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三种谷氨酸脱羧酶的表征芽孢杆菌用于高效γ-氨基丁酸生产

抽象的

背景

γ-氨基丁酸(GABA)是一种重要的生物制品,用于医药和功能性食品,是可生物降解塑料聚酰胺的前体。4.谷氨酸脱羧酶(GAD)转化L- 谷物(L-Glu)通过脱羧转化为GABA。与其他方法相比,开发生物转化平台生产GABA具有相当大的工业应用价值。

结果

从三个中鉴定了三种GAD基因芽孢杆菌菌株和异种表达大肠杆菌BL21 (DE3)。三种酶的最佳反应温度和pH值分别为40℃和5.0。GADS,GADZ11对催化效率最高L-Glu(2.19毫米- 1s- 1).工程师大肠杆菌表达Gadz11的菌株用作全细胞生物催化剂,用于生产GABA。重复使用14次后,细胞产生的GABA,平均摩尔转化率为98.6%在14小时内。

结论

来自三个重组的GAD芽孢杆菌菌株已经进行了功能识别。工程师大肠杆菌表达Gadz1,Gadz11和Gadz20的菌株异源可以实现生物合成L-glu在高缓冲反应中到gabaL-GLU浓度。这部小说工程师大肠杆菌该菌株有可能成为工业生产GABA的经济高效的生物转化平台。

背景

作为四碳和水溶性的非蛋白质氨基酸,γ-氨基丁酸(GABA)在哺乳动物和植物中的抑制性神经递质起着重要作用[1]. 由于GABA具有许多生物活性,包括低血压、镇静、利尿、增强睡眠和记忆以及激素调节等作用,因此它已广泛应用于功能性食品和药物中[23.456].此外,GABA可以转化为聚酰胺4,也称为尼龙4,它是一种2-吡咯烷酮的线性聚合物,可以由GABA化学合成[7].尼龙4具有优异的物理性质,由于其耐热性(熔点,260°C)和生物降解性而感到环保[8].GABA还具有在化学工业中的有希望的应用,并努力保护环境[9].因此,随后开发一种高效的GABA生产的过程是其工业应用的关键焦点区域。

γ -氨基丁酸可以通过生物催化的α-脱羧产生L-Glu使用谷氨酸脱羧酶(GAD,EC4.1.15)(图。1)[10.].在细菌、放线菌、真菌和植物中发现了各种各样的GADs,它们在GABA的合成中发挥着核心作用,利用pyridoxal 5 ' -phosphate (PLP)作为辅助因子。一般来说,伽马氨基丁酸的生物合成是在实验室或商业上使用分离的酶或整个细胞进行的[11.].与纯化酶法相比,全细胞生物转化法具有效率高、制备简单、成本低等优点,这对大规模、高速、工业化的GABA生产工艺具有重要意义[12.].从微生物来源分离的gad,包括大肠杆菌巨大芽孢杆菌乳酸菌,以及米曲霉对工业生产有价值。产生GABA的能力因物种和菌株而异。如表所示1时,GABA产率为5.26 ~ 614.15 g/L。因此,探索具有高催化能力的GADs表达菌株对高效生产GABA具有重要意义。

图1
图1

GABA通过谷氨酸脱羧酶(GAD)用吡哆醛-5'-磷酸酯(PLP)作为辅助因子生产

表1不同微生物产生的GABA

芽孢杆菌由广泛分布在植物表面、土壤和空气中的革兰氏阳性细菌组成。它产生许多生物活性物质和各种酶,如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶[20.]. 因此,三个基因的基因组芽孢杆菌物种,芽孢杆菌sp。z1,芽孢杆菌sp。Z11,芽孢杆菌sp。Z20被测序并分析。每个菌株都包含一个推定的迦得基因,即,gadz1芽孢杆菌sp。z1,gadz11芽孢杆菌sp。Z11,gadz20芽孢杆菌Z20 sp。三个相关的迦得基因被克隆并表达大肠杆菌BL21 (DE3)。目的蛋白经Ni-NTA层析纯化后进行生化鉴定。另外,工程量也很大大肠杆菌评估表达GADZ1、GADZ11和GADZ20的BL21 (DE3)细胞产生GABA。总之,我们在这里提出了一种高效的工业生产伽马氨基丁酸的生物合成途径。

结果

基因克隆和推定的表达

这三个GAD基因,gadz1gadz11, 和gadz20,从相应的中分离出来芽孢杆菌菌株。的GAD片段的序列长度是在所有菌株1470 bp的,并且它编码的489个氨基酸长的多肽。基于序列分析,推导出三个GAD,属于AAT-I超家族,共用96-97%的序列标识。发现了几个保守的主题;Getytg(235-240)可能是主要催化位点或底物结合位点,HVDAASGG(266-273)基序在PLP依赖性脱羧酶中高度保守[21.22.].使用GADZ1,GADZ11和GADZ20的氨基酸序列作为查询序列,在NCBI数据库中鉴定了27种同源序列。如图1所示。2,系统发育分析表明GAD酶有三个分支。GADZ1、GADZ11和GADZ20位于同一演化枝,主要来源于芽孢杆菌marisflavi芽孢杆菌sp。349Y。通过使用SignalP-5.0服务器预测推定的信号肽,表明三个GAD是细胞内酶。计算的分子量为55.5kDa,用于Gadz1,55.4kDa用于Gadz11,Gadz20的55.6kDa。此外,MOTIF INVSGHKYGLVYPGLGWIIWR(295-315)是PLP结合结构域,其中ε-NH2Lys301通过亚胺连接与PLP辅助因子形成Schiff碱基。该步骤在PLP依赖性脱羧酶的催化中起关键作用[23.24.].

图2
图2.

利用MEGA方法建立了基于邻域连接的GADs系统发育树

重组GAD的表达与纯化

得到的质粒,包括PET28a-gadz1pET28a -gadz11和pet28a-gadz20,被成功表达大肠杆菌BL21 (DE3)。在16℃诱导16小时后检测到大量的GAD活性。使用超声波分离了三个His6标记的GAD。单个Ni-NTA亲和层析步骤用于将酶纯化至> 95%纯度,表观分子量为55kDa(图。3.一种)。HPLC分析显示,GADZ11在pH 5.0和40℃下具有最佳的催化性质。纯化重组的特定活性L-Glu酶对L-Glu为48.2 ± GADZ1为1.5 U/mg,98.9 ± GADZ11为6.5 U/mg,和13.5 U/mg ± GADZ20为0.2 U/mg(图。3.b)。

图3
图3.

一个纯化重组GAD的SDS-PAGE分析。M:蛋白梯;1:细胞内蛋白质大肠杆菌BL21 (DE3)/pET28a(+)(病媒生物控制);全细胞内蛋白及亲和纯化蛋白大肠杆菌BL21(DE3)/ GADZ1(车道2和3),大肠杆菌BL21(DE3)/ GADZ11(车道4和5),和大肠杆菌BL21(DE3)/ GADZ20(车道6和7)。b将纯化的GADZ1、GADZ11和GADZ20蛋白与L-Glu在pH 5.0时,用高效液相色谱分析反应混合物

三个GAD的功能识别

将三种纯化的GADs的性质与三种纯化的GADs的性质进行了比较L-Glu。三种酶的催化活性存在差异。然而,所有酶在pH 5.0和40℃时表现出最高的催化活性。在pH值为4.5-5.5范围内,活性保持在最大活性的60%,在温度为25-50℃范围内,活性保持在最大活性的50%以上。GADZ11表现出最佳的性能,GADZ1和GADZ20的活性分别只有GADZ11的一半和十分之一(图2)。4). 结果表明,GADZ11在生物转化中具有潜在的应用价值L-Glu。

图4
图4.

Gadz1,Gadz11和Gadz20的酶促性质。一个GAD的pH值;bGAD的温度最佳

三个GAD的动力学参数

三个GAD的动力学参数参考L-Glu,汇总于表中2.纯化的gadz11酶显示出一个K分别比纯化的Gadz1和Gadz20高〜2.1和8.4倍,表明GADZ11的高转换效率。然而,Gadz1和Gadz20表现出低KM与GADZ11相比,〜13和75%的值分别表明GADZ20的最高底物结合亲和力。基于这两个方面,Gadz11的催化效率(K/KM值)确定为2.19毫米- 1s- 1,是GADZ1和GADZ20的近2倍。结果表明,在相同的反应条件下,GADZ11具有比其他两种GADs更高的催化性能。

表2三个GAD的动力学参数

不同金属离子和EDTA对酶活性的影响

金属离子,如辅酶,可以改变生物体中不同酶的催化活性,并且通常用作辅助actor以促进或抑制酶促反应。通过施用1mm的Ni部分抑制GADZ11的活性2+和EDTA,并保留了超过60%的活动。这部分抑制了10毫米Ni的给药2+K+,CU2+,加利福尼亚州2+,mg.2+、铁3+, SDS, EDTA和β-巯基乙醇,超过40%的活性被保留(附加文件1:图S1)。但是,存在1 mm SDS,10 mm CA2+EDTA显著提高了GADZ20的酶活性60–80%。添加其他试剂对酶活性几乎没有影响。

全细胞生物转化用于GABA合成

这三个国家的GABA生产效率芽孢杆菌sp。菌株和大肠杆菌使用重组菌株使用L-glu作为基板(附加文件1:图S2)。大肠杆菌BL21(DE3)/GADZ11的GABA产量比BL21(DE3)高23倍芽孢杆菌sp。Z11。大肠杆菌BL21(DE3)/ GADZ1和大肠杆菌BL21(DE3)/GADZ20表现出十倍的高芽孢杆菌sp。Z1和Z20菌株分别。结果表明三个相关迦得基因取得过表达大肠杆菌

通常,GAD可以利用谷氨酸钠(MSG)和L-Glu作为底物[25.].调查工程化的应用价值大肠杆菌在GABA合成背景下表达GADs的菌株,通过GABA的全细胞生物合成L-GLU和MSG进行。如图1所示。5首先,在乙酸钠溶液和水中,L-GLU而不是MSG,被鉴定为生产GABA的更好的基质,而不管GAD窝水的存在大肠杆菌菌株。尽管如此,大肠杆菌BL21(DE3)/ GADZ11菌株是最好的生物催化剂;使用这种菌株的GABA产量L-Glu在乙酸钠缓冲液中为343±11 mM,在水中为920±33 mM。然而,同一菌株与味精在醋酸钠缓冲液中仅产生115±8 mM GABA。因此,在缓冲液中产生的GABA比在水中要低得多,即使当L-Glu作为底物。在乙酸钠缓冲液中,反应开始时pH值为4.6,反应1 h后pH值变为6.5。值得注意的是,当使用水时,味精反应混合物中没有检测到GABA的存在。这证明了反应混合物是碱性的,酸性环境是生物转化所必需的。因此,在水反应体系中进行了以下全细胞生物转化研究L-以谷氨酸为底物。

图5
图5.

生物转化大肠杆菌生产加巴。一个确定合适的底物(味精/L-GLU)和反应环境(缓冲液/水)进行转化。b转化率与不同浓度的L-Glu。选择的操作条件如下:反应温度37℃;反应时间:1 h;和PLP浓度,0.02 mM。数据显示为平均值±标准差(n = 3)

为了优化GABA生产,我们探讨了在反应混合物中初始浓度的初始浓度的影响。当浓度的浓度时,转换率为99-100%L-Glu在反应混合物中小于1 M(图。5b)。当L-GLU浓度高于1μm,转化率显着降低,尽管GABA的产率较高。我们认为GABA浓度越高,底物抑制越强。此外,高浓度的GABA会导致细胞内和细胞外环境之间的渗透压不平衡;得到的高细胞外渗透压可能对转换率产生负面影响[26.].因此,对于后续的全细胞生物转化研究,1 ML-glu被选择为基质。

细胞浓度和PLP浓度对转化率的影响

反应体系中不同细胞浓度的影响在37°C下进行2 h,以确保有足够的细胞浓度L-glu用于高细胞浓度,我们使用了6米L-Glu为加巴生产。当细胞浓度低于20个OD时600,转化率增加,从而提高细胞浓度。当细胞浓度高于20个OD时600,观察到最高的转化率,GABA产率为1.8μm(图。6一种)。因此,随后研究的细胞浓度设定为20个OD600

图6
图6.

最佳细胞(一个)及PLP (b)GABA生产的浓度大肠杆菌BL21(DE3)/GADZ11存在时L-Glu。黑线表示GABA的产率,红线表示转化率

PLP参与了质子移位的调节,而质子移位是催化蛋白质脱羧所必需的L-Glu,并评估不同浓度PLP对GABA生成的影响[27.].在没有添加PLP的情况下,GABA产率为580±18毫米,并且随着越来越多的PLP补充超过0.1mm PLP而不会改变(图。6b)。因此,使用1米L-GLU作为底物,测定要加入的最佳PLP浓度为0.1mm。

上限估计大肠杆菌BL21(DE3)/GADZ11制备GABAL-GLU.

接下来,我们测试了不同浓度的伽马氨基丁酸生产的时间分布L-glu(图。7一种)。大肠杆菌BL21(DE3)/ GADZ11可以转换为1米的94%L-Glu在1h内转化为GABA,在2m内转化为GABAL-Glu在2h内完全转化。在反应的第一个小时,观察到GABA产生的最高效率。在这第一个小时里,941 ± 25毫米(94.1%),1682毫米 ± 58毫米(84.1%),2226毫米 ± 221毫米(74.2%)和2371毫米 ± 269mm(59.3%)的GABA产生于1-4m之间L-glu分别。基于转换率,最佳添加率L-GLU被确定为批量反应的1米。

图7
图7.

转换的上界估计大肠杆菌BL21(DE3)/ GADZ11来自L-Glu。一个不同摩尔浓度单批反应中GABA生成的时间历程分析L-Glu。b重复使用大肠杆菌BL21 (DE3) / GADZ11。每批条件为:1 h, 1 ML-Glu, 0.1 mM PLP

确定细胞是否能够有效的回收率和重用在降低生产成本方面具有重要意义(图。7b)。在这项研究中,转换率L-Glu到GABA的转化率在第一个小时内为99 mol%,在随后的13个反应批次中几乎实现了完全转化。使用1 M,每个反应都可以达到这个速率L-glu和0.1 mm plp。最后,大肠杆菌BL21(DE3)/ GADZ11可用于14个批量转换,转换率为96-100%。14小时内,14米L-GLU被转化为13.8米GABA,平均摩尔转化率为98.6%。在14分批量转化后,转化率逐渐降至48.7%,直到执行17个批量转化。GABA的累积产率为15.9μm(等于1.64kg / L),总共17米L-Glu(等于2.5 kg/L)。因此,大肠杆菌BL21(DE3)/GADZ11具有良好的转化性能。

GABA的纯化和结晶

在之前的批量研究中,14mL-Glu完全转化超过14小时,在280毫升水系统中生产13.8米GABA。通过离心收集反应混合物并通过旋转蒸发浓缩。将合成的GABA在65℃下干燥至白色粉末。如此获得的GABA粉末非常纯度,如HPLC色谱图所示(图。8).样品与纯度的参考标准之间没有差异。

图8
图8.

采用高效液相色谱法对样品和对照品进行分析

讨论

近年来,加巴已成为制药和食品工业的生物活性组成部分。目前,全球GABA贸易收入约为7700万美元,预计2026年将达到9640万美元,复合年增长率为5.9%。在中国,加巴及其相关产品的总市场价值约为2.5-30亿元,预测稳定增长[28.29.].因此,开发一个可靠、稳定的廉价生产GABA的平台具有重要的经济意义。为了开发一种新的生物转化系统,我们从三个gad中鉴定了三个芽孢杆菌与其他菌株具有相似的最适pH值和最适温度。值得注意的是,纯化后的GADZ11的催化效率为2.19 mM- 1s- 1,高于以往有关广泛性焦虑症的报告3.).Gadz1,Gadz11和Gadz20之间的序列相似性为97.6-98.6%(附加文件1:图S3;24个残基不同)。然而,它们之间存在显著的活性差异(图。4).黄等人。[30.]证明了GAD基因中(Ser126, Ser127, Cys168, Ile211, Ser276, His278和Ser321)的残基短乳CGMCC 1306在将PLP辅因子锚定到活性位点,从而起到重要作用,从而支持其催化反应性。Tavakoli等人。[31.通过模拟对接研究发现,分别在Ile164、Asn302、Asp304、Tyr393、Ser396、Arg398和Thr410位点进行突变可以增加与底物的结合亲和力。GADZ11中对应的残基分别是Asp126、Cys127、Arg164、Ala168、His211、Ala276、Phe278、Tyr302、Leu304、Pro321、Asn393、Asp396、Pro398、Ser410,与上述两种酶完全不同。在未来的研究中,我们将通过结构结晶和位点诱变来揭示GADZ11高催化活性的机理。此外,大肠杆菌异源表达GADZ11的细胞可以使用高浓度直接产生GABAL-Glu在无缓冲反应中,转化率达95%以上。这些优良的转化特性更适合于GABA的工业化生产和后纯化。

表3本研究中GADs和其他微生物GADs的基本性质和动力学参数

迄今为止,大多数报道的GAD分别在30-50°C和4.0-5.0的温度和pH范围内更活跃,稳定,其活性在pH> 6时迅速下降[37.].在微生物中,GAD活动是对低酸环境抵抗的重要机制,这就是为什么大多数GAD仅在低pH下工作,包括我们研究中使用的GADZ11 [38.].反应缓冲液的低pH范围(pH 4-5)是GABA高效生产的一个关键限制[39.].GABA转换由大肠杆菌BL21(DE3)/ GADZ11在乙酸钠溶液中达到34.3%,水中为92.0%。使用MSG,醋酸钠缓冲液中的转化率为11.1%,近于水中近零。这些结果解释了为什么MSG不是GABA生产的最佳基材选择[4041.].在20ml水中含有1μmmsg的溶液的pH为pH 7.0,而含有相同浓度的溶液L-水中的谷氨酸是2.3。此外L-glu在水中易溶于msg。溶解度L-Glu在水中为15.1g / l,40°C,而MSG的含量为717克/升。因此,大部分L-Glu仍以固体形式存在于反应体系中。也就是说,混合物的渗透压L-Glu比味精混合物低得多,这一特征有利于GABA的生物合成。此外,当浓度L-Glu和MSG在反应系统中等于,L-谷氨酸在被消耗时可以保持酸性pH值[12.42.].因此,L-Glu是合成GABA的较好选择。

众所周知,GAD是一种典型的plp依赖酶[26.].PLP是一种用于各种酶的辅助因子,参与氨基化合物的代谢和生物分子的合成,如多巴胺,肾上腺素,去甲肾上腺素和组胺[43.].在我们的研究中,PLP似乎没有必要的GABA生物合成,并在583±23毫米的GABA的生产没有添加PLP到1米L-Glu sustrate。然而,很难确定PLP是否自然存在大肠杆菌.虽然我们的系统不是必需的,但是PLP的添加前面已经对GABA生产表现出大量的积极影响[36.].我们的结果与其他研究一致。转化率随PLP浓度的增加而增加,最高产量为985±15 mM(98.5%)。

我们的研究表明,4米的转换L-Glu需要2 h达到95 mol%,细胞浓度为20 OD600并且PLP浓度为0.4毫米。因此,考虑到时间,尽管是适当浓度的细胞和PLP,L-Glu可以在短时间内完全转化为GABA。此外,从反应混合物中简单的纯化和浓缩可以得到高纯度的GABA。综上所述,我们开发的平台有以下优点大肠杆菌本研究所构建的菌株可用于工业生产GABA,为从发酵液中分离纯化GABA提供了初步的数据。

结论

对3种重组GADs进行了功能鉴定芽孢杆菌菌株。其中,GADZ11的生物转化性能最好。一个工程大肠杆菌外源表达GADZ1、GADZ11和GADZ20的菌株能够完成生物合成L-glu到gaba在与高的缓冲反应中L-Glu基质浓度。工程师大肠杆菌BL21(DE3)/ GADZ11应变能够达到1米的完整转换L-glu在1小时。我们相信这部小说工程师大肠杆菌该菌株有可能成为工业生产GABA的经济高效的生物转化平台。

方法

菌株,培养基,质粒和化学品

他们三个芽孢杆菌从中国宁夏的沙漠沙粒样品中分离得到,并保存在中国农业栽培收藏库中,登记号为ACCC 61750,61747和61748。在30℃的Luria-Bertani培养基中培养。大肠杆菌XL10用于基因克隆。大肠杆菌分别以BL21和pET-28a质粒作为表达宿主和载体。DNA纯化试剂盒、LA Taq DNA聚合酶、限制性内切酶购自TaKaRa (Tsu, Japan)。T4 DNA连接酶购自New England Biolabs (Hitchin, UK)。所有的化学物质都是分析级的,并且在市场上可以买到。

克隆迦得基因芽孢杆菌菌株和质粒结构

基因组DNA来自芽孢杆菌使用巫师基因组DNA纯化试剂盒(Promega,Madison,Wi,USA)提取LB培养基中生长的菌株。Gad基因,gadz1gadz11, 和gadz20(genbank登录号MW703457、MW703456和MW703455)芽孢杆菌使用合适的底漆对菌株(GADF:5'-CTGAATTCATGTCCAAGGATCGAAAAGCAG-3'和GADR:5'-TTCGCCGCGCGAAGCGGCGCGCCTAATGATGAAACCCATT-3')。在凝胶电泳后,使用暗杆SV凝胶和PCR清理系统(PRomega)从1.0%琼脂糖凝胶纯化扩增的DNA片段。用纯化的1470bp gad片段消化EcoR我和I和连接(T4 DNA连接酶)进入PET-28a(+)以产生PET-28A-gadz1,宠物-28a-gadz11, pET-28agadz20.构建的质粒用于表达大肠杆菌BL21 (DE3)。

表达与酶纯化

大肠杆菌BL21(DE3)用质粒转化为PET-28A-gadz1,宠物-28a-gadz11, pET-28agadz20在37℃下在含有Kanamycin(50μg/ ml)的LB培养基中培养12小时。然后,将培养物在37℃(1重量%的孕育物体积)中转移至400ml LB肉汤。当达到合适的细菌浓度时(OD6000.6-0.8),通过加入1mM异丙基β-诱导蛋白质表达 -D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG),振荡200 rpm(16°C, 16 h)×G.10分钟并重新悬浮在裂解缓冲液中(20mM Tris-HCl缓冲液,500mM NaCl,pH 7.6)。然后,细胞被超声波破坏。离心后,使用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl缓冲液,500mM NaCl,200mM咪唑,pH7.6)通过Ni-NTA亲和层析分离蛋白质,然后通过SDS-溶解上清液和沉淀中的蛋白质 -页 [44.]. 使用Bradford分析法测定最终蛋白质浓度(BSA用作标准)[45.].

酶活性和GABA形成的测定

通过使用HPLC分析测量GABA生产速率来确定酶活性,有一些修改[46.47.].反应混合物包含400μlna2HPO4酸缓冲液(80mm,pH6.0),500μlL-GLU(50mM),50μLPLP(0.02mm)和50μL纯化的酶。在等体积(1mL)中加入冰冷的80%乙醇,在40℃下30分钟后停止反应。将反应上清液(500μL)与100μl的NaHCO混合3.(2.5克/升)和200μl4-NN- 二甲基氨基氮苯氮苯-4'-磺酰氯(DABS-CL)(0.25g / L溶解在乙腈中),并在70℃下温育20分钟。随后使用Shimadzu 20 A系列仪器(Shimadzu,京都,日本)和Agilent Zorbax SB-C18柱(5μm,4.6×150 mm)(Agilent,Santa Clara,CA)的分析。流动相是35%(v / v)乙腈溶液的溶液和65%50mM乙酸钠。流速和柱温分别为1ml / min和30°C;注射体积为10μL;并且检测波长为436nm。通过考虑用标准观察到的峰面积来计算测试解决方案中的GABA含量。一种酶活性单元被定义为1分钟内释放1mM的酶所需的酶量。每组设置三个平行孔。

最适pH和温度测定

在3.0 ~ 7.0的pH值范围内测定了GADs的最适pH值。ph -活性曲线在37°C下检测30分钟。最适温度为pH 5.0,温度范围为25-55°C。每个实验有三个重复。

酶动力学分析

在钠中进行酶动力学测定2HPO4-柠檬酸缓冲液含5 - 150mmL-Glu在40°C下保存15分钟L-Glu和Na2HPO4-柠檬酸缓冲液为5.0。每个实验有三个重复。的KMV马克斯使用GraphPad Prism 5软件非线性地拟合值。

金属离子和化学试剂对酶活性的影响

研究了不同金属离子(Na+, 你2+K+,CU2+,CO.2+,加利福尼亚州2+,mg.2+和fe.3+)将化学试剂(SDS、EDTA和β-巯基乙醇)分别添加到反应系统中,其最终浓度分别保持在1 mM和10 mM。然后,在标准条件下测定残余酶活性。使用不含任何添加剂的系统作为对照。

全细胞生物转化过程

重组大肠杆菌在37°C培养含有GADZ1、GADZ11和GADZ20的细胞。然后,在16℃诱导工程菌表达蛋白16 h,然后在8000℃离心×G.10分钟,洗涤,并重新悬浮在含有味精的水中或L-glu在适当的浓度下。OD600测量表示细胞浓度。将20mL混合物在100ml烧瓶中的反应在37℃下以120rpm进行。分析了由于反应结果的GABA生产,并通过HPLC评价速率。

为了优化反应条件,在本研究中,同时分批对单批反应的底物特异性,底物,细胞浓度,PLP浓度,时间过程分析以及分批反应的再循环比的影响。

底物特异性和最佳底物浓度

研究了全细胞生物合成的底物特异性,在含有以下底物的测定系统中研究了:MSG或L-Glu。以0.1 M乙酸钠缓冲液(pH 4.6)或水为部分条件,通过单因素和正交实验进行全细胞生物转化反应。反应条件为:反应时间为1 h;OD600, 20;和L-谷氨酸或味精浓度,1 M。

确定的影响L-Glu对GABA产生的影响如下:预培养16 h后,大肠杆菌将BL21(DE3)/GADZ11细胞离心悬浮于水中。因此,反应系统由20 mL水组成,其中含有100 mL Erlenmeyer烧瓶中的重悬细胞。对于这个,不同数量的L加入-GLU(0.5,1,2,3和4M)。反应混合物含有0.02mm PLP。通过在1小时后加入30ml乙醇来终止反应,并将体积与水一起制备100ml。收集反应上清液以测量GABA含量。

最佳细胞和PLP浓度

为了确定转化所需的最佳细胞浓度,进行以下步骤:在20 mL反应体系中加入6 ML-Glu, 0.02 mM PLP,和预定数量的细胞(OD6002,5,10,15,20,30)。该反应混合物以规定的摇床速度(120 rpm)在37℃下孵育2小时。2小时后,将等量(500µL)的aliquot(500µL)加入等量的80%冰激乙醇中停止反应。收集反应上清液,用高效液相色谱法测定GABA的含量。

为了确定辅酶PLP对反应的影响,在20 mL混合物中加入0(对照)、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5和1 mM PLP。的L-GLU和细胞浓度为1米和20个OD600,分别。37℃培养2 h后,取500µL的反应混合物,用高效液相色谱法测定。

上限估计大肠杆菌BL21(DE3)/ GADZ11转换GABAL-GLU.

为了确定最佳的反应条件,从而降低生产成本,采用不同浓度的L-GLU进行时间过程测定。PLP以0.4mm的最终浓度和细胞的最终浓度为20个OD600加到反应体系中,而L-Glu浓度分别为1、2、3和4 mL-GLU完全消耗),加入水以使体积增加到100毫升。对反应混合物进行HPLC。

的浓度L-GLU和PLP分别为1米和0.1mm,细胞浓度为20个OD600在间歇反应中。反应在37°C下进行1小时,并通过离心收集细胞,以备下一批固体培养时使用L-Glu被完全消耗。总共有17批。当反应完成时对样品进行测试。

转化的浓度高L-Glu和GABA的纯化和结晶

为了制备GABA晶体,通过旋转蒸发分离出前八个批次的混合物并浓缩。从浓溶液中收集GABA晶体。将晶体在65℃下烘箱干燥直至它们转化为白色粉末[48.].粉末的纯度通过HPLC测定。

数据和材料的可用性

本研究期间产生或分析的所有数据均包含在本文及其附加文件中。

缩写

L-Glu:

L谷氨酸

msg:

谷氨酸钠

加巴:

伽马 - 氨基丁酸

SDS-PAGE:

十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳

迦得:

谷氨酸脱羧酶

KM

米歇利斯常数

V马克斯

最大反应率

K

转化率

PLP:

5 '磷酸吡哆醛

dabs-cl:

4-NN-二甲氨基偶氮苯-4′-磺酰氯

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下载参考

资金

本研究由中国国家重点研发计划(2021yFC2102400),动物营养项目(2004DA125184G2101)和MOF和MARA(CARS-41)的中国农业研究系统提供资金。

作者信息

隶属关系

贡献

LS和TT有助于概念化。TT促成了方法,调查和资助收购。YB,XS和JZ进行了正式分析。XZ和CZ促成了资源。YB和YW分析并解释了数据。LS策划了数据并写了稿件。YW和TT批判性地审查并编辑了稿件。HL和通过提供项目管理。所有作者阅读并认可的终稿。

相应的作者

对应于袁王或者道你

伦理宣言

伦理批准和同意参与

这篇文章不包含任何研究与人类参与者或动物执行的任何作者。

同意出版

所有作者都已读取并批准这份稿件发布。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

附加信息

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

补充资料

附加文件1:

图1。金属离子和化学试剂(1mm和10mm)对酶活性的影响图2。GABA生产效率的比较三芽孢杆菌sp。菌株和大肠杆菌重组菌株。图3。GADZ1,GADZ11和GADZ20的多序列对准。

权利和权限

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引用这篇文章

Sun,L.,Bai,Y.,张,X.三种谷氨酸脱羧酶的表征芽孢杆菌用于高效γ-氨基丁酸生产。MicroB细胞事实20,153(2021)。https://doi.org/10.1186/s12934-021-01646-8

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关键词

  • γ氨基丁酸酸
  • 生物转化
  • 谷氨酸脱羧酶
  • 生物催化剂