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转录组学揭示了不同的代谢策略的耐酸和γ -氨基丁酸(GABA)的生产选择GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2Ba菌株GydF4y2Ba

摘要GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

在人类的许多神经递质,γ-氨基丁酸用于改善一些心理健康的适应症,如压力和焦虑(GABA)表演潜力。该菌群肠脑轴是GABA能作用的一个重要途径,因为肠道内微生物分泌的GABA能影响主机的心理健康状况。由肠道内微生物了解GABA的生成的分子特征可以洞察到心理健康的新疗法。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

三种菌株GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2Ba对于突出的谷氨酸脱羧酶(GAD),对整体生长,谷氨酸利用和GABA生产进行了评估,典型的合成生长培养基中补充有谷氨酸钠(MSG)。GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2BaLBR-6108™(LBR-6108),以前称为GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2BaDPC 6108,和GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2BaLBR-35™(LBR-35)具有类似的生长型材,但在GABA分泌和耐酸性中显着不同。LBR-6108在生长阶段内早期生产GABA,并且比LBR-35和菌株产生显着更高的GABAGydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2Ba静止阶段之后的ATCC 14869。通过RNA测序测定GABA产生期间GABA产生期间的全局基因表达。Gad操纵子负责GABA生产和分泌,在仅6小时的发酵后在LBR-6108中激活,并在整个固定阶段继续。此外,LBR-6108同时激活许多不同的耐酸性机制,这有助于耐酸性和能量产生。相比之下,LBR-35具有遗传上类似的GAD操纵子,包括两种GAD基因的副本,表明,即使用MSG培养,也没有对GAD操纵子的上调。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

这项研究是第一个评估整个转录组的变化GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2Ba在GABA生产的不同生长阶段。多重抗酸机制的同时表达揭示了常见人类共生体之间的生态位特异性代谢功能,并强调了GABA代谢在这一重要微生物物种中的复杂调节。此外,Lbr-6108的GABA产量的增加和快速增加突出了该菌株作为治疗药物的潜力,以及筛选微生物产生效应分子的总体价值。GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

在乳酸菌(LAB)中,γ-氨基丁酸(GABA)由谷氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶(GAD)操纵子编码的谷氨酸脱羧酶产生。细胞外谷氨酸也可通过作用于谷氨酰-tRNA合成酶或在糖酵解途径中由葡萄糖从头合成,从GAD途径分流至三羧酸循环以充电tRNA[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba].GAD操纵子由三个在细菌中负责分泌GABA的重要元素组成:编码的正转录调节因子GydF4y2Ba盖尔GydF4y2Ba编码的谷氨酸/氨基丁酸反转运体GydF4y2Ba寄郎GydF4y2Ba基因和谷氨酸脱羧酶酶编码GydF4y2Ba加达GydF4y2Ba或者GydF4y2Ba加油GydF4y2Ba基因(GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba].的数量GydF4y2Ba加达GydF4y2Ba或者GydF4y2Ba加油GydF4y2Ba在不同的实验室属中副本GydF4y2Ba肠球菌,链球菌,乳球菌,pediococcus,propimibactium,GydF4y2Ba和GydF4y2Ba乳酸杆菌GydF4y2Ba(Sensu Lato)是可变的[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]. 有趣的是,实验室中的大多数GAD系统都有一个GABA产生系统GydF4y2Ba迦得GydF4y2Ba(GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba或者GydF4y2BaB.GydF4y2Ba)基因,GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2Ba是唯一已知的物种编码GAD酶的生化2个相同同种型GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba].然而,GAD系统的遗传组织也可能在不同菌株之间有所不同GydF4y2Bal .短GydF4y2Ba大多数菌株有两份GAD编码基因的副本[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba].在里面GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2Ba染色体,Gad操纵子包括GydF4y2Ba寄郎GydF4y2Ba和GydF4y2Ba加油GydF4y2Ba基因,而GydF4y2Ba加达GydF4y2Ba基因是从遥远的下游GydF4y2Ba迦得GydF4y2Ba操纵子(GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba].Gad Operon还包括GydF4y2Ba盖尔GydF4y2Ba,它正调节GABA生产于谷氨酸 - 依赖性方式,是从谷氨酸GABA转换必不可少[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

GABA是身体和中枢神经系统(CNS)中主要的抑制性神经递质,其功能是减少与之结合的神经元的活动,抑制神经传递并平衡兴奋性神经递质谷氨酸的作用[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba].GABA的作用是通过离子性GABA介导的GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba作为由不同亚基(α,β和γ亚基)的共同组装形成的许多亚型存在的受体,其存在于不同亚基(α,β和γ亚基)和代谢性GABAGydF4y2BaB.GydF4y2Ba受体是G蛋白偶联受体,其由由两个亚基组成的异二聚体组成(GABAGydF4y2BaB1.GydF4y2Ba和加巴GydF4y2BaB2.GydF4y2Ba),其中两个是必要的受体的功能[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba].临床相关药物,如抗焦虑药和骨骼肌弛缓药以GABA受体为靶点(例如,作用于GABA的苯二氮卓类)GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba作用于加巴的受体和baclofenGydF4y2BaB.GydF4y2Ba受体)。因此,在GABA能神经传递的改变在与压力有关的精神疾病发展的重要作用。GABA受体也被广泛整个身体和互补GABA的CNS功能分布,GABA的多功能作用已经在位于所有沿着胃肠道,调节功能,如肠道蠕动,胃排空肠神经系统(ENS)研究,伤害感受,和酸分泌[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba],在胰腺中,甚至在免疫细胞中[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba].GABA是一种非蛋白质氨基酸,天然存在于各种食品和饮料中,如茶,番茄,大豆,发芽的水稻和一些发酵食品,如泡菜和发酵鱼。最近,加巴食品补充剂已成为自然增加膳食加巴的流行方式,具有潜在的健康益处[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba].了解GABA如何影响心理健康是非常重要的,因为精神疾病预计到2030年的全球成本为16万亿美元[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

微生物液 - 肠轴轴是CNS和肠道微生物之间的双向通信途径,其在肠脑轴内的几种直接和间接途径介导的[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba].先前的研究表明,无菌动物,即那些自出生以来就没有接触过任何微生物的动物,体内和血清中的GABA水平都降低了[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba],表明肠内的微生物可以在原位产生主体识别的GABA [GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba].进一步的研究表明,具有实验室等共生生物在肠脑信号中发挥着重要作用[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba].例如,补充GydF4y2BaLacticaseibacillus喂食GydF4y2Ba先前显示JB-1以减少小鼠的应激诱导的皮质酮和焦虑和抑郁相关的行为,同时还诱导大脑中GABA受体表达中的区域依赖性改变[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba].该开创性研究突出了肠道微生物群在影响沿微生物血管血管轴轴的信号通路中的作用,以影响脑功能和行为。GydF4y2Ba

使用GAD操纵子产生的GABA具有谷氨酸依赖的抗酸能力GydF4y2Ba加达GydF4y2Ba还将其活性保持在近中立细胞溶质pH(pH 5.5-6.5)[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba].的功能GydF4y2Ba寄郎GydF4y2Ba逆向转运蛋白在酸性(pH值3.5-5.5)条件下活化[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba],当有细胞外和细胞内酸化时,主要处于固定阶段的生长阶段。因此,在GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2Ba两种GAD基因在一起可以有助于高效的GABA合成能力(pH 3.0-6.6)[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba], 制作GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2Ba在实验室中的最高GABA生产物种[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba].此外,实验室已经进化了其他耐酸性机制,包括F0F1-ATP酶系统,氨基酸/阳离子:质子炔烃,酪氨酸脱羧酶体系,毒素脱氨酶系统,精氨酸脱氨酶系统和尿素系统[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba].这些系统都能抵消发酵过程中产生的酸胁迫或在宿主体内遇到的酸胁迫。GydF4y2Ba

以前的研究以筛选人肠衍生的双歧杆菌和乳酸杆菌用于从谷氨酸单钠(MSG)产生GABA的能力揭示了最高的GABA产生分离物GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2BaDPC 6108,现在商业知名GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2BaLBR-6108™(LBR-6108),一种从婴儿粪便样本培养的分离物[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba].Lbr-6108以前被证明会增加健康大鼠的血清胰岛素水平[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba].随后,在饮食诱导肥胖的小鼠模型中,肥胖小鼠在补充Lbr-6108 12周后,几种与代谢功能障碍相关的代谢异常得到改善,抑郁样行为减少,小肠内内源性GABA浓度增加[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba].在一起,这些研究表明Microbly-Mably GABA对LBR-6108影响宿主健康的潜在作用[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba].我们假设LBR-6108可以是基因上独树的并且主要使用GAD系统作为优选的酸性耐受机制,因此可以是主体的微生物衍生的GABA的有效源。在本文中,我们通过与另外两个相比调查了LBR-6108的GABA生产和生长特征GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2Ba菌株,商业益生菌GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2BaLBR-35™(LBR-35)和型菌株GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2BaATCC 14869(ATCC 14869)使用体外方法辅以RNA测序来探索LBR-6108的独特GABA生产能力。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

基因组分析GydF4y2BaLevilactobacillusGydF4y2BaLBR-6108,LBR-35和ATCC 14869显示了GAD操纵子同步。GydF4y2Ba

Lbr-6108和ATCC 14869的总基因组大小分别为2,884,677 bp和2,473,148 bp。Lbr-35的新草图基因组位于6个连续序列中,总长度为2338793 bp, G + C含量为46.1%。此外,Lbr-35基因组注释显示了2328个编码区,62个tRNAs, 15个rnas,以及15个spacer的单个CRISPR重复间隔序列。利用所有公开的基因组进行系统基因组分析,揭示了三种主要的演化支GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba一种)。LBR-6108和ATCC 14869都是属于同一落后的粪便分离株,而LBR-35位于单独的应变组中。LBR-35是一种商业益生菌,但隔离源是不知道的,然而,它最常见的群体GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2BaHQ1-1,从传统乳制品中分离。而三GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2Ba菌株共有2029个基因,其中Lbr-6108在50万bp的基因组区有697个基因。Lbr-6108与Lbr-35共有38个基因,Lbr-6108与ATCC 14869共有261个基因(图1)。GydF4y2Ba1GydF4y2BaB) Lbr-6108更大的基因组大小说明了一个或多个大质粒和许多独特的基因,如原噬菌体相关蛋白和新生脂肪酸生物合成基因,以及一些调控因子和磷酸转移酶摄取系统的基因。GydF4y2Ba

图。1GydF4y2Ba
图1GydF4y2Ba

Gad操纵子的基因组比较GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2Ba菌株。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba系统发育树GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2Ba基于PATRIC数据库的系统发育树建设服务[使用RAxML 500个核心蛋白种类GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba].使用100个回合RAxML的“快速”引导选项的生成支持值;仅自引导值低于100被示出。树的规模在每个站点的氨基酸取代给出。基因组大小被示为每个叶的左侧。三种不同的进化支阴影不同的颜色。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba循环基因组图将整体蛋白质同源性与内部外部表示ATCC 14869,LBR-35和LBR-6108的环。Venn图显示了共享基因的数量。热图显示了双向最佳击中(顶部)和Unitivection-Al最佳击中(底部)的百分比蛋白质序列同一性。GydF4y2BaCGydF4y2Ba谷氨酸代谢的基因的概述GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2Ba,包括规范的gad操纵子和单独的GydF4y2Ba加达GydF4y2Ba

L. Brevis.GydF4y2Ba已被证明唯一编码两个GAD基因[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba].的确,所有三个GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2Ba这里评估的菌株有两个副本GydF4y2Ba加达GydF4y2Ba和GydF4y2Ba加油GydF4y2Ba.这GydF4y2Ba加油GydF4y2Ba基因与转录调节器一起在Gad操纵子中(GydF4y2Ba盖尔GydF4y2Ba),谷氨酸/γ-氨基丁酸酯抗纤维(GydF4y2Ba寄郎GydF4y2Ba)和谷氨酸-TRNA合成酶(GydF4y2Bagltx.GydF4y2Ba),而GydF4y2Ba加达GydF4y2Ba基因是单独的基因(图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaC)。成对整个GAD操纵子的一对核苷酸对准显示LBR-6108分别与LBR-35和ATCC 14869相同的99.0%和99.3%。没有找到大的插入或删除。同时比较单个蛋白质的氨基酸序列,LBR-6108对LBR-35具有100.0%氨基酸序列同一性GydF4y2Ba盖尔GydF4y2Ba那GydF4y2Ba寄郎GydF4y2Ba, 和GydF4y2Ba加油GydF4y2Ba.与ATCC 14869相同的比较显示单一突变GydF4y2Ba盖尔GydF4y2Ba那GydF4y2Ba寄郎GydF4y2Ba, 和GydF4y2Ba加油GydF4y2Ba相比lbr - 6108。lbr - 6108GydF4y2Ba加达GydF4y2Ba蛋白质序列分别为98.9%和99.8%(参考PATRIC?),与Lbr-35和ATCC 14869的序列相同。三个启动子区预测在基因间区直接上游GydF4y2Ba盖尔GydF4y2Ba在LBR-6108中。LBR-35中的两种促进区域中两种的代序序列是高度多态性的,这可能影响GAD操纵子的总体表达。GydF4y2Ba

Lbr-6108在发酵早期就能迅速产生GABA。GydF4y2Ba

所有菌株均在初始pH为5.5 ~ 6的培养基中生长于De Man-Rogosa-Sharpe肉汤(MRS)或MRS + MSG中。在两种培养基中,Lbr-6108和Lbr-35在T48时均无显著差异,但ATCC 14869在T48时显著低于Lbr-6108(图1)。GydF4y2Ba2GydF4y2BaA-C,附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。在ATCC 14869中,生长速度较慢与接种量较低(平均OD值低0.040)不成正比GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。虽然LBR-6108和LBR-35的生长均达到21h时间点(T21)周围的生长的预固定阶段(图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaA,B),ATCC 14869在前24小时中增长比LBR-6108和LBR-35(比较ODS比较OD)增长了大约五倍,之后ATCC 14869开始呈指数增长(图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaC)。对于所有的生长曲线GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2Ba菌株in MRS and MRS + MSG is shown in Fig.2GydF4y2BaD.培养的pH没有降低pH5以下,这在Lab中的GAD的最佳pH范围内[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba],在任何时间点。GydF4y2Ba

图2GydF4y2Ba
图2.GydF4y2Ba

微生物GABA生产和谷氨酸利用GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2Ba菌株。通过液相色谱 - 质谱法从细胞自由培养上清液测量GABA和谷氨酸,以μg/ ml为单位表示。用于定量GABA的检测限(LOD)为50μg/ mL,对于谷氨酸为100μg/ mL。符号进一步解释UN-DER图表类型。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba-GydF4y2BaCGydF4y2Ba加巴(塔尔和GydF4y2BaL.GydF4y2Ba- 在生长期间在每个时间点(X轴)的培养上清液(右Y轴)中测量的 - 谷酸(蓝色)在生长期间(右手Y轴上的600nm处)GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2Ba菌株lbr - 6108 (GydF4y2BaB.GydF4y2Ba), Lbr-35 (GydF4y2BaCGydF4y2Ba)和ATCC 14869(GydF4y2BaD.GydF4y2Ba)在没有(虚线和开放符号)的MRS培养基中,并且用10,000μg/ ml谷氨酸甲酸钠(MSG)(实线和封闭的符号)。GydF4y2BaD.GydF4y2Ba所有的生长曲线GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2BaMRS培养基中的菌株,没有10,000μg/ mL MSG进行比较。GydF4y2BaE.GydF4y2Ba随着时间的推移,GABA的产生随着LBR-6108在补充有10,000μg/ ml,30,000μg/ ml或90,000μg/ ml的MSG的MRS培养基中。条形图代表GABA生产(左Y轴)以μg/ ml制备的GABA,而黑色金刚石显示产率的百分比(计算为GABAμg/ ml /谷氨酸使用μg/ ml)(右Y轴)。误差栏可能被符号和框模糊GydF4y2Ba

GABA的可检测量(> 早在T6,Lbr-6108就以66µg/mL的浓度产生了50µg/mL),并且在MRS中T15处生长的预固定相附近达到了最大值520µg/mL(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一个,附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。天然谷氨酸含量为650-700µg/mL (0.065-0.07%), T15后,Lbr-6108迅速将其利用至100µg/mL,谷氨酸转化为GABA的转化率为86.0%(图)。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一种)。此外,通过LBR-6108生产GABA的在加入万微克/毫升(1.0%)游离谷氨酸基板的MSG在媒体(图的形式增加。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba) 2.5倍增加GABA生产观察T15相比,经济增长没有添加谷氨酸,紧随其后的是进一步利用媒体过多的谷氨酸导致转换添加谷氨酸和生产的97.0%超过十倍的GABA在48小时(无花果。GydF4y2Ba2GydF4y2BaA).菌株GAD谷氨酸酶转化的最大活性出现在固定后阶段(T24),此时GABA产量比T21增加39.2%,谷氨酸利用率增加34.7%(图)。GydF4y2Ba2GydF4y2BaA) 。MRS中T48处GABA的最终浓度 + MSG为6000μg/mL或6 g/L,与之前Lbr-6108的测量结果相似[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

注意到产生从谷氨酸LBR-6108的能力GABA,该菌株被用于其增加的GABA产生能力通过增加更多的基板(MSG)到媒体的测试。在谷氨酸在媒体为10,000微克/毫升的增加,至30,000微克/毫升和90000μg/ mL的增加的GABA的量产生由应变。GABA的量T24和T48几乎与1.0%MSG一倍之间产生,以3.0%MSG增加243.0%,并用9.0%MSG增加607.0%(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba表S2,图GydF4y2Ba2GydF4y2Bae)。在T48之后,LBR-6108的谷氨酸利用百分比似乎放缓,尽管在每个系列中的T72仍然增加了GABA产量。通过GABA生产的可用谷氨酸的GABA产量除以谷氨酸利用率,含有10,000μg/ mL MSG制剂,并持续增加时间点(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba表S2,图GydF4y2Ba2GydF4y2BaE),与正被在pH 5(空白培养基pH 5.5-6)所有在T24的细菌培养基。在T48,在万微克/毫升MSG培养基中的细菌培养仍然在pH 5,但30000μg/ mL和90,000微克/毫升MSG-含有培养基分别增加至pH 7和pH 8,。GydF4y2Ba

对T0、T24、T48直接收获的细胞微球进行菌株特异性PCR和16S测序,确保收获的菌株是纯的。Lbr-6108和Lbr-35之间未发现污染GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图。S1)。GydF4y2Ba

GABA生产的时间并不是GAD操纵子的存在。GydF4y2Ba

在MRS和MRS + MSG中,Lbr-6108是唯一一株在生长6h就能产生可检测数量的GABA的菌株(图)。GydF4y2Ba2GydF4y2BaA).在Lbr-35和ATCC 14869中,Lbr-35的生长曲线与Lbr-6108最相似,而ATCC 14869在相同介质中生长非常缓慢(图1)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bad)。然而,仅在T21-T24下观察到MRS中的LBR-35产生的可检测量的GABA(80-82μg/ ml),其由T48加倍(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab)。在MRS + MSG中,LBR-35的G​​ABA生产没有大幅增加(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba此外,Lbr-35在MRS和MRS + MSG生长平稳至平稳后阶段产生的GABA水平较低,反映在谷氨酸的有限利用上(最大利用达20.0%)(图)。GydF4y2Ba2GydF4y2BaB) 。对于ATCC 14869,MRS或MRS中的生长模式 + MSG与Lbr-6108和Lbr-35相比差异很大,ATCC 14869产生的GABA与Lbr-35相当,仅在T24-T48之间观察到可检测的GABA量(图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaC)。LBR-6108和LBR-35取样用于RNA测序,因为他们相似的生长特性,但不同的GABA的生成能力。ATCC 14869未取样用于RNA测序,因为其较慢的生长模式预计偏斜GAD操纵子表达的结果。GydF4y2Ba

Lbr-6108在发酵早期表达GABA产生的基因。GydF4y2Ba

主成分分析图显示了基因表达的广泛趋势(附加文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图。S2),具有在同一组中聚类的样本的复制。然而,对于MRS + MSG中的LBR-35,来自T6和T12的一个复制之一聚集在一起而不是与它们各自的复制聚类。在LBR-6108中,T18显示了基因表达的最大差异(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba).T18 MRS + MSG样本与T12的基因表达更相似,而MRS样本与T24的基因表达更相似GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:无花果S2)。数字GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba示出了与在T6各自的前日志相基因表达的显著差异表达的基因在不同的生长阶段LBR-​​6108和LBR-35单独的(DEGS)和。一般而言,DEGS的数量随时间增加,与在T24两种菌株相比T6(图观察到的DEGS最大数目。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba(A, B).在MRS和MRS + MSG中,Lbr-6108在生长早期比Lbr-35表现出更多的DEGS (T12比T6)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba氟)。此外,在Lbr-6108 (T12)生长的中对数期,MRS + MSG中有14个差异表达基因,而在Lbr-35 (T12)生长的同一时期,MRS + MSG中只有2个差异表达基因(图)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bae)。LBR-6108的十四个基因由假想的蛋白质,转运蛋白和其他糖酵母发酵等组成,以及GydF4y2BaThid2.GydF4y2Ba在吡哆醛-5'-磷酸酯(PLP)操纵子中,尽管具有类似的生长曲线,但仍然突出了菌株之间的一般生长特性的细微表达差异(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa,b)。GydF4y2Ba

表1中表达量最高的前20个基因GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2BaLBR-6108(顶部)和LBR-35(底部)比较T18至T6,在MRS中以10,000μg/ mL谷氨酸氧酯GydF4y2Ba
图3GydF4y2Ba
图3.GydF4y2Ba

心烦图,以显示显著差异表达的基因GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2Ba在整个实验过程中使用Lbr-6108和Lbr-35。单独的行仅由MRS表示(−(MSG)或 + 味精(+ MSG)后接时间点编号。顶部的图表比较了在相同时间点但在不同培养基(MRS和MRS)下显著表达的基因数量 + 味精)用于(GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba)LBR-6108和(GydF4y2BaB.GydF4y2Ba) Lbr-35。中间图比较T12(中日志),T18(中间日志),T18(预静止)和T24(静止)(GydF4y2BaCGydF4y2Ba)LBR-6108和(GydF4y2BaD.GydF4y2Ba) Lbr-35。下图比较了(GydF4y2BaE.GydF4y2Ba)LBR-6108和(GydF4y2BaFGydF4y2Ba)LBR-35GydF4y2Ba

在两种培养基中,Lbr-6108和Lbr-35之间的GAD操纵子调节差异很大,尽管在生长曲线的相似点取样培养物(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一个,附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S3)。比较LBR-6108中的T12至T6,基因表达的折叠变化GydF4y2Ba加油GydF4y2Basignificantly increased 2.47 × and 3.28 × in MRS and MRS + MSG, respectively (Fig.4.GydF4y2Ba一种)。这GydF4y2Ba加达GydF4y2Ba表达在任何时间点之间都没有显著变化,表明GydF4y2Ba加油GydF4y2Ba是LBR-6108中的主要谷氨酸脱羧酶(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种)。这GydF4y2Ba加油GydF4y2Ba表达在T18继续增加,但在T24下降(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种)。正如预期的那样,GydF4y2Ba寄郎GydF4y2Ba在整个实验中,基因表达同样增加GydF4y2Ba加油GydF4y2Ba,它在MRS + MSG中的表达几乎是MRS的两倍(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种)。这GydF4y2Ba盖尔GydF4y2Ba在MRS中从T12-T18上调近两倍,但在MRS中上调超过四倍 + 味精(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaA)。重要的是,GydF4y2BathGydF4y2Ba家庭吡哆醛激酶基因GydF4y2BathiD2,GydF4y2Ba催化吡哆醛对PLP的磷酸化,表达式类似于GAD操纵子,证实LBR-6108生产的能力,该能力PLP为GAD催化功能所需的[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba] (无花果。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab)。有趣的是,RNA表达映射表明GydF4y2Ba盖尔GydF4y2Ba那GydF4y2Ba寄郎GydF4y2Ba那GydF4y2Ba加油GydF4y2Ba, 和GydF4y2Bagltx.GydF4y2Ba全部共转录,因为读取覆盖率类似并且在所有基因上保持(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaA) 。根据RNA测序数据,GAD操纵子显示出预期的表达模式,因为GAD操纵子的cDNA读取覆盖率从预测的启动子区域直接上游开始GydF4y2Ba盖尔GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab)。GydF4y2Ba

图4.GydF4y2Ba
图4.GydF4y2Ba

耐酸性操纵子的基因表达GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2Balbr - 6108和Lbr-35。每个象限显示LBR-6108和LBR-35在MRS和MRS的生长期间基因的标准化RNA表达,MRS和MRS具有10,000μg/ mLMSG。基因符号在表S2中定义,如下所示:GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba加达GydF4y2Ba,谷氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.15);GydF4y2Ba盖尔GydF4y2Ba,转录调节子;GydF4y2Ba寄郎GydF4y2Ba谷氨酸/ gamma-aminobutyrate逆向转运;GydF4y2Ba加油GydF4y2Ba,谷氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.15);GydF4y2Bagltx.GydF4y2Ba,谷氨酸-TRNA合成酶(EC 6.1.1.17; EC 6.1.1.24)。GydF4y2BaB.GydF4y2BaHMPTGydF4y2Ba,底物 - 特异性的预测羟甲基ECF反式看门的组分HMPT;GydF4y2BaThid2.GydF4y2Ba,新型吡哆醛激酶,胸苷(EC 2.7.1.35);GydF4y2Ba北方GydF4y2Ba, pyridoxine metabolism / Pyri-doxamine phosphate aminotransferase的转录调节因子(EC 2.6.1.54)。GydF4y2BaCGydF4y2Baargf.GydF4y2Ba,鸟氨酸氨基甲酰基转移酶(EC 2.1.3.3);GydF4y2Ba阿里卡GydF4y2Ba,精氨酸半亚胺酶(EC 3.5.3.6);GydF4y2Baarcd.GydF4y2Ba,精氨酸/鸟氨酸altiporter。GydF4y2BaD.GydF4y2BaAgua.GydF4y2Ba胍丁胺脱胺酶(EC 3.5.3.12);GydF4y2BaagGydF4y2Ba,胍丁胺/腐胺反转运蛋白,与胍丁胺分解代谢有关;GydF4y2Ba拍手GydF4y2Ba,腐胺氨甲酰转移酶(EC 2.1.3.6)。GydF4y2BaE.GydF4y2BaMLEP.GydF4y2Ba,雄性允许;GydF4y2Ba马尔斯GydF4y2Ba,苹果酸乳酸酶(EC 4.1.1.101);GydF4y2BamGydF4y2Ba,发炎性调节剂。GydF4y2BaFGydF4y2BaNHAC2.GydF4y2Ba的,预测的酪氨酸转运蛋白,NHAC家族;GydF4y2Ba加入GydF4y2Ba,预测酪氨酸转运仪,胶铁家族;GydF4y2BatdcAGydF4y2Ba那GydF4y2BaL.GydF4y2Ba- 替氏菌脱羧酶(EC 4.1.1.25);GydF4y2Ba酪氨酸GydF4y2Ba,酪锥基-TRNA合成酶(EC 6.1.1.1)GydF4y2Ba

图5.GydF4y2Ba
图5.GydF4y2Ba

RNA表达概述GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2BaGad操纵子。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba该RNA测序读覆盖率由数形式的蓝色曲线表示为GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2BaLBR-6108在T18的10,000μg/ mL MSG中。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba这GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2BaGad操纵子由橙色箭头和石灰绿色箭头表示的推定启动子。GydF4y2BaCGydF4y2Ba的DNA序列的成对比对GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2BaLbr-6108、Lbr-35和ATCC 14869用绿色表示100%同一性,黄色表示30-99%同一性。单个GAD操纵子序列多态性用灰色条形图中的黑线表示GydF4y2Ba

由于Lbr-35的GAD操纵子与Lbr-6108高度相同,因此预计Lbr-35的GAD操纵子具有一定的活性。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaC),但令人惊讶的有在从T6-T24的表达没有变化显著,除了的下调GydF4y2Ba加达GydF4y2Ba在T18-MRS,T12-MRS和T18-MRS + MSG(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种)。LBR-35中的GAD操纵子表达模式在MRS介质中的额外MSG的情况下生长并没有不同。在MRS + MSG和MRS中生长的LBR-35段中,18(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaC)和51(图GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba分别B)的基因,是差异在所有时间点在整个应变的过去数中期(T12,T18,和T24)的生长表示。那些度的视角,基因在丁胺脱亚氨酶途径,包括丁胺脱亚氨酶GydF4y2BaAgua.GydF4y2Ba(酶种类(EC)3.5.3.12)和胍丁胺/腐胺反向转运蛋白GydF4y2BaagGydF4y2Ba,对LBR-6108和LBR-35均上调(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaC)。在LBR-6108中,精氨酸脱氨酶型术术在MRS和MRS + MSG的生长的T24中高度表达(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaD) 。FGydF4y2BaO.GydF4y2BaFGydF4y2Ba1GydF4y2Ba-ATPase术语,其由ATP合成酶链的多个亚基组成,除了在MRS和MRS + MSG的几个时间点,除了LBR-6108中的ATP合酶ε链(EC 3.6.3.14)之外的任何菌株没有显着变化(数据不是所示)。在T18在MRS + MSG中,LBR-6108中的最高GAD操纵子表达的时间点,LBR-35在LBR-35中是显着表达多个噬菌体溶酶相关基因,转运蛋白的基因,以及三种聚集促进因子(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba).GydF4y2Ba

对于耐酸性和能量产生其它代谢途径与在LBR-6108的GAD操纵子同时表达。GydF4y2Ba

在LBR-6108,153和117之间观察到在T12的中耳阶段,直到SmRS和MRS + MSG中的静止相位(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba).在MRS中发现的153度的视角的部分是高度表达精氨酸脱亚胺酶操纵子,其中包括精氨酸/鸟氨酸逆向转运的基因GydF4y2Baarcd.GydF4y2Ba,鸟氨酸carbamoyltransferaseGydF4y2Baargf.GydF4y2Ba(EC 2.1.3.3)和精氨酸脱氨酶GydF4y2Ba阿里卡GydF4y2Ba(EC 3.5.3.6)(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bad)。已知恶性发酵可以减少酸度[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba],实际上是恶性酶GydF4y2Ba马尔斯GydF4y2BaLbr-6108中的基因在不同的时间点增加(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bae)。苹果酸通透GydF4y2BaMLEP.GydF4y2Ba在MRS和MRS + MSG的T12在T12略微上调雄性发酵操纵子(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba同样地,MRS + MSG中Lbr-6108的117个DEGs(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bae)包括在胍氨基氨基氨酶,丙乳乳酸发酵和酪氨酸脱羧酶操纵子中对基因的上调(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba氟)。重要的是,在酪氨酸脱羧酶操纵子只酪氨酰-tRNA合成酶基因GydF4y2Ba酪氨酸GydF4y2Ba酪氨酸脱羧酶基因诱导率高GydF4y2BatdcAGydF4y2Ba未在任何测试的菌株或条件下诱导的任何时间点。此外,精氨酸脱氨酶酶始终上调并在两种介质中生长时的程度相同(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bad)。重要的是,在MRS和MRS + MSG中上调的许多这些基因与LBR-6108中的不同酸性电阻机制有关[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba].一般来说,GydF4y2BaL.GydF4y2Ba- 和GydF4y2BaD.GydF4y2Ba- 在LBR-6108中,寄生脱氢酶基因未显着上调或下调,表明培养物中存在稳定地产生乳酸(数据未显示)。GydF4y2Ba

由于这些代谢组中的许多都与耐酸性有关,因此Lbr-6108与Lbr-35相比耐酸性增加。在枚举活细胞之前,两株菌株都暴露在酸化培养基中不同长度的时间。在pH为3.0的基础培养基中暴露3小时后,Lbr-6108的活细胞数减少了其初始浓度的不显著数量(< 1.0%)。相比之下,在相同的暴露参数下,Lbr-35显著降低了2个对数。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba).使用基于碳水化合物的盐碱培养基评估酸性抗性是由于基础培养基中的碳水化合物,氨基酸,肽或其他营养物摄取增加。实际上,当暴露于盐水溶液中的pH胁迫时,两种菌株显着降低了(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba),尽管LBR-6108显着高于LBR-35。这表明LBR-6108通过代谢碳水化合物来诱导耐酸性。GydF4y2Ba

图6.GydF4y2Ba
图6.GydF4y2Ba

耐酸碱培养的耐酸性GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2Balbr - 6108和Lbr-35。在MRS中过夜培养,然后在pH为3.0的基础培养基和pH为3.0的0.5%盐溶液中进行酸攻毒,以确定菌株的存活率。所有培养物在37°C下生长至静止相过夜。立即评估活细胞计数,并在暴露于酸性环境后2小时和3小时测定回收率。值代表四份生物复制的平均值,误差棒代表标准误差。经Tukey多重比较检验的双向方差分析,****的条形图差异显著(p < 0.0001)GydF4y2Ba

讨论GydF4y2Ba

虽然在糙米芽菜、菠菜、大麦和豆芽等植物性食物中GABA相对丰富(300-720 nmol/g干重),但根据某些安慰剂对照研究,含有GABA的食物不能满足消费者的需求[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba].使用天然或生物合成的GAB的过去临床试验的系统审查表明,用于应力减少的有效剂量不是标准浓度,而不是2.01至100mg的范围,较低剂量影响自主主义标志物和影响中央标记的更高剂量。效力是必要的延长摄入而不是单剂量[GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba].这突出了可以定期消耗的加巴巴安全来源的重要性。包括实验室在内的微生物是GABA的重要来源[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba42GydF4y2Ba],在Lactobacilli这样的实验室中的GABA产生能力在物种和菌株之间变化了[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba-GydF4y2Ba47GydF4y2Ba].最近,将孤立高GABA生产乳杆菌菌株以满足消费者的需求[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba那GydF4y2Ba48GydF4y2Ba].在这个手稿中,我们试图进一步调查GABA生产的应变特定机制GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

增长实验显示LBR-6108在发酵期间开始在发酵过程中产生GABA,而不是测试的其他两个菌株在发酵后6小时内。许多出版物表明,GABA输出的最佳时间是经过几天的增长,通常至少为48小时[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba49GydF4y2Ba].确实,Lbr-35和ATCC 14869仅在24-48 h产生了相当数量的GABA, GABA的增加与实验中谷氨酸浓度的降低是一致的。MRS是用于生长实验的合成培养基,其固有谷氨酸水平与肉食者、鱼食者、素食者和纯素食者的平均日谷氨酸摄入量大约为15克相似[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba].味精,即谷氨酸钠盐,广泛用于商业食品工业作为增味剂。在美国和欧洲,平均日摄入量约为0.6克(0.3-2.0克/天),在东亚和东南亚国家为2-3倍[GydF4y2Ba52GydF4y2Ba-GydF4y2Ba54GydF4y2Ba].谷氨酸用作兴奋性神经递质,然而过量的谷氨酸可能导致它在其结合的细胞内增加激发反应,导致称为“兴奋毒性”的过程中的细胞死亡[GydF4y2Ba55GydF4y2Ba].事实上,在欧洲联盟,最终食物中的谷氨酸含量不应超过每公斤10克[GydF4y2Ba51GydF4y2Ba].因此,尽管味精作为增味剂是食品行业是有利的,无处不在使用这种食品添加剂可能有对公众健康有害的后果[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba那GydF4y2Ba56GydF4y2Ba那GydF4y2Ba57GydF4y2Ba].由于平均胃肠道转运时间平均健康的成年人约为30小时[GydF4y2Ba52GydF4y2Ba[LBR-6108,GAD操纵子的快速激活可以允许谷氨酸钠盐在体内有益转化为GABA。GydF4y2Ba

生长和RNA测序实验证实,Lbr-6108比其他具有相似生长模式和联腱GAD操纵子的菌株产生更多GABA,并且GAD操纵子相应上调。Lbr-35被用作阴性对照,以评估最近审查的各种转录组学策略,这些策略可以解释GABA产生的差异[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba].既GAD基因的同时表达GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2Ba将增加加巴生产,但只有GydF4y2Ba加油GydF4y2Ba基因显示LBR-6108中的差异表达。最近的一项研究表明,来自孤立的GABA的增加GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2Ba来自中国光香芳香型酒可以部分归因于过度活跃GydF4y2Ba盖尔GydF4y2Ba基因[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba].同样,增加表达GydF4y2Ba寄郎GydF4y2Ba允许更多的基质从细胞外环境引入。此外,PLP操纵子的上调确保有足够的辅助因子用于脱羧过程。GAD操纵子中的基因在Lbr-6108中似乎没有构成性表达,因为它们的表达随谷氨酸浓度和时间的变化而波动。然而值得注意的是,rna测序结果显示GAD操纵子和GydF4y2Bagltx.GydF4y2Ba是共同转录的,其在通过QPCR QPCR中确定并扩展结果GydF4y2Ba寄郎GydF4y2Ba和GydF4y2Ba加油GydF4y2Ba来自以前的研究[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba].压制从Gad操纵子重定向谷氨酸的途径的关键基因,例如GydF4y2Bagltx.GydF4y2Ba出于翻译或GydF4y2Ba盖GydF4y2Ba将谷氨酸分流给三羧酸循环或减少F.GydF4y2BaO.GydF4y2BaFGydF4y2Ba1GydF4y2Ba- atp酶系统,也会增加GABA的输出。对于为什么Lbr-6108比Lbr-35更能产生GABA,这些假设都进行了评估,但没有一个被确定为Lbr-35与Lbr-6108差异如此之大的直接遗传或转录组原因。Lbr-35中GAD操纵子的表达在发酵过程中没有增加,即使添加了味精GydF4y2Ba加达GydF4y2BaLbr-6108和Lbr-35在任何条件下的表达均无变化。两种菌株都没有GydF4y2Ba盖GydF4y2Ba同源物,和GydF4y2Bagltx.GydF4y2Ba尽管整体序列同源性,但只有在LBR-6108中增加。F.GydF4y2BaO.GydF4y2BaFGydF4y2Ba1GydF4y2Ba-ATPase系统在任一应变中的任何条件下没有显着增加。有趣的是,这GydF4y2BaThid2.GydF4y2Ba尽管MRS在两种菌株中,PLP操纵子中的基因在LBR-6108中的表达显着增加了LBR-6108。未来的研究直接量化PLPGydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2Ba将在进一步分析其转录效果很有用。在LBR-6108的GAD操纵子的鉴定上游A推测的启动子区域可以增加GAD操纵子的表达,但需要进一步的分析。总之,这凸显了超越GAD操纵子活化乳酸杆菌为GABA全球监管的复杂性。GydF4y2Ba

的RNA测序还透露,LBR-6108激活几个其他的耐酸性途径同时与GAD操纵子。虽然pH值在实验定性测量,以确保菌株保持在最佳GABA产生pH值GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2Ba,进一步的实验滴定高低pH值,特别是考虑到大小肠的pH水平,可能会揭示巨大的转录效果。尽管如此,GABA的快速生产伴随着几种其他耐酸机制的激活,包括精氨酸序列和雄性发酵。重要的是要突出那种将催化生物胺酪氨酸并对宿主有毒的实际酪氨酸脱羧酶基因并未上调,而是酪氨酰-TRNA合酶。这些过程不仅重要的是耐酸性,而且对于产生质子动力而言,对于能量产生来产生质子[GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba].人们很容易假设lbr - 6108,这是独立于婴儿粪便微生物群,代表复杂的婴儿肠道微生物群,是习惯了能源和底物清除,所以激活各种策略在增长阶段的早期或在固定相,精氨酸的操纵子。这可能有助于增加未成熟婴儿微生物群中的共生生物,因为GABA最近被证明是不可培养的人类微生物的重要生长因子[GydF4y2Ba53GydF4y2Ba].相比之下,Lbr-35可能习惯于在食物环境中资源有限的条件下工作,只有在严重的酸胁迫或缺乏能量时才会产生过量的GABA。需要进一步的实验来评估GABA生产作为一套多样化资源获取策略的副产品的假设。GydF4y2Ba

LBR-35从LBR-6108有很大不同的响应中在生长培养基中的谷氨酸,尽管具有相似的生长模式。最近的研究还表明,GABA生产GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2Ba并不取决于最优增长[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba[但是,筛选各种碳水化合物可能会增加LBR-35中的GABA产生。我们发现,GAD操纵子中没有在有或没有消息的MRS中的LBR-35中没有显着表达。在LBR-35 RNA测序中上调的酸性抗性的唯一代谢途径用于杏仁代谢,随着添加10,000μg/ mL MSG而增加。像gaba一样的agmatine是细菌使用的替代氮源[GydF4y2Ba55GydF4y2Ba]和普雷氏菌素的前体,这是葡萄酒中最丰富的生物胺[GydF4y2Ba56GydF4y2Ba].此外,LBR-35表达的基因相关的应激反应,包括聚合促进因子(的APF),它已被证明是益生菌乳杆菌的一个理想的特性,以帮助病原体[竞争排斥GydF4y2Ba57GydF4y2Ba那GydF4y2Ba58GydF4y2Ba].此外,的APF的上调为生物膜形成,并有助于胃/小肠液存活和粘附到上皮细胞[重要GydF4y2Ba57GydF4y2Ba].这意味着,LBR-35激活到发酵应力的替代响应,专注于聚集和生物膜形成,而不是营养代谢和脱酸在LBR-6108。虽然GABA生产菌株,具体策略是众多研究中,低生产GABA的菌株也值得进一步研究的功能分析的主题。GydF4y2Ba

像Lbr-6108这样的微生物产生GABA的快速和增加可能对宿主微生物-肠道-大脑轴的健康有益。肠道微生物对正常大脑发育、功能、生理和行为的作用已经被确定,一些最令人信服的证据来自无菌啮齿动物模型和各种干预研究,包括饮食、益生元和益生菌[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba].实际上,生产的果树GydF4y2Ba双歧杆菌冠军GydF4y2BaATCC 27678在大鼠中降低了内感过敏症[GydF4y2Ba59GydF4y2Ba].如引言所提到的,一个精液的研究显示了GABA的生产GydF4y2BaLacticaseibacillus喂食GydF4y2BaJB-1通过调节Gabaergic系统的脑中应力诱导的生物标志物[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba].有趣的是,焦虑相关行为的影响停止后进行了迷走神经切断,这表明微生物产生的GABA对通过迷走神经介导的大脑有直接的影响。除了对压力有关的行为和脑功能的效果,微生物GABA产生还具有改善记忆和睡眠质量有关[GydF4y2Ba60GydF4y2Ba那GydF4y2Ba61GydF4y2Ba].沿着微生物-肠道-大脑轴的交流不仅是由微生物-GABA产生介导的,因为许多使用典型益生菌物种的研究表明,在不关注GABA的情况下,肠道-大脑轴相关的益处。例如,GydF4y2BaLacticaseibacillus副干酪GydF4y2Ba显示LPC-37在鼠标试验中改善不同的应力度量[GydF4y2Ba62GydF4y2Ba]及人体临床试验[GydF4y2Ba63GydF4y2Ba],而正常饮用含GABA的牛奶则来自GydF4y2BaLacticaseibacillus干酪乳杆菌GydF4y2Ba应变和冻干GydF4y2BaLactococcus lactisGydF4y2BaYIT 2027减少老年[高血压的危险GydF4y2Ba64GydF4y2Ba那GydF4y2Ba65GydF4y2Ba].筛选最佳效应器功能的新型益生菌可能会增加健康益处的可能性和影响。实际上,将LBR-6108针对高GABA输出的其他肠道细菌分离物筛选,并在体外和啮齿动物中显示出各种健康益处[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba].在基因组修饰尚未被广泛采用的应用中,自然产生大量效应分子(如GABA)的生物体被认为是安全的,是首选的补充解决方案。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

在本研究中,在生理相关实验室条件下的RNA测序被用来评估GABA生产的全球调节方面。这揭示了GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2Ba广泛性焦虑症操纵子的存在并不仅仅取决于GydF4y2Ba盖尔GydF4y2Ba作为在相同条件下具有类似GAD操纵序列的菌株不会在同一条件下产生GABA。因此,确认,高GABA生产,特别是在生长阶段的早期产生应变特异性。已经建立了来自LBR-6108的有效的GABA产量,有必要进一步研究来研究对脑功能和行为的微生物影响。此外,需要更强大的临床试验来确定与LBR-6108这样的产生GABA的细菌菌株的补充可以影响由加巴能信号传导如应力和焦虑介导的行为。LBR-6108等菌株的发展为精神毒虫,调节神经兴奋性抑制的平衡,情绪,认知功能,学习和记忆流程可能是对心理健康管理的互补补救措施。GydF4y2Ba

材料和方法GydF4y2Ba

细菌菌株和媒体GydF4y2Ba

冰冻甘油股票小瓶GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2BaLBR-6108(ATCC保险箱(SD)SD-7285)最初从人类肠道分离GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2BaATCC 14869最初从粪便中分离的,和商业的益生菌GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2BaLBR-35(ATCC SD-5214)获自Danisco的全球培养物保藏中心获得。这菌株were grown in De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) broth (Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA) at 37 °C ± 1 °C under anaerobic conditions (BBL Gas Pak and BD GasPak EZ container systems, Becton Dickinson, Cockeysville, MA, USA).

细菌培养和收获GydF4y2Ba

过夜文化(16-18小时)GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2BaLBR-6108,LBR-35和ATCC 14869接种在15毫升一次性培养管中(P / N 14-961-27; FISHER,HANOVER PARK,IL,USA)含有3毫升培养基来达到光学密度(OD)〜0.100使用分光光度计(Genesys 20; Thermo Fisher,Waltham,Ma,USA)以600nm测量。对于每个菌株,使用两种类型的培养基;肉汤(BD)没有任何其他补充(进一步表示为MRS)和补充10,000μg/ ml(相当于10克/升)的MRS肉汤GydF4y2BaL.GydF4y2Ba(+)-谷氨酸一水单钠盐(p/n 119940010;Acros Organics, Morris Plains, NJ, USA)(又称MRS + MSG)。将过夜培养菌接种到含3ml培养基的一次性培养管中后不久,测量时间点0 (T0)的OD值。除ATCC 14869外,其余均在初始时间点(T0)收获,接种后每3 h收获一次,直到24 h,然后在接种后48 h收获,在收获前测量OD值。ATCC 14869由于其生长速度较慢,分别在接种后9 h、24 h和48 h的不同时间点测定OD值后收获。每个收获时间点分别准备一组培养管,只将指定时间点的一组培养管从培养箱中取出进行收获,不影响培养生长。所有在MRS或MRS + MSG中生长的菌株的培养管使用厌氧GasPak EZ容器系统置于37℃±1℃厌氧条件下的培养箱中(p/n 260001, BD)。在相应的时间点将样品从培养箱中取出,在600 nm处测量od值。记录所有外径测量值,并使用GraphPad Prism v. 9.0.1 (La Jolla, CA, USA)绘制生长曲线。GydF4y2Ba

每个TimePoint样本集包括一个空白(细胞自由介质)和MRS和MRS + MSG中的重复的接种应变。在每个时间点,收获无细胞上清液以进行代谢物分析。将培养物(3mL)以1500×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba5分钟,将上清液通过GD / X25毫米针筒式滤器过滤(聚偏氟乙烯过滤介质,0.2微米,GE医疗集团生命科学,Cytiva,马尔堡,MA)和1mL的无细胞上清液等分到无菌低温小瓶中并在冷冻 - 80℃直至进行分析。pH值对每个样品组包括坯件在每个时间点收获测定(P / N:13-640-516,Fisher)上。GydF4y2Ba

根据制造商的协议,通过RNA保护(P / N:76526,QIAGEN,Hilden,德国)处理来自所有收获的STRBR-6108和LBR-35的细胞粒料。简而言之,向粒料中加入3ml RNA保护并通过涡旋重悬。将RNA保护重悬浮细胞粒料在室温下温育5分钟,然后以5000×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba10分钟。丢弃上清液,并在室温下冷冻细胞颗粒− 80摄氏度。在MRS和MRS中培养的Lbr-6108和Lbr-35培养物的冷冻细胞颗粒 + 通过RNA测序(美国新泽西州南普兰菲尔德GENEWIZ NJ实验室)分析生长时间点6小时(前对数期)、12小时(中对数期)、18小时(前固定期)和24小时(固定至后固定期)的MSG。接种后,更多时间点参考由T6–T24表示。GydF4y2Ba

在一个单独的实验中,如上述同样地,LBR-6108仅在含有0微克/毫升,万微克/毫升,30000微克/毫升,和90000μg/ mL的MSG,以确定谷氨酸浓度对GABA生产的影响MRS中生长。无细胞培养物上清液收获时间5小时(预对数期),24小时(固定相),48 h和对GABA和谷氨酸的定量72小时(后固定相)。GydF4y2Ba

为了测试LBR-6108和LBR-35的耐酸性,菌株在盐溶液和基底介质中生长。从LBR-6108和LBR-35的冷冻甘油股上的顶部刮的等分试样〜10μl转移到15ml锥形离心管(P / N 07-200-886; Thermo Fisher Scientific,Waltham,NJ,USA)含有在37℃下10mL MRS肉汤和生长过夜(18小时)。通过将0.1ml等分试位的过夜培养物转移到新鲜的MRS培养,在37℃下将过夜培养物转移到新鲜的半夜培养物中,通过将0.1ml等分试样转移到一夜之间进行一次再活过夜培养物。通过以5000rpm离心2分钟的离心颗粒,用Butterfield的磷酸盐缓冲液(P / N R23701; Thermo Fisher Scientific)用培养物进行沉淀一次,并重新悬浮在2毫升叶菲尔德的磷酸盐缓冲液中。使用盐水溶液使用具有5g / L氯化钠(P / N S640-3; Thermo Fisher Scientific)和10g / L蛋白胨(P / N 211681; Thermo Fisher Scientific)的基础培养基进行进行酸存活实验,2克/ L酵母提取物(P / N 288620; Thermo Fisher Scientific),5克/ L氯化钠,2g / L二氢铵(P / N JT0682-1; VWR,Radnor,PA,USA),0.2克/l硫酸镁(P / N MK607012; VWR,Radnor,PA,USA),2g / L硫磷酸氢磷酸盐(P / N P3786; Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo,USA)和20g / L葡萄糖(P / N G8270; Sigma-Aldrich)。用6N HCl调节两种溶液,将两种溶液调节至pH 3.0(P / N BDH7204-2; VWR)。在每个实验中,用25μL重悬的颗粒(〜log 10.6CFU)接种25ml盐水和基础培养基溶液的菌株。 Samples were mixed, and tenfold serial dilutions were immediately prepared for T0 plating in quadruplicate. Samples were held at 37 °C and additional tenfold dilutions were prepared at 2 h and 3 h timepoints. Samples were pour plated with MRS agar and incubated at 37 °C for 72 h. Subsequently, colonies were counted to assess survival under acidic conditions.

PCR确认物种和应变身份GydF4y2Ba

使用来自T0和/或T24和/或T48的收获时间点的细胞粒料,使用由16S rRNA基因设计的引物进行PCR,并测序以确认物种的身份(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图。S1)。菌株特异性的PCR用设计LBR-6108,LBR-35和ATCC 14869之间进行区分引物进行,以LBR-6108使用引物LBR-6108_Hyp_F(5'-GAACTTCATCAGTAGTGCGTTA-以产生130碱基对(bp)的扩增产物3')和LBR-6108_Hyp_R(5'-TGTTGGTCTTCGATATAGGTTAG-3'),而LBR-35和ATCC 14869,以产生267碱基对用相同引物组的PCR产物。另一个LBR-6108菌株鉴定引物组,EP_F(5'-ACGTCTGGTTATAGCTCATCA-3')和EP_R(5'-TAGTTTATCGACCGAGCCTT-3')被设计为从LBR-6108得到213 bp的扩增产物,并从339 bp的产物Lbr-35 and ATCC 14869. The PCRs were performed according to manufacturer’s specification of AmpliTaq Gold 360 polymerase (p/n 4398881, Thermo Fisher) and visualized using 2% ethidium bromide E-gels (p/n G501802, Thermo Fisher).

代谢物分析GydF4y2Ba

代谢组学的化学品和标准GydF4y2Ba

高效液相色谱(HPLC)乙腈和甲醇购自Thermo Fisher Scientific(Waltham,Ma,USA)。甲酸(> 98.0%),GABA(≥99.0%),γ-氨基丁酸-2,2,3,3,4,4-DGydF4y2Ba6.GydF4y2Ba(97.0%atom d),GydF4y2BaL.GydF4y2Ba- 乙酸(> 99.0%)和GydF4y2BaL.GydF4y2Ba谷氨酸acid-2、3、3、4、4 dGydF4y2Ba5.GydF4y2Ba(97.0%Atom D,98.0%)从Sigma-Aldrich获得。ACCQ标签Ultra Derivatization Kit购在Waters(Milford,Ma,USA)。从Millipore(伯灵顿,MA,USA)的Milli-Q水净化系统中纯化水。GydF4y2Ba

液相色谱-质谱分析GydF4y2Ba

通过称量并溶解GABA(1000µg/mL)和GABA制备储备溶液GydF4y2BaL.GydF4y2Ba- 乙醇(2000μg/ ml)水中。GABA和GABA的标准解决方案GydF4y2BaL.GydF4y2Ba-谷氨酸连续稀释,浓度范围分别为10-1000µg/mL和20-2000µg/mL。在水中制备同位素标记内标液(200 μg/mL)。每个标准等级200µL加入50µL内标液,800µL加入0.1%甲酸甲醇。标准溶液随后用6-氨基喹啉衍生化GydF4y2BaNGydF4y2Ba- 羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯(AQC),如下所述。GydF4y2Ba

加入100μL解冻的细胞无血液中,加入900μL水。将200μl稀释的样品用50μL内标溶液掺入,并用800μL0.1%甲酸沉淀在甲醇中。通过在-18℃下冷却1小时,蛋白质的沉淀增加。将样品在4700rpm下以4℃以4700rpm离心5分钟。随后将上清液随后是AQC-衍生化的,如下所述。样品一式两份制备。将20μL标准溶液或样品上清液与60μL的ACCQ标签超硼酸盐缓冲液和20μLACCQ标签试剂混合,用于AQC衍生化。将反应在55℃下运行10分钟[GydF4y2Ba66GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

GABA的LC-MS分析GydF4y2BaL.GydF4y2Ba- 谷氨酸在配备有脱气剂,二元泵,微孔板自动进样器,自动进样器的恒温器和恒温器柱隔间(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)的恒温器。HPLC与三重四极杆质谱仪在线耦合,其中来自Thermo Scientific TSQ Vantage的加热电喷雾界面。在ESI积极模式下,AQC-GABA和AQC-GABA-DGydF4y2Ba6.GydF4y2BaGenerated protonated ions, [M + H]+GydF4y2BamGydF4y2Ba/GydF4y2BaZ.GydF4y2Ba分别为274.1和280.1。aqc -谷氨酸和aqc -谷氨酸dGydF4y2Ba5.GydF4y2Ba产生质子化离子[m + h]GydF4y2Ba+GydF4y2BamGydF4y2Ba/GydF4y2BaZ.GydF4y2Ba分别为318.1和323.1。GydF4y2Ba

将化合物在亚特兰蒂斯上分离出来GydF4y2Ba®GydF4y2BaD.C18.3.µm 2.1 × 100 mm column (Waters). Mobile phase A was 0.1% formic acid in water and mobile phase B was 0.1% formic acid in acetonitrile. The linear separation gradient was 0–1 min (95.0% A), 5 min (85.0% A), 7 min (70.0% A), 8 min (5.0% A), 8–10 min (5.0% A), 10.1–15 min (95.0% A). The flow was kept at 0.4 mL/min. The autosampler was set at 5 °C and 1 µL of the sample/standard was injected for analysis. The column oven was set at 30 °C.

基因组和RNA测序GydF4y2Ba

基因组测序GydF4y2Ba

LBR-6108和ATCC 14869都具有公开可用的基因组,然而,如前所述测序并组装LBR-35的高质量草案基因组,如[GydF4y2Ba67GydF4y2Ba].简言之,基因组DNA,同时使用配对末端250核苷酸测序上在Illumina MiSeq(Illumina公司,圣地亚哥,CA,USA)并在GridION X5测序仪(牛津纳米孔技术,牛津,UK)在罗伊J.卡弗生物技术测序伊利诺伊中心,大学厄巴纳 - 香槟分校。质量控制,碱主叫和修整后,混合组件使用Unicycler汇编v 0.4.3执行的处理GydF4y2Ba68GydF4y2Ba].该基因组在PATRIC中使用RASTk注释[GydF4y2Ba69GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

比较基因组学GydF4y2Ba

利用PATRIC生物信息学资源中心进行菌株基因组比较[GydF4y2Ba70GydF4y2Ba].使用毒性(粗毒性的不同菌株的GAD基因对比对的基因组对准,GAD基因成对比对和不同菌株的GAD基因之间的序列同一性GydF4y2Ba®GydF4y2Ba2019.2.1, Biomatters,奥克兰,新西兰GydF4y2Ba)GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

RNA测序和分析GydF4y2Ba

从LBR-6018和LBR-35 RNA的总RNA从细胞沉淀中提取RNA中保护在GENEWIZ。随后,在Illumina HiSeq与配对末端150bp的技术(Illumina公司,圣地亚哥,CA,USA)进行测序之前生成的核糖体枯竭和cDNA文库。测序读数被检查用于使用FASTQC质量和映射到所述LBR-6108参考基因组,或LBR-35参考基因组使用鲑v.1.3.0 [GydF4y2Ba71.GydF4y2Ba],用GNU并联策划V.20161222 [GydF4y2Ba72.GydF4y2Ba].MultiQC被用来总结读取质量和映射质量的质量度量,以及读取映射到的位数为1230万(最小8.1,最大15.8)。,使用R v.3.6.3(维也纳,奥地利)中生成的图和分析。差异表达基因组使用ComplexHeatmap V2.2.0 [可视化GydF4y2Ba73.GydF4y2Ba]以及使用pheatmap v1.0.12可视化的其他数据[GydF4y2Ba74.GydF4y2Ba]和GGPLOT2 V3.3.2 [GydF4y2Ba75.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

使用两因素方差分析与棱镜Tukey多重比较检验生长比较分析在适当的时候。价值观被认为是显著的p值等于或小于0.05。使用DESeq2 v1.26.0 [确定差异表达的基因GydF4y2Ba76.GydF4y2Ba]如果它们具有等于或小于0.05的调整后的p值,则称为显着表达的基因,并且它们的绝对值log2折叠变化为±1.5或更高。GydF4y2Ba

可用性数据和材料GydF4y2Ba

LBR-6108 Genome先前公布,并具有国家生物技术信息中心(NCBI)登录号MDUA01。类似地,用于ATCC 14869的基因组具有NCBI加入号AWVK01。新型LBR-35基因组具有加入号JAHERW0000000。RNA测序数据在Bioproject登录号Prjna752280和Geo Incession Number GSE181504中提交给NCBI基因表达式Omnibus(Geo)数据库。GydF4y2Ba

缩写GydF4y2Ba

APF:GydF4y2Ba

聚合促进因子GydF4y2Ba

AQC:GydF4y2Ba

Aminoquinolyl -GydF4y2BaNGydF4y2Ba-hydroxysuccinimidyl氨基甲酸酯GydF4y2Ba

写明ATCC 14869:GydF4y2Ba

Levilactobacillus brevis.GydF4y2BaATCC 14869GydF4y2Ba

BP:GydF4y2Ba

碱基对GydF4y2Ba

中枢神经系统:GydF4y2Ba

中枢神经系统GydF4y2Ba

DEG:GydF4y2Ba

差异表达基因GydF4y2Ba

电子商务:GydF4y2Ba

酶类GydF4y2Ba

奴隶:GydF4y2Ba

肠神经系统GydF4y2Ba

加巴:GydF4y2Ba

γ-氨基丁酸GydF4y2Ba

Gad:GydF4y2Ba

谷氨酸脱羧酶GydF4y2Ba

谷氨酸:GydF4y2Ba

谷氨酸GydF4y2Ba

HPLC:GydF4y2Ba

高效液相色谱GydF4y2Ba

实验室:GydF4y2Ba

乳酸菌GydF4y2Ba

质:GydF4y2Ba

液相色谱 - 质谱GydF4y2Ba

LBR-6108:GydF4y2Ba

Levilactobacillus brevis.GydF4y2BaLBR-6108™GydF4y2Ba

Lbr-35:GydF4y2Ba

Levilactobacillus brevis.GydF4y2BaLbr-35™GydF4y2Ba

夫人:GydF4y2Ba

De Man-Rogosa-Sharpe肉汤GydF4y2Ba

味精:GydF4y2Ba

谷氨酸钠GydF4y2Ba

PLP:GydF4y2Ba

吡哆醛-5'-磷酸盐GydF4y2Ba

SD:GydF4y2Ba

保险箱GydF4y2Ba

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下载参考GydF4y2Ba

致谢GydF4y2Ba

作者感谢Charles Budinoff博士的技术指导和Bryan Zabel在RNA测序操作方面的帮助。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

这项工作完全由国际香料和香味公司资助。GydF4y2Ba

作者信息GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

作者GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

SB,ACO,EP和WM设计了这项研究。SB,MP和PMB进行了生长实验和分析。SG,DN和WM进行了基因组测序和RNA-SEQ分析。LL,HTK和HMJ进行了代谢物检测和分析。所有作者均致力于稿件写作和审查。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

通信GydF4y2BaWesley Morovic.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

伦理宣言GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

没有研究是对活人或动物进行的。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

本研究中没有获得个人信息。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

所有作者都是国际口味&香水,Inc。的员工,该公司制造和商业化益生菌培养物,包括GydF4y2BaL. Brevis.GydF4y2Balbr - 6108和Lbr-35。GydF4y2Ba

附加信息GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

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:GydF4y2Ba表S1。GydF4y2Ba谷氨酸和GABA的测量GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2BaLBR-6108,LBR-35和ATCC 14869。GydF4y2Ba表S2。GydF4y2Ba谷氨酸利用和GABA生产GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2BaLbr-6108在MRS中加入不同浓度的味精。GydF4y2Ba表S3。GydF4y2Ba图4中的基因列表。位点ID用于GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2BaLBR-6108基因组。GydF4y2Ba图S1。GydF4y2Ba物种和应变特异性PCR的培养纯度测试GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2Balbr - 6108和Lbr-35。GydF4y2Ba图S2。GydF4y2BaRNA测序的PCA图GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2Balbr - 6108和Lbr-35。GydF4y2Ba

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Banerjee,S.,Poore,M.,Gerdes,S。GydF4y2Baet al。GydF4y2Ba转录组学揭示了不同的代谢策略的耐酸和γ -氨基丁酸(GABA)的生产选择GydF4y2BaLevilactobacillus brevis.GydF4y2Ba菌株。GydF4y2BaMicroB细胞事实GydF4y2Ba20,GydF4y2Ba173(2021)。https://doi.org/10.1186/s12934-021-01658-4GydF4y2Ba

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  • γ-氨基丁酸GydF4y2Ba
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