:85 v/v). For analysis of melatonin, standard and supernatant of cultures were diluted to a final concentration of methanol/water (40:60 v/v). The samples were filtered through a 0.22-μm nylon filter and then analyzed by HPLC (Agilent 1260 series, Hewlett-Packard) using an Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 column (4.6 × 100 mm, 3.5-Micron). Tryptophan, 5-HTP and NAS were quantified under 275 nm UV detection with methanol/water (15:85 v/v) as the mobile phase. Melatonin was quantified under 290 nm UV detection with methanol/water (40:60 v/v) as the mobile phase. NAS and melatonin were identified by QTRAP 6500 and AB SCIEX using Gemini 3 µm NX-C18 110 Å (50 × 2 mm) with 95% methanol (containing 0.1% formic acid) and 5% water (containing 0.1% formic acid) (v/v).

结果和讨论GydF4y2Ba

亚褪黑素生物合成途径的概念设计凭借物理量途径GydF4y2Ba

在原核生物中寻找色氨酸衍生物时,我们发现了三种毒豆碱生物合成中间体(5-HTP, 5-HT和NAS)GydF4y2Ba链霉菌属albulusGydF4y2Ba由褪黑激素生物合成共享。设计了对抗褪黑素生产的新型生物合成途径的对抗性途径(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba).在藻毒碱生物合成的第一步催化步骤中,提出以TPH催化5-羟色胺的生成。然而,编码TPH的基因不包括在毒扁豆碱生物合成基因簇中,在报告中未被明确鉴定。在动物中,TPH和苯丙氨酸4-羟化酶(phenylalanine 4-hydroxylase, P4H)是两个具有高度序列相似性的芳香氨基酸羟化酶(aromatic amino acid hydroxylase, AAAHs)亚群。TPH同源物的BLASTP分析GydF4y2Ba美国albulusGydF4y2Ba基因组显示一个推测的AAAH,具有典型的P4H特征(SaP4H)。据报道,一些细菌P4Hs对苯丙氨酸和色氨酸都有活性。此外,少量残基的取代(如W179F取代)导致P4H的首选底物由苯丙氨酸转变为色氨酸[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba].因此,利用SaP4H建立5-HTP生物合成途径。其他细菌的P4Hs替代品,包括GydF4y2Ba黄定GydF4y2Ba[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba],GydF4y2BaHalomonas elongataGydF4y2Ba那GydF4y2BaThermoMonas Fusca.GydF4y2Ba,GydF4y2BaCupriavidus taiwanensisGydF4y2Ba[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]GydF4y2Ba那GydF4y2Ba还选择催化褪黑激素生物合成的第一步。编码PSMH和PSMF同源物的基因选自GydF4y2Ba美国albulusGydF4y2Ba建立褪黑素生物合成的第二和第三催化步骤。在褪黑素生物合成的最后一步,有两种酶ASMT和COMT具有催化活性。ASMT作为一种甲基转移酶,最初在动物和植物中发现,其酶活性较低,表明其在褪黑激素合成中具有限速酶的作用[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba].此外,NaS和褪黑激素的ASMT是非竞争的,并竞争地由其产物S-腺眼囊肌细胞(SAH)抑制[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba].与ASMT,COMT相比,植物中发现的甲基转移酶[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba],O-甲基酯NAS对褪黑激素,催化力高于ASMT的催化力(100倍)[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32GydF4y2Ba].因此,COMT的从GydF4y2Ba奥雅萨苜蓿GydF4y2Ba(OsCOMT)是优选的酶,并且该酶表现出最高的活性,用于将NAS到褪黑激素如初报道GydF4y2Ba12GydF4y2Ba].在GydF4y2Ba美国albulusGydF4y2Ba在美国,通过BLASTP分析发现一个可能编码COMT的基因,与OsCOMT的序列同源性最高。然后选择产生的SaCOMT和OsCOMT来确定褪黑素生物合成的最终催化步骤。GydF4y2Ba

图1GydF4y2Ba
图1GydF4y2Ba

褪黑素生物合成途径。TPH energy,色氨酸羟化酶;5-HTP 5-Hydroxytryptophan;TDC,色氨酸脱羧酶;SNAT, 5 -羟色胺GydF4y2BaNGydF4y2Ba-acetyltransferase;ASMT,GydF4y2BaNGydF4y2Ba-acetylserotonin甲基转移酶;COMT,咖啡酸GydF4y2BaO.GydF4y2Ba甲基转移酶;山姆,S-adenosylmethionine;长官,S-adenosylhomocysteineGydF4y2Ba

首先,我们设计了一种新的褪黑素生物合成途径GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba基于毒豆碱的生物合成途径。这四种蛋白质GydF4y2Ba美国albulusGydF4y2Ba,即SaP4H、SaCOMT、SaPsmF和SaPsmH作为可溶性重组蛋白表达良好GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba.在这些基因中,编码SAP4H和SACOMT的基因根据GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba密码子偏好,而编码SAPSMF和SAPSMH的基因未得到优化。5-HTP生物合成模块和COMT涉及褪黑激素生物合成的第一和最后步骤。根据之前的报道,提出了这两个步骤是褪黑素生产的速率限制,并首先进行了测试[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

工程生物合成模块以生产5HTPGydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba

5-HTP生物合成模块以三种方式设计(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一种)。首先,发现W179F取代以将P4H的优选基底从苯丙氨酸转变为色氨酸,因此提高其TPH活性。因此,将W179F取代引入各种P4Hs(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab),将编码W179F突变体的基因在阿拉伯糖诱导的araBAD启动子控制下克隆到pBAD载体中。其次,构建了四氢单丙蝶呤(MH4)循环体系,为P4Hs提供辅助因子。编码PhhB的基因GydF4y2BaP.铜绿假单胞菌GydF4y2Ba和FolM从GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba克隆并插入pBAD质粒中编码P4Hs W179F突变体的基因下游(图)。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一种)。得到的质粒命名为PBAD-SA5HTP,PBAD-XC5HTP,PBAD-TF5HTP,PBAD-HE5HTP和PBAD-CT5HTP。第三,GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba突变株(缩写EcGydF4y2Ba∆tnaAGydF4y2Ba),其中GydF4y2BaTNAA.GydF4y2Ba删除编码色氨酸酶的基因,阻断色氨酸和5-羟色胺酸的降解,生成(图2)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一种)。将PBAD-5HTP质粒转化到EC中GydF4y2Ba∆tnaAGydF4y2Ba拉紧GydF4y2Ba那GydF4y2Ba所有重组蛋白均表达良好(附文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图。S1A)。分析并比较了这些菌株中色氨酸至5-HTP的全细胞生物分析。如图所示。GydF4y2Ba2GydF4y2Bac,添加色氨酸后,所有菌株均能产生5-HTP,证实5-HTP生物合成模块建立成功。然而,含有SaP4H的菌株GydF4y2Ba美国albulusGydF4y2Ba显示5-HTP产量最低。似乎假定的P4H-W199FGydF4y2Ba美国albulusGydF4y2Ba可能会表现出对色氨酸较低的催化活性。它也有可能是其他未知的色氨酸羟化酶参与在色氨酸中5-HTP的毒扁豆碱生物合成期间的转换。所述XcP4H-W179F显示出优异的催化活性朝向色氨酸(图GydF4y2Ba2GydF4y2BaC),这与以前的报告一致。以色氨酸为原料,摇瓶生产⁓500 mg/L 5-HTP。因此,XcP4H-W179F作为后续路径工程中的5-HTP生物合成模块。GydF4y2Ba

图2GydF4y2Ba
图2.GydF4y2Ba

原核P4Hs催化5-HTP的形成GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba.GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba5-HTP的生物合成途径GydF4y2Ba大肠杆菌Δtnaa.GydF4y2Ba.GydF4y2BaB.GydF4y2Ba部分P4H比对结果。P4Hs的序列和功能域高度保守,箭头为色氨酸突变为苯丙氨酸的位点。GydF4y2BaCGydF4y2BaP4H对重组蛋白5-羟色胺生成的影响GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba.采用高效液相色谱法测定5-羟色胺酸的含量,数据为3次重复实验的平均值±标准差GydF4y2Ba

COMT过表达使NAS产生褪黑素GydF4y2Ba

两个编码COMT的基因来自GydF4y2Ba美国albulusGydF4y2Ba和GydF4y2Bao .漂白亚麻纤维卷GydF4y2Ba在araBAD启动子的控制下,单克隆到pBAD载体中。将pBAD-SaCOMT和pBAD-OsCOMT质粒转化到Ec菌株中GydF4y2Ba∆tnaAGydF4y2Ba,分别得到EcSaCOMT和EcOsCOMT,并获得可溶性蛋白(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图印地)。通过添加NAS和蛋氨酸,测试了两种COMTs对NAS对褪黑素的生物催化能力。如图所示。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba这表明,这两种comt都可以用于设计褪黑激素产生的途径。含有OsCOMT的菌株产生的褪黑激素水平明显高于含有SaCOMT的菌株,SDS-PAGE分析显示OsCOMT的表达远远高于SaCOMT。将两个COMT基因与其他中间产物合成基因偶联构建在共表达质粒上,验证其增加褪黑素产量的能力。据我们所知,这是第一个在微生物中发现的COMT蛋白,扩大了参与褪黑素生物合成的COMT候选基因库。与SaP4H、SaPsmH和SaPsmF结合,推测在GydF4y2Ba美国albulusGydF4y2Ba被确认。GydF4y2Ba

图3GydF4y2Ba
图3.GydF4y2Ba

OsCOMT与SaCOMT对褪黑素产生的影响比较。两个GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba在16℃的诱导16小时后收获菌株(10个OD),重悬于1ml pH 7.0 Tris-HCl中,并在30℃下用1mg / ml NIS和2mg / ml甲硫氨酸培养。数据为三次重复实验的平均值±标准差。没有错误栏表示误差小于符号大小GydF4y2Ba

褪黑激素生产途径工程GydF4y2Ba

基于5-HTP生物合成模块和从所述COMT上GydF4y2Ba美国albulusGydF4y2Ba或GydF4y2Bao .漂白亚麻纤维卷GydF4y2Ba,构建了完整的褪黑素生成途径(附加文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S2)。在Ec中,所有负责褪黑激素生物合成的基因都是由一个pBAD质粒表达的GydF4y2Ba∆tnaAGydF4y2Ba重组菌株EcMEL1和EcMEL2(使用SaCOMT或OsCOMT)。另外,将编码SaPsmH、SaPsmF和COMT的基因放置在另一个质粒(pZS)上,将5-HTP生物合成模块放置在pBAD质粒上,获得了EcMEL3和EcMEL4两株菌株。出乎意料的是,这4个品系都没有产生褪黑激素,但观察到显著的NAS积累(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa). SDS-PAGE结果(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图。S3)表明,除了最后一种酶,催化NAS至褪黑激素的最后酶,外部表达了对褪黑素的合成所需的蛋白质。这些结果表明,COMT的弱表达可能会限制褪黑素的产生。为了改善重组菌株中COMT的表达,进行了一系列质粒修饰(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:无花果S2C-G)。When we moved COMT from pZS plasmid to pBAD plasmid, a clear OsCOMT band was observed and a total of 12.29 ± 0.13 mg/L melatonin was produced by Ec-MEL6 in flasks, while no obvious melatonin or SaCOMT was produced by EcMEL5 (Fig.4.GydF4y2Ba一个额外的文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:无花果S4a)。因此,在该系统中,OsCOMT比SaCOMT更有利于NAS向褪黑激素的生物转化。而褪黑素的合成仍然在COMT催化的步骤受阻。在全细胞生物催化过程中,EcMEL6产生的NAS近200 mg/L,约为褪黑激素的15倍。这表明COMT的表达对褪黑激素的产生至关重要。GydF4y2Ba

图4GydF4y2Ba
图4.GydF4y2Ba

ECMEL1-7菌株催化了NaS和褪黑激素的产生以及不同浓度甘油在转化介质中的作用。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba如方法2中所述NAS的生产和褪黑激素通过EcMEL1-7的发酵在摇瓶中96小时的菌株。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba不同浓度甘油发酵EcMEL7产生NAS和褪黑素。数据为三次重复实验的平均值±标准差。没有错误栏表示误差小于符号大小GydF4y2Ba

为了增强OsCOMT的表达,并取得较高的产率的褪黑激素,下褪黑激素产生菌株,EcMEL7,通过将编码OsCOMT紧接XcP4H下游的基因制备。结果表明,ECMEL7菌株的褪黑素的产生增加至18.64±0.46mg / L(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种)。SDS-PAGE分析证实,ECMEL7细胞中oScomt的表达增强了(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:无花果S4b)。为了进一步提高OsCOMT的表达,我们还将OsCOMT转移到XP4H的前面,或者将OsCOMT单独放在pBAD质粒上(附加文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:无花果S2J)。然而,当OsCOMT向XP4H上游移动时,重组菌株的COMT表达量没有增加,而XP4H的可溶性表达量明显下降(Additional file)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S4C),这引起褪黑激素的合成受阻在第一步骤。当把OsCOMT上的pBAD质粒单独,甚至更强的启动子代替帕拉诸如PGydF4y2BaT7GydF4y2Ba或PGydF4y2BaTAC.GydF4y2Ba,与EcMEL7相比,COMT的表达和褪黑激素的产生没有增加(Additional file)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S5A,B)。似乎COMT的表达已达到当前六个酶共表达系统中的极限。即使提高了COMT表达的基因元素,由于与转录和翻译相关的资源的限制,将无法实现更强的表达。GydF4y2Ba

通过Cofactor Engineering和蛋白质工程改善褪黑激素的生产GydF4y2Ba

在建立完整的褪黑激素生物合成途径后,通过辅助因子工程和蛋白质工程进一步提高褪黑激素的产量。首先,通过辅助因子工程增加acetyl-CoA和SAM的供应,导致褪黑激素的产量显著增加。乙酰辅酶a是PsmF的重要辅助因子,参与5-HT生物合成NAS。EcMEL7上清液HPLC分析显示有大量5-HT积累(数据未显示)。5-HT转化为NAS的效率较低,可能是由于缺乏乙酰辅酶a。葡萄糖、醋酸和甘油能够为乙酰转移酶提供能量和乙酰基GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34GydF4y2Ba].向M9培养基中加入10g / l葡萄糖,50mM乙酸盐或5%甘油,评价ECMEL7的全细胞生物催化效率。结果表明,与葡萄糖和醋酸盐相比,甘油有效增加了NAS的产率(附加档案GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S6)。如附加文件所示GydF4y2Ba1GydF4y2Ba图S7,添加甘油后上清液中乙酰辅酶A的水平提高了55%,证实了甘油通过促进乙酰辅酶A辅助因子的可得性增强了PsmF的活性。因此,不同浓度的甘油在整个细胞从色氨酸生物转化褪黑素的过程中进行了测试。在摇瓶中,NAS的最高产量为569.82±16.88 mg/L。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab).此外,添加甘油也显著增加褪黑激素的产生(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab)。褪黑素的增加的增加是甘油浓度依赖性。达到最高水平的褪黑激素:35.13±0.66mg / L(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab)当将3%甘油加入全细胞催化系统中时。因此,随后的优化实验全部加入3%甘油。GydF4y2Ba

激进的GydF4y2BaS.GydF4y2Ba-腺苷蛋氨酸(SAM)是另一种重要的辅助因子,在COMT催化过程中起关键作用。SAM是体内常见的甲基供体,参与多种化合物生物合成的限速步骤,并进行许多基因组修改以消除抑制[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba].植物中COMT酶活性的研究表明它与SAM / SAH比率正相关[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36GydF4y2Ba那GydF4y2Ba37GydF4y2Ba].检测SAM水平的增加和SAH积累的减少是否可以提高COMT的潜力,从而提高褪黑素的生产GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba,一系列与SAM回收相关的基因被删除或过表达(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa).在缺失和过表达基因中,缺失GydF4y2BaspGydF4y2Ba基因通过两倍(图增加了生产的褪黑激素。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaC)。SAM的Sped催化脱羧剂产生DSAM:涉及亚精亚胺合成的前体之一。删除GydF4y2BaspGydF4y2Ba基因降低了SAM的消耗,并提供了更多的甲基供体来增强褪黑素合成。此外,GydF4y2BaspGydF4y2Baknockout对BW25113Δ的生长无显著影响GydF4y2BaTNAA.GydF4y2Ba(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba中:图S8)。的修改GydF4y2BaMTN.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba勒克斯GydF4y2Ba,GydF4y2BaDCM.GydF4y2Ba增加了NAS的产量,但没有引起褪黑激素产量的显著差异(p > 0.05)(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaC)。GydF4y2Ba

图5GydF4y2Ba
图5.GydF4y2Ba

辅助因子工程和蛋白质工程,高水平生产褪黑素。GydF4y2Ba一种GydF4y2BaCOFT COFOCTOR SAM的代谢工程。红色箭头表示基因的增强表达,蓝色交叉表明基因的敲除。GydF4y2BaB.GydF4y2BaOsCOMT和AtCOMT蛋白序列的比对。GydF4y2BaCGydF4y2Ba通过重组将色氨酸转化为NAS和褪黑激素GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba菌株。GydF4y2BaD.GydF4y2Ba代表ECMEL8应变的标准和生物转化产物的HPLC分析。GydF4y2BaE.GydF4y2BaLC-ESI-MS分析来自面板D的符号D:化合物1 [M + H]的精确质量GydF4y2Ba+GydF4y2Ba[GydF4y2Bam / zGydF4y2Ba(219.1),复合词2[M + H]GydF4y2Ba+GydF4y2Ba[GydF4y2Bam / zGydF4y2Ba(233.0)。数据为三次重复实验的平均值±标准差GydF4y2Ba

王等人GydF4y2Ba.GydF4y2Ba报道nas结合袋(C296F, Q310L, V314T)附近的氨基酸替换显著增强了COMT的催化活性GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba(atcomt)[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba].相应的C296和V314残基在OsCOMT中是保守的,而Q310则不是(图2)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab).因此,将相应的C296F和V314T替换到OsCOMT中,得到了OsCOMT2。OsCOMT2使褪黑激素产量增加到122.83±4.44 mg/L,是OsCOMT的5倍。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bac).结合OsCOMT突变和缺失GydF4y2BaspGydF4y2Ba,获得ECMEL8菌株。Ecmel8在摇瓶中产生136.17±1.33 mg / L褪黑激素和879±71.42 mg / L NaS(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bac)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bad为EcMEL8发酵上清的高效液相色谱分析,目标产物经LC-MS确证(图2)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bae)。结果表明,几乎所有消耗的色氨酸(4.94mm)转化为NAS和褪黑激素(4.12mm + 0.56mm),其他色氨酸衍生物可忽略不计。如Luo等人报道的那样,由于TDC(色氨酸脱羧酶)的TRPM形成活性,工程菌株在进料批量发酵过程中达到高产酵素发酵过程中的褪黑激素时产生了高水平的副产物ACTRPM。GydF4y2Ba21GydF4y2Ba].但是,来自物质激胺途径的PSMH和PSMF蛋白对它们的基材非常特异[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba, EcMEL8菌株未产生明显的副产物。与EcMEL7菌株相比,EcMEL8菌株产生的褪黑激素产量得到有效提高,NAS/褪黑激素产量降低,说明NAS向褪黑激素的生物转化得到了成功的提高。然而,在EcMET8中NAS的水平是褪黑激素的5倍,表明COMT仍然是本研究中褪黑激素产生的限速步骤。GydF4y2Ba

高级褪黑激素的生产在发酵GydF4y2Ba

在细胞密度较高(OD)的2-L发酵罐中,EcMET8还进行了色氨酸到褪黑素的全细胞生物转化GydF4y2Ba600GydF4y2Ba = 38). Melatonin yield reached its highest level in the medium of 0.32 ± 0.03 g/L at 71 h with the synthesis efficiency of melatonin produced via per g of dry cell weight (DCW) at 35 mg/g DCW. NAS production continued to increase even after 83 h and reached 3.0 ± 0.26 g/L (Fig.6.GydF4y2Baa).因此,在该系统中褪黑素和NAS的产量都显著高于摇瓶。与摇瓶相比,细胞转化效率降低。这可能是由于发酵过程的限制。发酵条件优化后,如图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab显示,NAS的积累减少到1.06±0.07 g/L,在180 h褪黑激素的产量最终达到0.65±0.11 g/L。正如预期的,较高的OD值带来了褪黑激素的产量。在优化的发酵条件下,EcMEL8的褪黑素合成效率达到59 mg/g DCW,甚至高于Luo等报道的菌株。然而,在EcMEL8中褪黑素合成的最后一步的限制并没有完全消除:发酵罐中积累了大量的NAS。下一步的工作应集中在消除NAS积累的问题,以提高褪黑激素的生产。GydF4y2Ba

图6.GydF4y2Ba
图6.GydF4y2Ba

发酵罐中的高水平褪黑激素生产。GydF4y2Ba一种GydF4y2BaEcMEL8补料分批发酵。在18 h时加入0.1%的l -阿拉伯糖。红色箭头表示色氨酸、蛋氨酸和3%甘油加入发酵罐的时间(23 h)。在29 h、35 h、47 h、59 h、71 h和83 h测量NAS和褪黑激素浓度。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba优化后的EcMEL8补料分批发酵。0.1%诱导24 hGydF4y2BaL.GydF4y2Ba阿拉伯糖。在36小时将色氨酸,甲硫氨酸和3%甘油加入发酵罐中。在60h,84h,108h,132h,156 h和180h下测量NaS和褪黑激素浓度。(n = 2)GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

在本研究中,褪黑素的合成途径GydF4y2BaStreptomyces albicans.GydF4y2Ba经鉴定,并在新的褪黑激素的生物合成途径GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba在此基础上成功建造。通过平衡外源蛋白表达元件,优化辅助因子的补充,以及修改限速酶COMT,褪黑激素的产量增加了11倍。本研究将褪黑素合成途径的基因资源库扩展到原核基因,为基因工程菌株生产色氨酸衍生物提供了一条快速、优良的合成途径。GydF4y2Ba

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确认GydF4y2Ba

在LC-MS / MS数据收集中,我们非常感谢中国科学院微生物学院微生物学研究所的公共技术服务中心。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

国家重点研发计划项目(No. 2018YFC0310703);中国海洋矿产资源研究开发协会项目(No. DY135-B2-02);国家自然科学基金项目(No. 31770103)。关键词:岩石力学,孔隙率,孔隙率,孔隙率GydF4y2Ba

作者信息GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

作者GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

YFZ和SZ构思了项目,设计了实验。YFZ、YZH、NZ和JJG进行了实验。SZ, YFZ, YZH分析数据并撰写稿件。ZYD提供资源并对稿件进行修改。所有作者阅读并批准了最终的手稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2Ba山张GydF4y2Ba或GydF4y2Ba董担任英语和汉语教师GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

道德声明GydF4y2Ba

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不适用。GydF4y2Ba

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Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

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额外的文件1。GydF4y2Ba

补充图1.(a),PBAD-5HTPS的SDS-PAGE分析。红色箭头表示p4hs的表达。(b),ECSACOMT和ECOSCOMT的SDS-PAGE分析。补充图2.对褪黑素相关蛋白表达的质粒构建。补充图3. ECMEL1,ECMEL2,ECMEL3和ECMEL4的SDS-PAGE分析。补充图4. ECMEL5,ECMEL6,ECMEL7,ECMELCX和ECMELCXPM的SDS-PAGE分析。补充图5. Ecmel7,Ecmelcs,Ecmel-CTAC和ECMEL-CT7s的褪黑激素产生的比较。补充图6.在M9Y培养基中添加葡萄糖,乙酸盐和甘油的比较NAS和褪黑素的生物合成。补充图7.在全细胞生物分析期间ECMEL7和ECMEL7 + 5%甘油中乙酰辅酶A的浓度。补充图8. BW25113的生长曲线GydF4y2BaΔtnaAGydF4y2Ba和BW25113GydF4y2BaΔtnaaδspeGydF4y2Ba.表S1。用于DNA操纵的引物。表S2。od.GydF4y2Ba600GydF4y2BaM9Y培养基中褪黑素产生菌的研究。表S3。od.GydF4y2Ba600GydF4y2Ba添加葡萄糖、甘油和醋酸盐后产生褪黑激素的菌株。GydF4y2Ba

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开放获取GydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中,除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中,并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途,你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本,请浏览GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba.创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据,除非另有用入数据的信用额度。GydF4y2Ba

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张,Y.,他,Y.,张,N。GydF4y2Ba等等。GydF4y2Ba结合蛋白质和代谢工程策略的生物合成褪黑素GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba.GydF4y2Ba活细胞的事实GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba170(2021)。https://doi.org/10.1186/s12934-021-01662-8GydF4y2Ba

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关键词GydF4y2Ba

  • 褪黑激素GydF4y2Ba
  • NGydF4y2Ba-acetylserotoninGydF4y2Ba
  • 代谢工程GydF4y2Ba
  • 链霉菌属albulusGydF4y2Ba
  • S.GydF4y2Ba腺苷甲硫氨酸GydF4y2Ba