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提高柠檬酸生产工业的黑曲霉CGMCC 10142:一种具有不同启动子的高亲和力葡萄糖转运体的鉴定和过表达

摘要

背景

葡萄糖转运体在柠檬酸发酵过程中起着重要的作用。在本研究中,我们鉴定了一个高亲和力葡萄糖转运蛋白(HGT1),并在工业菌株中过表达答:尼日尔CGMCC 10142.使用P的HGT1过度表达菌株格拉A和Paox1启动子构建,以验证葡萄糖转运功能。

结果

如假设,HGT1过度抑制菌株显示出培养型柠檬酸产量和较低的残留糖含量。表现最佳的应变答:尼日尔20-15展会将总含糖量和残留的还原糖减少16.5%和44.7%,而最终的柠檬酸产量明显增加至174.1克/升,而与...相比增加7.3%答:尼日尔CGMCC 10142.发酵过程中不同时间点的相关基因的MRNA表达水平的测量表明,除HGT1之外,还在过表达菌株的较高水平下表达柠檬酸盐合酶和葡萄糖酮。

结论

结果表明,HGT1解决过度引起的糖转运不足代谢瓶颈,从而提高了糖的利用率。这项研究表明,高亲和力葡萄糖转运HGT1的有用用于改进的柠檬酸发酵过程黑曲霉CGMCC 10142。

背景

柠檬酸(CA)是一种天然存在的三羧酸,广泛应用于食品、化学、医药等领域,其需求量大,是世界上使用最广泛的有机酸之一[12].近年来,微生物发酵CA需求量以每年3.7%的速度递增。目前,CA大多是使用黑曲霉工业规模的发酵。作为一种腐生真菌,答:尼日尔分泌大量的水解酶,有利于在复杂底物上产生CA [3.4.].

答:尼日尔是最重要的工业微生物之一,具有巨大的商业价值。随着测序技术和基因组技术的发展,越来越多地采用合理的分子进化和修饰而不是随机诱变来提高CA的发酵效率答:尼日尔[5.].迄今为止,在CA行业集中于中央代谢通量的提高和发电的呼吸链效率的主要代谢工程策略答:尼日尔[6.7.8.],主要是通过EMP(糖酵解)途径,TCA循环和电子传输参与的关键基因的敲除和过表达[9.10.11.].最近的研究专注于能量新陈代谢和电子运输[12.13.]. 代谢答:尼日尔包括补充途径,其可以克服个别基因的过表达的影响,导致柠檬酸生产的改善有限的复杂网络。例如,柠檬酸合酶的过表达或缺失不提高柠檬酸生产[14.15.]. 因此,这种酶不会催化限速步骤。

因此,Torres等人。计算出柠檬酸生产的关键限制点是己糖的摄入和磷酸化[16.].如果在柠檬酸发酵过程中保持高葡萄糖浓度,则发酵过程的CA生产峰值将是先进的,但最终产量不会增加[17.].一般而言,碳源的类型及其浓度是确定柠檬酸发酵效率的关键因素。徐等人。发现加入10%w / v的糖,例如麦芽糖,蔗糖,甘露糖或果糖,导致柠檬酸的最高产量,而75克/升葡萄糖浓度得到了最佳效果。此外,培养基中没有柠檬酸产生,糖少于2.5%[18.].Mischak等。清楚地表明,对葡萄糖的摄取,通过少量的细胞外柠檬酸超过0.5mM的[抑制,在浓度19.].因此,柠檬酸的产生及其速率与葡萄糖浓度及其摄取速率密切相关。葡萄糖的吸收率与葡萄糖浓度呈简单的线性关系,葡萄糖作为高度亲水分子,不能被动地通过细胞膜。因此,促进扩散和活性转运体是葡萄糖摄取的主要方式[20.].

有两种葡萄糖转运体答:尼日尔,一种低亲和力葡萄糖转运蛋白K.m为3.67 mmol/L,具有高亲和力的葡萄糖转运体K.m260µmol / L。Torres等人发现,低亲和力葡萄糖转运体激活需要高葡萄糖浓度(> 50 g/L),这能够提供生产柠檬酸所需的高葡萄糖通量[16.].转录组分析答:尼日尔在发酵过程中H915-1揭示的低亲和力葡萄糖转运维持高转录物水平,而5高亲和力葡萄糖转运没[20.].这种本土状态答:尼日尔一个低亲和力的葡萄糖转运体K.m和具有极低表达水平的高亲和力葡萄糖转运蛋白可以解释发酵肉汤中有限的柠檬酸产量和大量的残余葡萄糖[21.22].控制和协调这些蛋白质可以以靶向方式改变菌株的营养吸收能力,使它们更适合于工业发酵。因此,葡萄糖运输效率答:尼日尔对增加CA生产至关重要,并且可能是获得更高CA产量的限制因素之一[21.22].

许多假定糖转运蛋白已在真菌已经确定。有趣的是,一些新发现的从木糖转运A. Nidulans.答:尼日尔, 和T. Reesei.也能运输葡萄糖[2324].此外,还对参与葡萄糖信号转导的低亲和力葡萄糖转运体HxtB进行了表征[25].但是,有一些关于特定葡萄糖转运蛋白的报告答:尼日尔.基于保守的蛋白结构域搜索,86个推测的糖转运蛋白基因在基因组中被鉴定和注释答:尼日尔[26].两种新的高亲和力葡萄糖转运蛋白,命名为MstG和MstH答:尼日尔通过膜相关蛋白质组分析和生物化学表征[27].此外,还发现MstA是一种高亲和力的葡萄糖转运蛋白答:尼日尔,其破坏导致细胞葡萄糖摄取减少2至5倍[28]. 该蛋白由产酶菌株表达答:尼日尔CBS 513.88以及原工业制酸菌株答:尼日尔ATCC 1015 [29],但它没有表达答:尼日尔CGMCC 10142。此外,还发现了两个葡萄糖转运体答:尼日尔H915-1是高糖浓度下高表达的低亲和性葡萄糖转运体,也是极低表达的高亲和性葡萄糖转运体[20.].刘等。通过过表达低亲和力葡萄糖转运蛋白,增加葡萄糖运输速率并缩短发酵循环[30.].值得注意的是,葡萄糖转运体HGT1(高亲和力葡萄糖转运体1)首次在kluyveromyces乳酸,亦在答:尼日尔CBS 513.88和答:尼日尔CGMCC 10142[3132].

用于中使用的初级基材答:尼日尔CA Industry是玉米陡液,具有大量总糖,包括葡萄糖,二糖和多糖。答:尼日尔分泌丰富的葡糖淀粉酶,可以将多糖水解成易于生物可利用的葡萄糖。因此,发酵开始时的主要碳源是葡萄糖,并且充分供应碳源可以大大增加Ca生产。毫无疑问,葡萄糖的运输速率可理解地成为阻止Ca产量的进一步增加的限制因素。因此,期望在发酵过程中加速葡萄糖的运输答:尼日尔从而改善柠檬酸生产性能。

在这里,工业的CA-生产菌株答:尼日尔以CGMCC 10142作为代谢工程的起始菌株。从亲本菌株中鉴定并克隆了高亲和力葡萄糖转运蛋白HGT1的基因。序列比对发现,强内生P格拉A和Paox1选择启动子以过表达HGT1。随后,成功构建并表征HGT1过度抑制菌株。通过实时QPCR在发酵过程中分析了CA生产中参与CA生产的关键酶基因的转录水平。此外,量化生物质和残留糖并比较了工程菌株和亲本菌株。

结果和讨论

来自亲本菌株的天然HGT1的序列分析

低亲和力葡萄糖转运体是在相对较高的葡萄糖浓度(> 50 g/L)发酵过程中葡萄糖导入细胞的限制因子[20.].相反,当糖浓度极低时,即使在发酵结束时,高亲和力葡萄糖转运蛋白也可以起作用,如图2所示。1

图。1
图1

葡萄糖-柠檬酸转化途径的方案包括LGT和HGT1如何转运葡萄糖

工业CA生产菌株的基因组答:尼日尔CGMCC 10142是由我们的团队重新排序并进一步分析屏幕必不可少的高亲和力葡萄糖转运。高亲和力葡萄糖转运HGT1在轨迹contig1(6084010:6085828)被确定和的BLASTn表明它是100%相同的其直向同源物答:尼日尔CBS 513.88(Genbank:AM269996.1)。显着的是,高亲和力葡萄糖转运蛋白在12小时的发酵时显示出实际上没有转录。通过启动子P改善葡萄糖利用率,两个质粒p20和p21用于HGT1的过度表达格拉A和Paox1构建成功(图S1a和S1b)。两个质粒通过PCR鉴定并测序如图S2a和S2b。

氨基酸序列答:尼日尔HGT1 (XP_001391024.1)与MstA (AAL89822.1)对齐[28],LGT1(XP_001399490.1)30.),而A. Nidulans.MSTE(XP_663464.1)[25]. 氨基酸序列的相似性分别为27.83%、25.71%和25.91%(附加文件1:图S3)。从HGT1之间的氨基酸序列同一性答:尼日尔和它的同系物(AAC49461.1)从kluyveromyces乳酸达到40.87%[31].本研究中,HGT1的结构来源于答:尼日尔利用糖转运蛋白STP10 (PDB:6H7D_A)在瑞士模型中进行同源建模预测[33] D-Xylose-Proton Symporter Glut1-4(PDB:4Gby_A)[34]作为模板。

来自不同真菌的糖(葡萄糖)转运蛋白的系统发育树如图2所示。2.在这两种肿瘤中都发现了几种葡萄糖转运体答:尼日尔A. Nidulans。hgt1的答:尼日尔CGMCC 10142对应于尼日尔.其他几个与HGT1相近的葡萄糖转运体包括XP_001394117.2和XP_001390064.1。更重要的是,MstA在答:尼日尔大多数糖转运体A. Nidulans.它们位于系统发育树的同一分支中。此外,在研究中还发现了几种不同的糖转运蛋白A. Nidulans.答:尼日尔,这与先前的研究一致。几种不同的高亲和力糖转运蛋白在基因组中编码答:尼日尔,根据系统发育分析(平均分枝长度距离< 0.6的塌陷分枝),可能不是密切相关。可能是不同环境条件下的糖同化限制导致了一系列不同的葡萄糖转运体的进化,因此它们的转录调控和生态作用仍不清楚。

图2
图2

HGT1的系统发育树黑曲霉CGMCC 10142 (A01086)与其他同源物。HGT1和其他同源基因的系统发育树Aspergillus nidulans.FGSC A4(XP 659401.1),黑曲霉CBS 513.88(XP 001396930.1)Aspergillus nidulans.FGSC A4 (CBF79090.1),Aspergillus nidulans.FGSC A4 (CBF79090.1),黑曲霉(AAL89822.1),Aspergillus nidulans.FGSC a4 (xp 664273.1),Aspergillus nidulans.FGSC A4(XP 682006.1)Aspergillus nidulans.FGSC a4 (xp 663464.1),黑曲霉001399490.1 (XP),Aspergillus nidulans.(CAD59636.1),黑曲霉CBS 513.88(XP 001390064.1),kluyveromyces乳酸(AAC49461.1),黑曲霉CBS 513.88(XP 001394117.2),黑曲霉CBS 513.88(XP 001399197.1),黑曲霉CBS 513.88(XP 001391024.1)黑曲霉CBS 513.88(XP 001393781.1)。树通过Mega 5.05版本中的邻接(NJ)方法建立。秤条对应于每位位点0.1估计氨基酸取代;

表达盒整合和转化子遗传稳定性的验证

首先,p格拉一种-HGT1.Paox1-HGT1, 和HGT1-hyg对转化子片段进行扩增,验证casset into A. tumefaciens . (asset into A. tumefaciens .(附加文件1:图S2c),并随后插入答:尼日尔(图S2d、S2e和S2f)。然后,利用跨越基因全长的引物确定整合位置ku70..如果质粒与该质粒同源地重组ku70.基因,一个5710bp片段,包括同源物体ku70.HGT1.-过表达盒只能通过PCR扩增,而HGT1.-overexpression盒随机整合到基因组中,只有一个的1800 bp片段ku70.基因本身可以被扩增。如附加文件所示1:图S2g,原长度ku70.(1800bp),而不是目的片段(5710bp)答:尼日尔. 因此,结果证实,整个P格拉A / Paox1-HGT1.-hyg片段随机插入转化体基因组。8个转基因品系传代15代,验证了转化子的遗传稳定性hyg基因序列如附加文件所示1:图S4。然后,从8个已鉴定的稳定转化子中制备分生孢子,验证其摇瓶发酵产CA能力。

摇瓶发酵中高CA生产菌株的筛选

最初,通过计算透明晕区因酸生产和菌落直径而筛选68个阳性转化体(附加文件2:表S1)。8个高级变压器(答:尼日尔20- 15,20 - 16,20 - 25,20 - 27,20 - 29,21 - 8,21 -28和21-32)摇瓶发酵,筛选高产转化子(图2)。3.A) 。与130.1 g/L的钙滴度相比尼日尔CGMCC 10142 7个转化子的CA产量均有所提高,其中转化子20-15、20-25、21-8和21-28的CA产量显著提高,分别达到152.3 g/L(+ 17.1%)、144.6 g/L(+ 11.1%)、146.7 g/L(+ 12.8%)和145.3 g/L(+ 11.7%)(图1)。3.A).这与透明晕区20-15为3.73,20-25为3.48,21-8为3.55,21-28为3.41的比值相一致答:尼日尔CGMCC 10142的比例为2.85(图。3.b)。随后,选择转化体20-15和21-8用于进一步的实验。转化体20-15和21-8的生长速度比亲本菌株更快低葡萄糖(小于1%)的真菌的完全培养基(CM)[下35]平板可以证实HGT1可以促进葡萄糖的摄取,从而加速菌株的生长。

图3.
图3

柠檬酸生产通过摇瓶发酵和环直径比转化体的验证。一种50 mL摇瓶发酵法对转化子(20- 15,20 - 16,20 - 25,20 - 27,20 - 29,21 - 8,21 -28和21-32)产柠檬酸的验证;B.采用CM + CaCO透明晕带法测定变位体(20- 15,20 - 16,20 - 25,20 - 27,20 - 29,21 - 8,21 -28和21-32)的环径比3.中等的。具有不同字母的Ca产量显着差异显着(ABCD,P <0.05)

CA发酵生物反应器规模发酵和统计分析

在CA发酵过程中不同时间在CA发酵过程中的菌丝颗粒的形态如图1所示。4.A.父母的形态答:尼日尔菌株CGMCC 10142及其转化子答:尼日尔20-15和21-8,在每个采样时间都是正常的。在24小时之前,菌丝体颗粒的直径迅速增加,表明菌株进入了快速生长阶段。24小时后,真菌的颗粒表现出一点增加,殖民地开始萌芽小菌丝体,表明已经开始进入CA生产的时间。Papagianni等人。观察到发酵的前48小时的菌丝体块的减少[36],但在我们的研究中,菌落形态并没有显著来自CA的生产,直至发酵结束期间改变。此外,菌丝球答:尼日尔21-8在24 ~ 32 h仍有一定的生长,并保持形态稳定。32 h后,所有菌株菌丝球大小相近,且保持稳定,如图所示。4.A和其他文件1:图S5。由于液体发酵不产生新的孢子,所以发酵32 h后所有菌株的生物量相似。

图4.
图4

30L生物反应器发酵中柠檬酸生产和生产力的菌丝形态和验证的观察。一种菌丝形态观察答:尼日尔20-15 (20-15),答:尼日尔21-8(21-8)和答:尼日尔CGMCC在发酵不同时间点10142(10142)菌株;B.柠檬酸生产的20-15,21-8和在30升生物反应器发酵不同时间点10142菌株的验证;C的20-15,21-8和在30升生物反应器发酵各时间点10142菌株柠檬酸生产率的验证;D.在30L生物反应器发酵中,56和64小时的柠檬酸产生20-15,21-8和10142株;E.在56 20-15,21-8和10142菌株的柠檬酸生产率和在30升生物反应器发酵64小时。每个时间点的样品具有不同字母的差异显着(ABC,P <0.05)

每8小时也测量生物反应器级发酵中的Ca产生,如图1和2所示。4.B和D. CA生产从16小时迅速增加,转化体显示出逐渐改善的CA发酵能力。CA生产答:尼日尔20-15和21-8分别提高到174.1 g/L和169.4 g/L,分别比菌株10142的CA滴度162.3 g/L提高了7.3% (P < 0.01)和4.4% (P < 0.05)。之间的区别答:尼日尔20-15和21-8没有统计学意义(p> 0.05)。计算每个发酵阶段的生产率,如图1和图2所示。4.C和e最高的生产速率答:尼日尔20-15达到4.4克/升/小时,高于两者答:尼日尔21-8和10142,其分别在发酵24小时达到4.1g / l / h。最高的生产力答:尼日尔21-8达到4.2克/升/小时,大约等于答:尼日尔20-15但高于答:尼日尔CGMCC 10142在32小时的4.0g / L / h,并在40小时内保持高水平。这表明24小时的CA生产更高答:尼日尔20-15比答:尼日尔21-8或答:尼日尔CGMCC 10142,可能是由于21-8没有这样的强HGT1过表达启动子。在发酵结束时,在56至64小时之间观察到生产率的最大差异。在此期间,CA生产力答:尼日尔20-15和答:尼日尔21-8是1.6-0.6克/升/小时和1.0-0.7克/升/小时,这比的更高2.1-1.5和1.3-1.8倍答:尼日尔CGMCC 10142,达到0.7-0.4克/升/小时。这re was a significant difference among the three strains (P < 0.01) at 56 h, and there was also a significant difference between答:尼日尔21-8和答:尼日尔CGMCC 10142(P <0.01)或答:尼日尔20 ~ 15 (p < 0.05)。但两组间无显著性差异答:尼日尔20-15和答:尼日尔CGMCC 10142(P> 0.05)在64小时。这些结果进一步证实,当碳源接近耗尽时,HGT1的过度促进了发酵阶段的CA生产。

在发酵过程中,每8 h测定一次发酵液中总糖含量,在48、56、64 h时,总糖残留量分别为36.6、21.7、10.6 g/L答:尼日尔20-15,其高于相应的值答:尼日尔21-8分别为33.8、18.9和8.8 g/L,但均低于答:尼日尔CGMCC 10142,分别为37.4、22.9和12.7 g/L。5.一种)。这表明HGT1的过表达在发酵的56和64小时下具有显着的阳性作用。这些结果与早期的研究一致[32].早期的研究发现,当葡萄糖浓度达到15%时表示低亲和力葡萄糖转运蛋白,并且当它下降到8%时,高度表达[20.21.]. 我们的结果还表明,当糖浓度在32小时降至8%以下时,观察到最显著的变化,HGT1开始发挥更重要的作用。在发酵结束时(64小时),总残余糖答:尼日尔20-15和答:尼日尔21-8减少了16.5%和30.7%答:尼日尔分别CGMCC 10142。这一结果表明,过表达HGT1显著增加了糖的消耗率。

图5.
图5

30L生物反应器中的CA发酵性能。一种在48,56和64小时的发酵液中的残留总糖变化;B.48,56和64小时的发酵液中的残留还原糖变化;C从糖到CA在发酵肉汤在48处,56的转化率,以及64小时。每个时间点的样品具有不同字母的差异显着(ABC,P <0.05)

在CA发酵过程中,一部分初始糖未被微生物利用,导致原料浪费。因此,在48、56和64小时测量发酵液中的总还原糖浓度,如图所示。5.B. 48、56、64 h总还原糖浓度分别为16.0、5.9、2.1 g/L答:尼日尔20-15,比相应的值少答:尼日尔21-8分别为18.1、7.4和2.7 g/L。两种转基因品系的残糖浓度均低于亲本品系答:尼日尔CGMCC 10142,剩下19.1、8.3和3.8 g/L的糖利用率。因此,最终的总还原糖利用率答:尼日尔20-15和21-8分别比前者提高44.7%和26.3%答:尼日尔CGMCC 10142。此外,我们发现还原糖浓度在前16小时内迅速增加,尤其是在前8小时。随后,随着CA产量的增加,其在随后的发酵期间降低,在此期间大量葡萄糖被用于合成CA。因此,还原糖浓度在24小时后迅速降低。因此,HGT1过度表达的转化子表现出更高的葡萄糖利用能力,这也反映在CA产量的增加上。

我们还基于总糖消耗和CA生产的测量值计算了葡萄糖-CA转换速率,如图2所示。5.C正如所料,HGT1过表达菌株显示出比原始菌株更高的转化率。产品的最终转化率答:尼日尔20-15和21-8分别为102.4和100.4%。CA的发酵性能依次为答:尼日尔20-15 >答:尼日尔8的>答:尼日尔CGMCC 10142。

重组人HGT1、柠檬酸合成酶和葡萄糖激酶基因的转录水平答:尼日尔

相对转录水平HGT1.基因(XM_001399160.2),柠檬酸盐合成酶(CS)基因(XM_001393946),和葡萄糖蛋白酶基因(XM_001395875.2)(GenBank登记的接入号码衍生自答:尼日尔在发酵过程中CBS 513.88)进行测定,以探索HGT1的过度表达是否影响CA的代谢和积累答:尼日尔.的菌丝球样品答:尼日尔20-15(P格拉a)和21-8(paox1)取在12和48小时,通过过滤从培养物上清液中分离,并萃取进行实时定量PCR的总RNA。

HGT1的相对表达如图所示。6.A.转录水平HGT1.在过表达菌株比在12和48小时的控制高得多。的转录水平HGT1.在里面答:尼日尔20-15分别比12和48小时的原始应变高约219倍,表明HGT1过表达菌株的葡萄糖利用效率也高于答:尼日尔CGMCC 10142.此外,过表达HGT1应变答:尼日尔20-15分和P格拉启动子显示出比菌株高2.5倍的转录答:尼日尔21-8的Paox1启动子在12小时,以及在48小时高5倍。P格拉A是一种广泛使用的强真菌启动可以由淀粉或葡萄糖[诱导37]和Paox1是替代氧化酶的本地启动子答:尼日尔[8.].将转化20-15(P格拉A) HGT1转录水平越高,CA产量不明显高于21-8(Paox1) (无花果。3.a),可能是因为菌株20-15和21-8中Hgt1蛋白的含量几乎是相同的。此外,48小时的菌株的所有HGT1转录比12小时高至少2倍,表明HGT1在发酵开始的高糖浓度下没有有效地发挥作用。低亲和力葡萄糖转运蛋白的过度表达在高葡萄糖浓度下增加了底物吸收,部分克服了菌株中葡萄糖消耗的限制。当剩余的葡萄糖浓度低时,HGT1转运蛋白在CA发酵结束时加速糖转运。这可以降低最终的总残留糖浓度,提高发酵的经济价值。

图6.
图6

的表达谱的实时qPCR分析HGT1.葡萄糖蛋白酶, 和柠檬酸盐合成酶在12和48小时内答:尼日尔20-15、21-8和10142菌株。这个18 s rRNA用作内部控制。垂直条表示平均值±S.D(n = 3)。一种的相对转录水平HGT1.在12和48小时内答:尼日尔20-15,21-8和10142菌株;B.的相对转录水平葡萄糖蛋白酶在12小时和48小时内答:尼日尔20-15,21-8和10142菌株;C的相对转录水平柠檬酸盐合成酶在12和48小时内答:尼日尔20-15、21-8和10142菌株。这个samples at each time-point with different letters differ significantly (abc, P < 0.05)

值得注意的是,HGT1过表达菌株中葡萄糖酮酶的相对表达水平高于亲本菌株,特别是在48小时(图。6.b)。葡萄糖蛋白酶的表达答:尼日尔20-15比父母菌株高8.4倍,而那个答:尼日尔21-8在48 h时提高了1.4倍,表明过表达菌株具有较高的葡萄糖利用率,提高了CA的生产能力。这些结果表明,HGT1的过表达提高了葡萄糖摄取效率,为转化子中CA的增加提供了足够的碳通量。葡萄糖激酶在葡萄糖向葡萄糖6-磷酸的代谢激活中起关键作用,其活性受葡萄糖6-磷酸和ADP的反馈抑制控制。因此,葡萄糖激酶活性的增加可以直接提高发酵过程结束时CA的产量。

如图所示。6.C,柠檬酸酯合成酶(CS)的表达呈现了与葡萄糖酮酶的类似趋势。CS表达的工程化答:尼日尔菌株20-15在48 h时比亲本菌株高6.4倍。正如其名称所示,CS是CA合成所必需的,因此在CA代谢中起关键作用。当CS基因被删除答:尼日尔,钙产量从98.7克/升降至64.3克/升[38].因此,HGT1的高表达增加了CS的表达,并有助于丰富的CA积累。CS相对表达的变化表明高碳通量增加了转化体的Ca产量。因此,衬底限制可能是亲本菌株中酶活性低的原因之一。

虽然有些基因,例如aox1glaA有强大的推动者可供选择答:尼日尔工程,这些基因也可以表达答:尼日尔,这可能影响柠檬酸生产[8.39].因此我们推测了paox1可能不仅推动表达的HGT1.基因,但也激活自己的aox1基因在一定程度上,从而间接地增加了发酵性能。由于在观察答:尼日尔21-8,较高的转录水平葡萄糖蛋白酶CS答:尼日尔20-15在当菌丝生长大力和溶解氧变得有限12小时。鉴于此,它可以是有用的,以验证的相对表达aox1及有关在今后的研究酶。更重要的是,过表达基因的准确插入位点或拷贝数也可影响表达水平。这是CA合成重要的酶,例如CS和葡糖激酶均在过表达HGT1菌株更高的水平比在表示答:尼日尔CGMCC 10142。有可能是充足的葡萄糖增加了这些酶的表达,从而提高了CA的生产性能答:尼日尔[20.].此外,在该研究中使用的起始菌株已经是一个工业CA生产菌株,它的代谢物水平都比未驯化的野生型菌株要高得多。

葡萄糖转运是从糖到CA的第一步,但它并不直接影响CA发酵。在这项研究中,我们发现,HGT1的过度表达改善还原糖和剩余的发酵液中的总残糖的总消费方面的CA发酵性能。此外,最终的葡萄糖-CA的转换率答:尼日尔20-15和21-8均上升至102.4%和100.4%,这是接近的106.6%的理论葡萄糖-CA转化率(如从葡萄糖柠檬酸的化学反应式中所描绘的:C6.H12.O.6.(mw: 180.15) + 1.5o2 → C6.H8.O.7.(mw: 192.12) + 2h2o)当所有资源用于生产CA而不是增长时[22].最后,工程菌株的CA生产也增加了7.3%答:尼日尔20-15和4.4%答:尼日尔21-8。因此,糖摄入仍然可能是发酵过程中的瓶颈。

结论

在本研究中,我们研究了过表达葡萄糖转运体HGT1对工业CA发酵的影响,发现在摇瓶和30 L实验室规模的生物反应器中都有利于CA的生产。CA产量的增加可以解释为糖利用率的提高和对关键代谢基因表达的间接正向影响。过表达葡萄糖转运体基因可以降低工业化规模生产的成本,提高柠檬酸的产量。

材料与方法

菌株、试剂和培养条件

这项工作中使用的所有菌株和质粒是从天津的工业发酵微生物学,天津,中国或在这项工作中构建的所有菌株和质粒,如表所示1.父母的菌株答:尼日尔CGMCC 10142在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上于35℃培养。大肠杆菌DH5α在LB培养基中于37℃培养用于质粒增殖。根癌土壤杆菌在28℃下在LB培养基中培养AgL1,用于质粒转化。所有试剂都纯净。潮霉素从Solarbio购买。有限公司(中国)。质粒构建和实时荧光定量PCR试剂购自宝有限公司(中国)收购。

在这项工作中使用的表1菌株和质粒

孢子答:尼日尔从PDA板上的培养物中获得CGMCC 10142或其转化体,该培养物在35℃下生长4天,并在玉米陡酒(RZBC有限公司,RZBC Co.,Rizhao,Shandong,China)中培养,其集中在1倍 105.孢子/ ml。答:尼日尔在含50 mL培养基的500 mL摇瓶中,在330 r/min的恒定振荡下,35℃培养72 h。金额为1 × 105.孢子/ ml接种在含有20升玉米浆30升发酵罐中,并在0.1MPa,330升/小时,通气速度,350转/分和35℃下进行64小时培养,根据前述报告[39].

建设HGT1.基因过表达质粒和菌株

表中列出了用于质粒构建的所有引物2.这HGT1.的基因,格拉启动子(P格拉A),以及aox1启动子(Paox1)从基因组中克隆答:尼日尔CGMCC 10142.基因组DNA从PDA培养基上生长的年轻菌丝萃取。这答:尼日尔CBS 513.88基因组作为对设计引物的引用。在BGI Genomics Co.,Ltd(中国)测序后,我们基于NCBI进行序列对齐,以研究HGT1序列的相干性。含有HSVTK的质粒p80-HSVTK,ku70.上游序列,潮霉素抗性标记(hyg),及ku70.下游序列被用作亲代质粒。这ku70.删除导致改善转化效率,并且HSVTK插入导致同源重组率增加[40].将p80-hsvtk质粒与Kpn在使用Multis套件(Vazyme Biotech Co.,Ltd.)来连接启动子和HGT1编码序列,以形成质粒p20和p21(附加档案1图S1a, b)。HGT1编码序列用P格拉P20的启动子和paox1p21。

表2这项工作中使用的引物

质粒P20和p21单独引入答:尼日尔CGMCC 10142年农杆菌-根据以前报告的方法介导的转化[4142]. 细胞在含200μg/mL真菌完全培养基(CM)上培养潮霉素为了筛选正确的转化体和Michielse及其同事报告的CM培养基[35].

CA的分析方法和稳定菌株的产生

来自cm +的转化体的新鲜菌丝 潮霉素首先将培养基转移到Cm + 0.5%的Caco中3.在35℃下培养72 h,通过比较透明晕带与菌落直径的比值来检测菌种的CA产率。更大的酸蚀周期表明更大的酸生产潜力。然后,对获得的带有大透明晕带的转化子进行PCR扩增验证。在验证插入片段后,为摇瓶发酵准备正确的转化子孢子悬浮液。

选择的转化传代培养CM培养基上15代,然后提取基因组DNA,以验证他们的遗传稳定性。此外,CA生产的摇瓶发酵再次测试。

在30L发酵罐中测定糖和柠檬酸产量

在30 L发酵过程中,每8 h在显微镜下检查一次细胞球。每8 h测定总糖、还原糖和CA浓度。残总糖和残还原糖含量采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法测定[43].将1ml稀释上清液与1ml DNS试剂一起置于沸水浴中5min,然后冷却至室温。在540 nm处的吸光度(A540测量)测量以确定还原糖。上清液中的总糖需要增加相等的体积6mol / L HCl并在沸水浴中加热30分钟,将pH调节至中性,然后通过DNS方法测定。使用相同的程序进行标准测量。

使用市售的检测试剂盒(test kit Cat)测定柠檬酸。没有:10139076035、罗氏、德国)。简单地说,在0.2 mL样品中加入1 mL溶液1(含甘氨酸缓冲液(pH = 7.8)、11.33 U l -苹果酸脱氢酶、23.3 U l -乳酸脱氢酶、0.42 mg NADH)和1.8 mL双蒸馏水。在20-25℃孵育5分钟后,读取A340..然后再加入20 μl溶液2(含0.8 U柠檬酸裂解酶),持续5 min340.用柠檬酸裂合酶反应后,监测。使用相同的程序进行标准测量。

实时定量聚合酶链反应

进一步研究葡萄糖转运体如何影响钙的代谢和积累答:尼日尔,在发酵过程中进行实时定量PCR。的相对表达HGT1.和编码相关的柠檬酸循环,柠檬酸合成酶和葡糖激酶关键限速酶的基因,进行了测定。用于定量PCR引物列于表2.12的颗粒和在CA发酵48小时,过滤,提取总RNA。然后,反转录物进行。

使用该相对基因转录水平计算\({2} ^{{- \ \δ{\文本{C}} _{{\文本{t}}}}} \)方法,将其归一化为18S rRNA (CGMCC 10142)。使用标准曲线使用克隆扩增子的稀释序列来计算基因特异性的实时qPCR效率。相关系数(R2)的标准曲线斜率计算每个基因的PCR扩增效率,如前所述[8.].

统计分析

所有结果均基于三个独立实验,具有P <0.05的样品被认为是显着的。

数据和材料的可用性

作者声明,重测序结果答:尼日尔CGMCC 10142基因组目前还不能公开,因为该基因组的研究还没有发表,国际专利正在申请中。

缩写

HGT1:

高亲和力葡萄糖转运仪1

CS:

柠檬酸合成酶

CA:

柠檬酸

DNS:

3,5-二硝基水杨酸

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下载参考资料

确认

不适用。

资金

国家自然科学基金资助项目(No. 31370075, No. 31471725, No. 31902193);山东省重点研发计划(人才培养计划)资助项目(No. 2016GRC3201);天津市微生物代谢与发酵过程控制工程研究中心资助项目(No. 17PTGCCX00190)。

作者信息

隶属关系

作者

贡献

XX和FB进行实验并起草手稿,DW构思研究并设计实验,BL、JL和LZ进行发酵实验并起草图表。JZ和QG对手稿进行了润色。所有作者都修改并批准了最终手稿。

通讯作者

对应于Depei Wang.

道德声明

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

作者宣布父母菌株的所有权答:尼日尔CGMCC 10142隶属于RZBC GROUP CO., LTD (http://www.rzbc.com/),授权他们只做基本的科学研究。

补充资料

出版商的注意事项

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

补充资料

附加文件1

图S1.p20和p21的重组质粒图谱。(a) glaA启动子(PglaA)转录过表达HGT1的重组质粒(p20);(b) aox1启动子(Paox1)转录过表达HGT1的重组质粒(p21)。图S2.HGT1基因过表达质粒及菌株的验证(a)质粒p20的验证,M: DNA标记III, 1: hyg (1389 bp), 2: PglaA -HGT1 (3312 bp), 3: HGT1-hyg (3217 bp), 4: PglaA -hyg (4710 bp);(b)质粒p21的验证,M: DNA标记III, 1: Paox1-hyg (4612 bp), 2: HGT1-hyg (3217 bp), 3: hyg (1389 bp), 4: Paox1-HGT1 (3223 bp);(c) A. tumefaciens p20和p21的验证,M: DNA标记III, 1: p20质粒对照,2-3:A. tumefaciens p20验证PglaA-HGT1 (3312 bp), 4: p21质粒对照,5-6:A. tumefaciens p21验证Paox1-HGT1 (3217 bp);(d)黑芽孢杆菌p20转化子验证,M: DNA marker III, 1: p20质粒对照,2:阴性对照,3-10:PglaA-HGT1 p20转化子基因组验证(3312bp);(e)黑芽孢杆菌p21转化子M: DNA标记III, 1: p21质粒对照,2:阴性对照,3-10:Paox1-HGT1 p21转化子基因组验证(3217 bp);(f) HTG1-hyg验证M: DNA标记III 1:质粒对照,2:阴性对照,2-10:转化子基因组HTG1-hyg (3217 bp) PCR产物;(g)从ku70上游到下游验证M: DNA标记III 1:质粒对照(5710 bp), 2阴性对照(1800 bp), 3-10:转化子基因组ku70扩增。图S3.葡萄糖转运体的多序列比对。图S4.验证潮霉素基因在第15代HGT1表达突变体。L:DNA标记III,1:阳性对照(1389碱基对),2:阴性对照,3-10:使用过表达突变体的基因组DNA扩增潮霉素基因。所有菌株的基因组从15代继代培养获得的。图S5.30 L生物反应器发酵柠檬酸菌丝球直径的测定

附加文件2

表S1.高产柠檬酸转化体的初始筛选。

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刘波。提高柠檬酸生产工业的黑曲霉CGMCC 10142:一种具有不同启动子的高亲和力葡萄糖转运体的鉴定和过表达。MicroB细胞事实20,168(2021)。https://doi.org/10.1186/s12934-021-01659-3.

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关键词

  • 黑曲霉
  • 葡萄糖转运
  • HGT1.
  • 柠檬酸发酵