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通过引入内源性甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因Intron 1中的异源基因的高效表达GydF4y2Ba灵芝GydF4y2Ba

摘要GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

灵芝GydF4y2Ba香菇是一种著名的药用蘑菇,作为一种有潜力的生产生物活性化合物的细胞工厂而受到广泛关注。然而,异种基因的高效表达仍然是一个主要的挑战GydF4y2Ba灵芝GydF4y2Ba,妨碍这种物种的代谢调节研究和分子育种。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

我们表明存在甘氨醛-3-磷酸脱氢酶基因(GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba)内含子1在5'末端,3'末端或在异源膦素抗性基因内(GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba)是有效用于其表达GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba.增强的表达GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba表现为mRNA的大量积累和蛋白质的增加。此外,插入的GydF4y2BaGPD.GydF4y2Baβ-葡萄糖醛酸酶基因的内含子1 (GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba)提高了其mRNA的积累和酶活性,这有利于该报告基因的应用GydF4y2Ba灵芝GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

本研究证明了引入的重要性GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba内含子1以获得有效的表达GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba和GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba在GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba.存在GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba内含子1增加担子菌中mRNA的积累和蛋白的表达GydF4y2Ba灵芝GydF4y2Ba.该方法可用于提高其它异种基因的表达GydF4y2Ba灵芝GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

灵芝GydF4y2Ba灵芝酸、灵芝醇、多糖、免疫调节蛋白、核苷酸、甾醇等多种生物活性产物[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba].近年来,它作为一种有前景的生产这些有价值化合物的细胞工厂受到了广泛的关注[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba].基因组,转录组和蛋白质组GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba已被测序[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba].GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba已被建议作为研究基础霉素生物学和次生代谢物生物合成的模型物种[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

分子遗传学方法的工具,如遗传转化,破坏和靶基因的缺失,已经开发了GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba].然而,外源基因的高效表达仍然是该领域面临的主要挑战GydF4y2Ba灵芝GydF4y2Ba虽然这将是对代谢调控及分子育种价值。在担子菌的异源基因的成功表达可取决于几个因素,包括一种有效的启动子,密码子优化,和内含子的存在[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba].在这些元件,内含子对异源基因的表达的显著效果。在一些蘑菇品种如GydF4y2BaClitopilus passeckerianusGydF4y2Ba那GydF4y2Ba灰盖鬼伞GydF4y2Ba, 和GydF4y2Ba裂褶菌GydF4y2Ba,需要添加内含子才能有效表达绿色荧光蛋白基因(GydF4y2Ba绿色荧光蛋白GydF4y2Ba)、抗湿霉素基因和抗间霉素基因[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

Intron-containingGydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba基因占其43.3 mb基因组中预测基因的85.4%(约16,113)[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba,表明内含子的重要性GydF4y2Ba灵芝GydF4y2Ba.在之前的研究中,我们发现了一个额外的碎片,包括GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba外显子1,内含子1和3-bp的外显子2在5 '末端GydF4y2Ba绿色荧光蛋白GydF4y2Ba和抗磷菊酯基因(GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba),对于他们在GydF4y2Bag . lucudiumGydF4y2Ba[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba].但是,角色GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba内含子1在调控外源基因表达中的作用目前尚未深入研究GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba.此外,如何GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba内含子1在外源基因表达时影响基因转录、蛋白表达和酶活性GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba仍不清楚。GydF4y2Ba

在这项研究中,我们表明存在GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba在不同位置处内含子1是有效增强的异源表达GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba在GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba.外源基因的高效表达是由于mRNA的积累和蛋白质含量的增加。此外,插入GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba内含子1GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba增强其mRNA和酶活性,这有助于使用本报告基因GydF4y2Ba灵芝GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

结果和讨论GydF4y2Ba

内源性GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba内含子1增加了异种的表达GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba在GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba

我们以前的一项研究表明插入了GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba在的5'端含有第一外显子(6碱基对),第一个内含子(67个碱基),和第二外显子(3个碱基)的一部分片段GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba和GydF4y2Ba绿色荧光蛋白GydF4y2Ba对蛋白质表达产生重大影响。探讨内源性的效果GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba蛋白中内含子1的表达GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba,我们构建了质粒,其中异源密码子优化的抗性基因(GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba) -GydF4y2Ba国旗GydF4y2Ba受到内源的调节GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba启动子和琥珀酸脱氢酶基因(GydF4y2BaSDH.GydF4y2Ba)《终结者》GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba(PJW-EXP-opbar标志)(图GydF4y2Ba1GydF4y2Ba).或者,GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba国旗GydF4y2Ba被克隆到包含的类似质粒中GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba内含子1直接位于起始密码子上游(pJW-EXP-in-opbar-flag),翻译起始位点下游6bpGydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba(pJW-EXP-in (M)-opbar-flag),以及终止密码子的直接下游(pJW-EXP-opbar-flag-in)。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba).这些质粒还包含一个抗羧蛋白盒,允许在含有羧蛋白的CYM板上选择转化子。后GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba原生质体与内含子的含内含子和opbar标志质粒(PJW-EXP-opbar标志)转化,我们获得了与所有使用的质粒抗性萎锈菌落。然而,当这些萎锈性的转化体上CYM板包括phosphinothrin重新筛选,用质粒PJW-EXP-opbar标志没有获得抗性phosphinothrin菌落。用得到的phosphinotrhrin-抗性的转化含有内含子的质粒PJW-EXP-在-opbar标志,PJW-EXP-在(M)-opbar标志,和PJW-EXP-opbar标志式(图GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一个,附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图。S1A和S2A)。PCR分析表明GydF4y2Baopbar-flagGydF4y2Ba转化子pJW-EXP-opbar-flag、转化子pJW-EXP-in-opbar-flag、pJW-EXP-opbar-in (M)-flag和pJW-EXP-opbar-in的基因组已整合到转化子pJW-EXP-opbar-flag的基因组中。GydF4y2Ba2GydF4y2BaB,额外的文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图。S1B和S2B)。这些结果表明,引入内源性的GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba内含子1对外源基因的高效表达具有重要意义GydF4y2Ba酒吧GydF4y2Ba在GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba.此外,这种效果是独立于位置的GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba基因内区1。内含子对转基因表达的积极影响也在其他担子菌中被观察到,如GydF4y2BaAgaricus Bisporus.GydF4y2Ba那GydF4y2BaC.塔里斯GydF4y2Ba那GydF4y2BaPhanerochaete chrysosporiumGydF4y2Ba那GydF4y2BaS.公社GydF4y2Ba那GydF4y2BaC.乘客GydF4y2Ba和GydF4y2BaTrichoderma Viride.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24GydF4y2Ba].内含子增强基因表达可能在基因中通常含有内含子的生物体中发挥作用[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

图1GydF4y2Ba
图1GydF4y2Ba

opbar-flag质粒的结构GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba转型。看 ”GydF4y2Ba方法GydF4y2Ba"有关质粒构建的详细资料GydF4y2Ba

图2GydF4y2Ba
图2.GydF4y2Ba

选择性Cym板上的磷脂菊素抗性转化体的选择。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba在选择性CYM板上的转换子。1,2,3: pJW-EXP-opbar-flag转化的菌株;4,5,6: pJW-EXP-in-opbar-flag转化的菌株。GydF4y2BaB.GydF4y2BaidentificatonGydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba通过PCR转化株。M巷,DNA标记DL5000;Lane P, pjw - exp -in-opbar标记为阳性对照;N道,负控制;巷1、2、3,变换器pJW-EXP-opbar-flag;4 5 6道,转化体pjw - exp -in-opbar标志GydF4y2Ba

增强与mRNA的水平增加有关GydF4y2Ba

将转化PJW-EXP-在-opbar标志选择与转化子PJW-EXP-opbar标志来研究如何GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba内含子1影响基因转录和蛋白质表达。通过分子杂交进一步检测转化子pJW-EXP-opbar-flag和pJW-EXP-in-opbar-flag基因组中是否存在opbar-flag。转化子pJW-EXP-opbar-flag和pJW-EXP-in-opbar-flag的基因组用NheI酶切和an探针探针GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba片段(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa,b)。Southern印迹分析核实这些转化体有插入GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba,在其基因组中单个或多个副本。在转化体PJW-EXP-OP-FLAG T1,T4和T5的基因组中检测到OPBAR-FLAG事件的单拷贝集成,以及PJW-EXP-OPBAR-FLAG T1,T3和T5。为了最大限度地减少拷贝数效应,转录水平GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba在转化体PJW-EXP-OPBAR-FLAG T1和T5中分析,PJW-EXP-INBAR-FLAG T1和T3携带单拷贝GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba实时荧光定量rt - pcr分析。结果表明,转化子pJW-EXP-in-opbar-flag T1和T3表达水平较高GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba内含子1在GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba和低水平的转化子pJW-EXP-opbar-flag T1, T5包含GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba没有GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba基因内区1。pJW-EXP-in-opbar-flag T1与T5之间转录无显著差异。的转录水平GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba在转化体中,PJW-Exp-in-Flag T1和T3分别比转化体PJW-Exp-In-Flag T1高12.3和10.1倍(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaC)。我们的结果表明GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba内含子1增加异源的转录水平GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba在GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba.以往的研究表明,内含子可能通过增强转录本的成熟和稳定性来提高mRNA的水平[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba].pJW-EXP-in-opbar-flag T1和T3转录水平的差异可能与整合位置效应有关[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

图3GydF4y2Ba
图3.GydF4y2Ba

副本检测GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba和转录水平GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba在不同的GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba转化株。GydF4y2Ba一种GydF4y2BapJW-EXP-opbar-flag转化株。GydF4y2BaB.GydF4y2BaPJW-Exp-in-Opbar-Flag转换体。GydF4y2BaCGydF4y2Ba的相对表达水平GydF4y2Baopbar.GydF4y2Baopbar-T1, opbar-T5, in-opbar-T1, in-opbar- t3。M巷,DNA标记1 kb阶梯GydF4y2Ba

影响GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba异源蛋白质产量上的内含子1GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba

从转化子pJW-EXP-opbar-flag T1和T5以及pJW-EXP-in-opbar-flag T1和T3中分离得到的蛋白通过western blotting进行分析(图2)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba).在转化体PJW-EXP-OP-FLAG T1和T3中可检测≈22kDa的蛋白质。但是,在转化体PJW-EXP-OPBAR标志T1和T5中未观察到它未观察到GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba没有GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba内含子1. 22kDa的带由标志特异性抗体识别的是Opbar-Flag蛋白,​​因为分子量类似于预测值。如图1所示。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba, opbar-flag蛋白的添加量也随着添加量的增加而增加GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba基因内区1。这些结果与qRT-PCR分析和膦菊酯抗性筛选结果一致。GGydF4y2BaPD.GydF4y2Ba内含子1增强了RNA和蛋白质水平的蛋白表达。Opbar蛋白水平与GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba无内含子的mRNA水平GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba转化株,表明GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba内含子1还可以通过影响mRNA的转录和稳定性增加MRNA含量来增强平移效率[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28GydF4y2Ba].在异源基因翻译中提高内含子的详细机制需要进一步调查。GydF4y2Ba

图4GydF4y2Ba
图4.GydF4y2Ba

通过SDS-PAGE分析转化子opbar-T1、opbar-T5、in-opbar-T1和in-opbar- t3中opbar标记量。M巷,蛋白质标记GydF4y2Ba

介绍GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba内含子增强了β葡糖醛酸酶(GUS)的表达GydF4y2Ba

证实…的积极作用GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba我们还构建了质粒pJW-EXP-opgus和pJW-EXP-in-opgus(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaA)并将其转化为GydF4y2Ba灵芝GydF4y2Ba原生质体。这些质粒含有用于转化选择的羧蛋白型盒和完整的密码子优化GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba(GydF4y2BaopgusGydF4y2Ba)盒式磁带(pJW-EXP-opgus)或GydF4y2Ba基因内区GydF4y2Ba-GydF4y2BaopgusGydF4y2Ba盒式磁带。通过基因组PCR筛选抗羧素菌落的转基因(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图。S3)随后通过Southern印迹进行进一步分析。结果表明GydF4y2BaopgusGydF4y2Ba和GydF4y2Ba介绍,opguGydF4y2BaS已在转化体PJW-EXP-OPGUS T1,T2,T3和T4中的单拷贝集成到接受者的基因组中,以及转化体PJW-Exp-In-OPGUS T1(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaB). Real-time qRT-PCR分析显示GydF4y2BaopgusGydF4y2BapJW-EXP-opgus T1转化子中pJW-EXP-opgus T1和T2转化子中pJW-EXP-opgus T1的表达量是未转化子pJW-EXP-opgus T1和T2的3.8倍GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba内含子1(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaA).转录水平相对于无内含子控制的增加范围为3.8倍GydF4y2BaopguGydF4y2BaS到12.3倍GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba,这可能与无内含子异种基因的cDNA序列和转录水平有关[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba].还进行组织化学染色分析,以检测表达GydF4y2BaopgusGydF4y2Ba突变体pJW-EXP-opgus T2和pJW-EXP-in-opgus T1。数字GydF4y2Ba6.GydF4y2BaB显示在转化体PJW-EXP-OPGUS T2和PJW-EXP-IN-OPGUS T1中观察到GUS活性,同时在WT菌丝体中检测到任何蓝染色。此外,转化体PJW-EXP-OPGUS T1中的GUS活性高于转化体PJW-EXP-OPGUS T2的GUS活性。再次,我们的结果表明GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba内含子1增强了GydF4y2BaopgusGydF4y2Ba转录和GUS酶活性GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba.因此可以有效地表达其他异源基因GydF4y2Ba灵芝GydF4y2Ba通过介绍这一点GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba基因内区1。GydF4y2Ba

图5GydF4y2Ba
图5.GydF4y2Ba

副本检测GydF4y2BaopgusGydF4y2Ba在不同的GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba转化株。GydF4y2Ba一种GydF4y2Baopgus质粒结构。GydF4y2BaB.GydF4y2BapJW-EXP-opgus转化子T1、T2、T3、T4和pJW-EXP-in-opgus转化子T1、T2的基因组southern blot分析。M巷,DNA标记DL 15000GydF4y2Ba

图6GydF4y2Ba
图6.GydF4y2Ba

的相对表达水平GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba(GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba)及组织化学染色(GydF4y2BaB.GydF4y2Ba)转化子opgus-T1、opgus-T2和in-opgus-T1GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

这项工作表明了介绍的重要性GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba内含子1以获得有效的表达GydF4y2BaopbaGydF4y2Bar和GydF4y2Ba格斯GydF4y2Ba在GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba.存在GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba在担子菌中,内含子1增强了mRNA的积累和蛋白的表达GydF4y2Ba灵芝GydF4y2Ba.该方法可应用于其它异种基因的上调表达GydF4y2Ba灵芝GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

方法GydF4y2Ba

菌株和媒体GydF4y2Ba

单核GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba5.616 - 1菌株(GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]在CYM平板(麦芽糖10 g/L,葡萄糖20 g/L,胰蛋白胨2 g/L,酵母提取物2 g/L, MgSO 0.5 g/L)中培养GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba,4.6克/升KHGydF4y2Ba2GydF4y2Ba宝GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba和10g / L琼脂),并在变换。GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba菌株DH5α用于质粒的构建和转化中。菌丝体GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba在35 g/L葡萄糖、1 g/L KHGydF4y2Ba2GydF4y2Ba宝GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba·HGydF4y2Ba2GydF4y2BaO,0.5g / L的硫酸镁GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba·7小时GydF4y2Ba2GydF4y2BaO, 5 g/L蛋白胨,2.5 g/L酵母提取物,0.05 g/L维生素B1, pH 5.5),在30°C黑暗条件下[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

质粒构建GydF4y2Ba

密码子优化的膦素抵抗基因(OPBAR)-FLAG,GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba基因内含子1(in)-opbar-flag,In(m)-opbar-flag,GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba-flag式,opgus,和在opgus(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)由上海生工株式会社合成。将这些基因连接到pUC57 (Sangon)中,分别生成pUC57-opbar-flag、pUC57-in-opbar-flag、pUC57-in (M)-opbar-flag、pUC57-opgus和pUC57-in-opgus质粒。GydF4y2Ba

OPBAR-FLAG,IN-OPBAR-FLAG,(M)-OPBAR-FLAL和OPBAR-FLAG-in基因的PCR由PURSMIDS PUC57-OPBAR-FLAG,PUC57-INBAR-FLAG,PUC57-IN扩增(m)-opbar-flag,和puc57-opbar-flag-in使用primers opbar-flag-f / opbar-r-r,in-opbar-flag f / Opbar-Flag-R,Opbar-Flag F2 / Opbar-Flag-r,和opbar-flag-f / opbar-flag r2(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)分别。将这些PCR产物融合成质粒pjw-exp [GydF4y2Ba13GydF4y2Ba],用NheI和SmaI酶切,分别获得质粒pJW-EXP-opbar-flag、pJW-EXP-in-opbar-flag、pJW-EXP-in(M)-opbar-flag和pJW-EXP-opbar-flag-in。GydF4y2Ba

的opgus和在opgus基因PCR使用opgus˚F引物的质粒的pUC57-opgus和的pUC57-在-opgus扩增/ opgus R和在-opgus F / opgus R(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)分别。将所得到的产物熔融成用NheⅠ和SmaⅠ使用ClonExpress MULTIS一步法克隆试剂盒(Vazyme,南京)以分别产生质粒PJW-EXP-opgus和PJW-EXP-在-opgus,消化的质粒PJW-EXP。GydF4y2Ba

遗传转化GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba和选择转化体GydF4y2Ba

的变换GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba原生质体是根据我们之前的研究进行的[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33GydF4y2Ba].暂停GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba原生质体和质粒在PTC缓冲液(50 mM CaClGydF4y2Ba2GydF4y2Ba, 10 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)和60% w/v PEG 4000)被镀到CYM选择板上,包含0.6 M甘露醇和2µg/L羧酸。在30°C孵育14天后,筛选耐羧蛋白转化子,检测耐磷thricin蛋白和GUS表达。转化株表达GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba用150mg / L膦酸的CYM板筛选。提取这些转化体的基因组以进行PCR扩增熔融片段GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba启动子和GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba使用引物gpd-id-F / opbar-id-R。转化株表达GydF4y2BaopgusGydF4y2Ba通过融合片段的PCR扩增被确定GydF4y2BaGPD.GydF4y2Ba启动子和GydF4y2BaopgusGydF4y2Ba使用引物GPD-ID-F / opgus-R。GydF4y2Ba

核酸分离GydF4y2Ba

灵芝GydF4y2Ba菌丝体收获,冷冻,并在液氮中粉末化。分离基因组DNA采用十六烷基三甲基铵(CTAB)方法。总RNA使用TRIzol试剂(Invitrogen,卡尔斯巴德,CA,USA)根据制造商的方案分离并在使用前用无RNA酶的DNA酶I处理。GydF4y2Ba

南部的屁股GydF4y2Ba

DNA样品来自GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba转化体用NheI消化,并在0.7%琼脂糖凝胶上分离。这GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba(0.54 kb)GydF4y2BaopgusGydF4y2Ba以引物bar probe F/bar probe F和gus probe F/gus probe R从pJW-EXP-opgus质粒pJW-EXP-opgus中扩增的片段(0.95 kb)作为探针。在Mylab™(中国北京)推荐的地高黄素(DIG)杂交系统条件下进行Southern blot分析。GydF4y2Ba

定量实时(QRT)-PCR分析GydF4y2Ba

使用大约1mg总RNA作为模板,按照制造商的说明使用PrimeScript™RT试剂试剂盒(Takara,中国)进行反转录。的转录水平GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba和GydF4y2BaopgusGydF4y2Ba采用qRT-PCR检测,如前所述[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba].18S-rRNA转录本作为内对照,使相对转录水平正常化。为GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba和GydF4y2BaopgusGydF4y2Ba,Opbar标志和OPGUS菌株的转录水平设定为1.0,并且其他菌株中的相对转录水平被呈现为相对于参考水平的倍数变化。引物QRT-BAR-F / QRT-BAR-R,QRT-GUS-F / QRT-GUS-R,QRT-18S-F / QRT-18S-R(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)用于扩增GydF4y2Baopbar.GydF4y2Ba那GydF4y2BaopgusGydF4y2Ba, 18S rRNA基因。GydF4y2Ba

免疫印迹分析GydF4y2Ba

灵芝GydF4y2Ba菌丝在1 mL的裂解缓冲液(25 mM Tris碱(pH 7.4)、200 mM甘氨酸、5 mM EDTA、1 mM苯甲基磺酰氟和1 mM 2-巯基乙醇)中洗涤并均质。匀浆在12000 ×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba在4℃下20分钟,然后使用Bradford方法测定上清液中的蛋白质浓度。对于西方螺栓分析,将30μg蛋白质在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离,并在TBST缓冲液中电转移到聚偏二氟乙烯膜中[10mM Tris / HCl(pH7.4),100mM NaCl,0.1%吐温20]为1小时。在室温下溶解在TBSF缓冲液中的非脂肪乳的膜封闭2小时,然后与初抗孵育(抗标志,Proteintech,猫No.20543-1-AP,在1:5000稀释;抗微管兔多克隆抗体,BBI,猫No.0015在1:5000稀释时)。用TBSF洗涤膜,并用HRP缀合的山羊抗兔IgG(BBI,猫No.0058为1:5000稀释)温育。再次用TBSF缓冲液洗涤印迹,并且使用增强的化学浓缩方法可视化带。GydF4y2Ba

Gus活动试验GydF4y2Ba

灵芝GydF4y2Ba菌丝体从CYM板刮取与GUS检测缓冲液[0.1M磷酸钠(pH 7.0)中,进行染色,0.5毫克/毫升X-GLUC,0.05毫米的KGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba(铁[CN]GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba), 0.05 mM KGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba(铁[CN]GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)和0.5% Triton X-100]在玻片上分别放置20和40分钟。用PB缓冲液(10 mM磷酸钠,pH 7.0)洗涤后,在尼康Coolpix 900相机下观察菌丝。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

Data were generated in three independent sample measurements, and all data are presented as the mean ± standard deviation. The results were considered significant forP.GydF4y2Ba在双尾分析中值< 0.05。GydF4y2Ba

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确认GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

本研究由国家自然科学基金项目(No. 81860668)和云南省应用基础研究计划项目(No. 2018FB065)资助。J.-W。他还感谢“云南省万人计划青年精英计划”。GydF4y2Ba

作者信息GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

作者GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

JWX设计了这项研究。HY,BS和NL进行了实验。JWX,HY和NL分析了数据。HY和JWX写了稿件。所有作者阅读并认可的终稿。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2BaJun-Wei徐GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

道德声明GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

附加信息GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

补充信息GydF4y2Ba

附加文件1。GydF4y2Ba

数据S1。合成基因序列。GydF4y2Ba无花果S1。GydF4y2Ba.在选择性CYM板上筛选抗磷菊酯转化子。(A)选择性CYM板上的变换器。1、2、3、4:pJW-EXP-in (M)-opbar-flag转化株。(b)识别GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba通过PCR转化株。GydF4y2Ba无花果S2。GydF4y2Ba.在选择性CYM板上筛选抗磷菊酯转化子。(A)选择性CYM板上的变换器。1,2,3,4:用PJW-EXP-OPBAR-FLAG-IN转化的菌株。(b)识别GydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba通过PCR转化株。GydF4y2BaS3无花果。GydF4y2Ba.identificatonGydF4y2Bag .清明的GydF4y2Ba用PCR转化具有质粒pJW-EXP-OPGUS(A)和PJW-EXP-IN-OPGUS(B)的转化体。GydF4y2Ba表S1GydF4y2Ba.本研究中使用的寡核苷酸。GydF4y2Ba

权利和权限GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证,这允许在任何中或格式中使用,共享,适应,分发和复制,只要您向原始作者和来源提供适当的信贷,提供了一个链接到Creative Commons许可证,并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明,否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中,除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中,法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用,您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本,请访问GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba.创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本文提供的数据,除非在数据的信贷额度中另有说明。GydF4y2Ba

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你,H.,孙,B.,李,N.GydF4y2Ba等等。GydF4y2Ba通过引入内源性甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因Intron 1中的异源基因的高效表达GydF4y2Ba灵芝GydF4y2Ba.GydF4y2BaMicroB细胞事实GydF4y2Ba20,GydF4y2Ba164(2021)。https://doi.org/10.1186/s12934-021-01654-8GydF4y2Ba

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关键词GydF4y2Ba

  • 灵芝GydF4y2Ba
  • 异源基因的表达GydF4y2Ba
  • 内含子GydF4y2Ba
  • mRNA积累GydF4y2Ba
  • 蛋白质表达GydF4y2Ba
  • 酶活性GydF4y2Ba