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巴纳酶在大肠杆菌中的重组表达GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba及其在质粒纯化中的应用GydF4y2Ba

抽象的GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

使用牛原产核糖核酸酶是质粒DNA纯化的标准方案的一部分。由于基因疗法的领域现在进入临床阶段,需要逐步淘汰这种酶,或者需要开发替代净化方案,以确保产品安全和监管依从性。细菌RNase的重组表达充满了毒性问题,使其成为表达挑战性的酶。目前的研究描述了一种质粒构建体,其允许晶粒酶的表达GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba下其天然抑制剂芽孢杆菌RNA酶的共表达。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

将不含巴司达抑制剂的纯酶通过周质出口到细胞外间隙,从无细胞上清中纯化。采用阳离子交换色谱法作为主要的纯化步骤。接下来是疏水相互作用色谱,这导致了一个浓缩的活性酶的部分。虽然目前达到的容积活性水平相当低(4 Kunitz单位毫升GydF4y2Ba- 1GydF4y2Ba)原则上,可以证明其对质粒DNA纯化的施用。目前,这能够处理质粒生产的少量(13克)的细菌生物量。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

关于重组核糖核酸酶和套如果比生产率增加最佳的主机和/或重新设计的质粒更高规模生产的框架下游纯化策略的当前工作论点集中。同样重要的是通过阳离子交换层析纯化过程来削减庞大的酶的损失。甚至重组核糖核酸酶的相对少量的应用将有助于大大减少在碱性裂解物从而增加进一步的下游的质粒的纯化步骤的初始RNA水平。GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

Barnase (EC No. 3.1.27)由GydF4y2Ba芽孢杆菌淀粉醇溶血素GydF4y2Ba,是110个氨基酸的小单链RNase,其分子量为12.3kDa。它不含二硫键,二价阳离子作为辅因子或其他非肽部分[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].晶酶催化单链RNA的裂解,通过GPN位点的水解水解,GPG和GPA位点的速率较高。在7.5至9.3的pH范围内报道该活性,最大值为8.5 [GydF4y2Ba118博金宝网址 ].这导致表达的重组蛋白在细胞质中其活性构象的想法一样好在宿主细胞的周质空间,如GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].这种酶的简单结构也允许它在多种细胞类型中积极表达[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].然而,该基因在细胞质中的表达是有毒的宿主细胞当相应的抑制剂不是共表达。这强调成功重组表达的细胞内相应抑制剂的意义以及[GydF4y2Ba118博金宝网址 那GydF4y2Ba118博金宝网址 ].GydF4y2Ba

在GydF4y2Bab . amyloliquefaciensGydF4y2Ba,产生一种称为barstar的胞内barnase抑制剂,它与barnase紧密结合,导致抑制作用,从而保护宿主细胞免受RNase的毒性作用[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].芽孢杆菌RNA酶(89个残基),小10kDa的胞浆蛋白,是第一个发现的抑制蛋白特异于脒基特异性RNA酶如芽孢杆菌RNA酶和binase I.它结合到活性位点并中和任何RNA酶即残留在细胞质中,并由此可避免出现危险到宿主细胞的RNA。由于其在细胞失活芽孢杆菌RNA酶的重要性,芽孢杆菌RNA酶是细胞质GydF4y2Ba芽孢杆菌GydF4y2Basp。主持人。BARSTAR不芽孢杆菌RNA酶的表达起到任何作用[GydF4y2Ba118博金宝网址 ]. 因为barstar的基因不存在于GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba,对应的全长RNA酶的克隆是可能的,只有当该抑制剂的基因被预先或同时[克隆GydF4y2Ba118博金宝网址 ].已经描述了抑制机制,其由于谷蛋酯和Barstar之间的离子相互作用而是强的非共价复合物。描述抑制剂静电优化以密切绑定[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].GydF4y2Ba

最初,为芽孢杆菌RNA酶的重组表达的动机是,允许结构 - 功能研究其优异的特性。为了克服从tac启动子的渗漏表达,与用于周质靶向一个的PhoA信号序列沿着芽孢杆菌RNA酶基因的λP的控制下,克隆GydF4y2BaR.GydF4y2Ba启动子和通过C诱导基于温度的调节GydF4y2Ba一世GydF4y2Ba抑制因子(GydF4y2Ba118博金宝网址 ].在晚年,重组RNase的大规模生产背后的动机是其在质粒DNA纯化中的应用。对于用于基因治疗和DNA疫苗的质粒的生产,RNases的应用对于初始纯化阶段中的宿主细胞RNA浓度的降低是重要的。这里,可以避免使用天然牛RNases,并且使用微生物重组替代方案,从而对牛海绵状脑病(BSE)的污染风险抵消,因此符合质量标准[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].GydF4y2Ba

据报道,牛RNase A的重组表达GydF4y2Ba大肠杆菌,酿酒酵母GydF4y2Ba[GydF4y2Ba118博金宝网址 那GydF4y2Ba118博金宝网址 ]和在GydF4y2BaPichia Pastoris.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].晶酶和RNase A都是重组表达的良好候选者。通过细菌基因编码晶酶,而通过真核基因进行rnase a。因此,对于后者,CDNA需要是密码子优化以进行重组表达GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba.此外,RNase A需要形成四个二硫化物桥。这可能不是一个严重的限制,因此不需要被视为一种劣势。由于环境的减少GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba细胞质,表达策略将不得不考虑周质表达或细胞质中的包涵体。包涵体需要重新折叠程序来获得活性酶,但另一方面,极大地帮助了目标蛋白的初始纯化。GydF4y2Ba

这两种蛋白质在它们的一级结构和分子量相似的类似长度。它们的等电点是非常相似的(上面9)和适合于通过阳离子交换层析进行纯化。一个重要的区别是在作用机制。芽孢杆菌RNA酶切割在GPN的网站,而从嘧啶债券3’ 核糖核酸酶A切割。从理论上讲,有针对核糖核酸酶A的行动更多的网站,但它并没有被调查,如果这导致酶的效率更高。GydF4y2Ba

用的pelB信号序列沿着芽孢杆菌RNA酶基因在质粒构建体中的T7启动子下克隆,其中所述芽孢杆菌RNA酶基因已被克隆和其天然启动子下表达的先前[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].芽孢杆菌RNA酶已经由它融合到周质麦芽糖结合蛋白(MBP)从而实现分泌,并进一步输送通过细菌素释放蛋白质(BRP)的共表达到细胞外空间中表示作为模型蛋白GydF4y2Ba118博金宝网址 ]. 当MBP作为融合伙伴表达时,Sec和Tat分泌途径都是可能的,前者更有效。本研究中MBP的使用进一步促进了亲和层析在排泄蛋白下游纯化中的应用[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].GydF4y2Ba

由于蛋白质在细胞质中的活性构象中毒性毒性,因此使用强启动子的表达导致形成物体的形成可能实际上是一个优势,因为包涵体大多含有大量纯蛋白质,并且会阻止毒性效应酶。然而,这需要优化用于衍生活性蛋白的重折叠程序[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].GydF4y2Ba

本工作从PGydF4y2Ba坏GydF4y2Ba阿拉伯糖操纵子的启动子。PhoA启动前导序列通过Sec途径涉及酶(RNA酶称为PF这里)到周质。全面的下游纯化策略通过减少无细胞上清液数倍的体积开发的分离物的RNA酶活性含有的级分。最后,示出了质粒生产的部分纯化的重组芽孢杆菌RNA酶的应用实验被示出。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

Barnase表达式构造GydF4y2Ba

该构建PF1680(示于附加文件地图GydF4y2Ba118博金宝网址 )中含有酶表达基因,在PGydF4y2Ba坏GydF4y2Ba启动子。基于阿拉伯糖操纵子,启动子和它的调控子GydF4y2BaaraCGydF4y2Ba提供紧张和高效的监管[GydF4y2Ba118博金宝网址 ]. 抑制剂barstar在其天然启动子的控制下存在于下游。BRP的表达式由GydF4y2Ba基尔GydF4y2Ba由固定相启动子控制的基因增加了外膜在发酵后期的渗透性[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].这导致了包括重组酶在内的周质蛋白的辅助泄漏到细胞外培养基中。GydF4y2Ba

批量发酵GydF4y2Ba

初始摇瓶实验和小体积分批发酵显示酶活性在细胞外介质中的积累。从20L体积的缩放批量发酵,分析了来自各个时间点的无细胞上清液的样品。在培养时间为5小时诱导晶片基因后,细胞外介质似乎积累了能够在琼脂糖凝胶测定中降解酵母RNA的酶活性。在固定阶段,看到某些量的DNA被释放(有关详细信息,请参阅附加文件GydF4y2Ba118博金宝网址 ).GydF4y2Ba

硫酸铵沉淀GydF4y2Ba

在4℃下与上清液过夜储存的硫酸铵在65%饱和下储存在促使蛋白质中有效。离心后,将蛋白质重新悬浮在0.01M乙酸钠缓冲液(pH5.1)中以使发酵液的体积减半。该制剂显示出11.7ms cm的电导率GydF4y2Ba- 1GydF4y2Ba. 离心后,在上清液中观察到活性酶的损失(数据未显示)。此外,产生的蛋白质组分中残留盐含量较高,因此在进行色谱纯化步骤之前,需要通过超滤或透析进行脱盐。GydF4y2Ba

阳离子交换层析GydF4y2Ba

SP琼脂糖的20毫升床Fast Flow的包装在XK26柱成功地纯化含有级分的RNase活性。在initial experiments, from among the fractions collected during a concentration gradient of buffer B, the region of 10-15 % gave a UV-peak with the best activity (data not shown). The retentate from a Tangential Flow Filtration using an Omega membrane was taken to the next downstream processing step. A fraction of the RNase enzyme activity was seen to be lost in the permeate. In the cation exchange chromatography, the purification was changed to a step-wise elution shown in Fig.118博金宝网址 其中活性峰用20% Buffer B第一步洗脱(嵌体中观察到的E2和E3组分)。在50%步骤中,其他蛋白被洗脱,在E5中也检测到少量的目标酶。GydF4y2Ba

图。1GydF4y2Ba
图1GydF4y2Ba

从SP Sepharose FastFlow阳离子交换色谱从切向流动过滤保留馏分。镶嵌:各组分rna酶活性测定。S: RNA底物,N:阴性对照,P: TFF渗透,FT: flow - through馏分,E1-E5:洗脱馏分,CIP:阳离子交换色谱原位净化馏分GydF4y2Ba

靶酶的结合和洗脱特征可以与SP琼脂糖FF阳离子交换介质和20%,50%,100%逐步洗脱曲线(图再现。GydF4y2Ba118博金宝网址 ).它被发现是有益的稀释将超滤滞留物以1:3的比例用平衡缓冲液处理的粘度问题,以及转移样品pH值更接近平衡缓冲液。平衡缓冲液是从0.1 M在顺序变更为0.01M的醋酸钠缓冲液(pH 5),以样品装载期间进一步降低电导率。在琼脂糖凝胶图像(图GydF4y2Ba118博金宝网址 可见,注入Äkta系统的保留剂包含了在流动过程中没有丢失的活性。分步洗脱过程中E1峰和E2尾均含有RNase活性。相对于进入Äkta体系的保留剂,含活性洗脱馏分的体积减少了2.4倍。GydF4y2Ba

图2GydF4y2Ba
图2.GydF4y2Ba

从SP Sepharose FastFlow阳离子交换色谱从切向流动过滤保留馏分。从图中观察。GydF4y2Ba118博金宝网址 可在此复制,包括有关缓冲液pH值的额外信息(详情请参阅文本)。镶嵌:各组分rna酶活性测定。S: RNA底物,N:阴性对照,R:透析后保留,RGydF4y2BaD.GydF4y2Ba:透析后滞留并用10mM醋酸钠缓冲液,FT:流动级分,E1-E4:洗脱级分,阳离子交换色谱,CIP:清洗级分GydF4y2Ba

通过SDS-PAGE分析样品,如图所示。GydF4y2Ba118博金宝网址 其中观察到在12kDa位置以上的滞留率,E1和E2的条带,其可以对应于重组RNasePF。GydF4y2Ba

图3.GydF4y2Ba
图3.GydF4y2Ba

从图中所示的阳离子交换层析样品的SDS-PAGE分析。GydF4y2Ba118博金宝网址 .C1和C2指清洗就地期间收集的级分。L:分子大小标记以示出以kDa分子量GydF4y2Ba

从不含细胞的上清液的体积减小到在此示出的色谱级分的概述(表GydF4y2Ba118博金宝网址 ).由于高本底吸光度,以库尼茨单位定量的酶活性在无细胞上清中受到阻碍。GydF4y2Ba

表1从细胞外培养基到从阳离子交换色谱柱洗脱的连续步骤,在缩小体积中积累RNase活性GydF4y2Ba

疏水相互作用色谱(HIC)GydF4y2Ba

在测试的条件下,当发酵液上清与3m硫酸铵溶液混合并送入色谱柱时,色谱介质Capto Phenyl High Sub不能有效地纯化目标酶(数据未显示)。初步结果表明,以Toyopearl 650m丁基为培养基,纯化效果较好。以25%,75%和100%的去离子水洗脱。在75%步骤中,在琼脂糖凝胶活性测定中收集到一个E3峰,显示含有RNase活性(色谱图见附加文件)GydF4y2Ba118博金宝网址 ).GydF4y2Ba

HIC作为二次纯化步骤GydF4y2Ba

根据之前的观察,选择使用Toyopearl 650 M丁基培养基的疏水作用色谱法作为二级纯化步骤,对阳离子交换色谱法中含有RNase活性的洗脱液进行二级纯化。该结果如图所示。GydF4y2Ba118博金宝网址 在流动的紫外线吸收的情况下,指向饲料材料是从先前的色谱步骤中具有相对较少的总蛋白质的事实。75%缓冲液B步骤导致含有RNase活性的高浓度的蛋白质,如图2中的琼脂糖凝胶中的泳叶E3所示。GydF4y2Ba118博金宝网址 . 从HIC进料到洗脱液的体积可以减少15倍。相应的SDS-PAGE图像如图所示。GydF4y2Ba118博金宝网址 显示了达到的高浓度水平,并为目标酶在预期12 kDa位置的存在提供了有力的证据。GydF4y2Ba

图4.GydF4y2Ba
图4.GydF4y2Ba

色谱从含有RNA酶的活性洗脱级分从阳离子交换层析步骤中,通过用3M硫酸铵混合用于HIC制备的Toyopearl为650m丁基疏水相互作用层析。镶嵌:各组分rna酶活性测定。S:RNA底物,N:阴性对照,E:洗脱从阳离子交换层析,EGydF4y2BaD.GydF4y2Ba:阳离子交换色谱稀释洗脱,FT:流动分数,W:洗涤,E1–E6:洗脱分数。高浓度的硫酸铵会导致洗脱组分中的涂抹和RNA带移位GydF4y2Ba

图5.GydF4y2Ba
图5.GydF4y2Ba

SDS-PAGE分析浓缩的rna酶活性的含部分(图的E3。GydF4y2Ba118博金宝网址 )来自疏水相互作用色谱,然后阳离子交换色谱纯化。侧翼样品的泳道加载分子大小标记,其中kda中的分子量显示在右侧GydF4y2Ba

去除残留质粒DNAGydF4y2Ba

质粒DNA的很大一部分在阳离子交换工序中除去作为图2中的洗脱级分看出。GydF4y2Ba118博金宝网址 .为了从RNasePF酶制剂中除去残留质粒,阴离子交换膜吸附剂的Sartobind范围是合适的。将含有级分的活性加载到Sartobind膜吸附器上并手动纯化。流程含有酶活性以及在洗涤步骤中回收的弱键酶分子。将结合的DNA分开洗脱,并且该级分不含任何RNase活性(在附加文件中显示的结果GydF4y2Ba118博金宝网址 ).GydF4y2Ba

利用质粒特异性引物进行qPCR验证。用不同的稀释倍数对膜吸附前后的酶样品进行了测试。表格GydF4y2Ba118博金宝网址 显示了在标准曲线的基础上对残留DNA的绝对定量。GydF4y2Ba

表2纯化的RNase PF酶制剂中PF1680质粒拷贝数的绝对定量。定量是基于含有氨苄青霉素抗性基因的标准质粒扩增产生的标准曲线GydF4y2Ba

应用程序GydF4y2Ba

在清除碱性裂解物中去除RNAGydF4y2Ba

琼脂糖凝胶电泳图。GydF4y2Ba118博金宝网址 结果表明,不添加RNase的裂解产物具有明显的RNA荧光。在重悬细胞中添加一种商业可用的牛RNase a (Sigma-Aldrich)可以明显地去除清除的裂解液中的RNA,而在RNase PF (RPF)通道中,RNA则不受影响。因为相同的酶活性是添加到这两个样品,这指出碱性溶解的可能性条件变性酶核糖核酸酶PF远远超过核糖核酸酶a这个假说是进一步加强,RNA从控制溶解清除溶解产物,这意味着有必要调整常规方案,在产生清除的裂解液后再添加RNase PF,而不是在细胞重悬阶段添加。这些初步应用结果也表明,表达的RNase不具有DNase活性。GydF4y2Ba

图6.GydF4y2Ba
图6.GydF4y2Ba

含有裂解物的RNA / DNA的琼脂糖凝胶电泳,用于比较牛RN​​aseA和RNase PF的酶活性。N:裂解而不加入RNase,S:用RNaseA(Sigma-Aldrich)的裂解添加到重悬浮细胞中。RPF:用RNase PF裂解加入重悬浮细胞。N + RPF:用RNasePF处理的裂解裂解物N.M:DNA分子大小标记GydF4y2Ba

阴离子交换色谱法在质粒生产中的应用GydF4y2Ba

在第一次试验中,裂解的有效生物质为13克。所清除的裂解物如图1的左侧所示。GydF4y2Ba118博金宝网址 .在阴性对照的泳道中,可以鉴定下分子量区域中的RNA云。在添加牛RNase A和在37℃下将样品温育15分钟后,可以看到RNA的完全降解。在RNasePF的情况下,这种效果在稍微稍微明显,然而,RNA含量降低到这种随后通过阴离子交换色谱纯化的程度。从色谱法中,加载在凝胶上的洗脱级(洗脱液)显示,对照污染与色谱介质结合并与质粒一起洗脱的RNA。在牛RNaseA以及RNase PF的情况下,洗脱级分纯质粒DNA。GydF4y2Ba

图7.GydF4y2Ba
图7.GydF4y2Ba

RNasePF在质粒纯化过程中的应用。比较清除碱性裂解物,无含添加或加入的RNase(牛RNase A或RNasePF)以除去RNA云。然后通过专有的DNA纯化色谱步骤纯化裂解物。在残留的RNA的基础上比较了三种情况下的质粒脱离。- 和+在用RNase处理之前和之后,在37℃下孵育15分钟。对于对照,没有添加RNaseGydF4y2Ba

在每种情况下,来自DNA纯化的色谱图能够非常良好地理解RNA污染的影响(图。GydF4y2Ba118博金宝网址 A-C)。在没有添加的酶的对照中,RNA非常有效地竞争结合位点,导致UV260吸收稳定增加,并且最终突破。作为直接后果,在用25%缓冲液B的洗涤过程中存在非常突出的结合分子。用60%缓冲液B的洗脱峰是不规则的并且指向不同分子的混合物在一起。这在图2中的琼脂糖凝胶图像中确认。GydF4y2Ba118博金宝网址 .在牛RNaseA和RNasePF的情况下,流动的曲线是稳定的,洗涤峰是相对较小的并且洗脱峰值尖锐,指向纯单一类型的分子被洗脱,在琼脂糖凝胶图像中再次证实是质粒DNA。GydF4y2Ba

图8GydF4y2Ba
figure8GydF4y2Ba

来自质粒纯化过程的色谱图,不添加RNases(GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba),添加牛RNase(GydF4y2BaB.GydF4y2Ba)或添加RNA酶PF的(GydF4y2BaCGydF4y2Ba)到清除的碱性裂解物饲料。在B和C的情况下,在60%洗脱缓冲液中的洗脱液是对应于纯质粒的尖峰,如图2所示。GydF4y2Ba118博金宝网址

在缩放到50g生物质的裂解后,发现RNase PF酶制剂中的体积活性的电流水平不足。琼脂糖凝胶分析表明,RNA降解发生但未完成(饲料在图1中的饲料。GydF4y2Ba118博金宝网址 ).随后对清除的裂解物进行阴离子交换层析,表明这对质粒下游纯化过程意味着什么(图)。GydF4y2Ba118博金宝网址 ).在RNase PF的情况下,RNA含量中的饲料显然呈显然低,但仍然与柱结合的残留RNA。这在洗涤部分中是明显的,最后在洗脱的产物中,其中质粒被残留的RNA污染。在没有酶的控制的情况下,进料和流程具有较大量的RNA,在两种级分中收集洗涤,两种级数都是大量污染的RNA,最终产物具有比RNase PF的情况更多的RNA。GydF4y2Ba

图9.GydF4y2Ba
figure9GydF4y2Ba

50 g生物质各自与另外的RNA酶PF到裂解后通过阴离子交换色谱法从质粒纯化过程中的不同级分的琼脂糖凝胶分析清零碱性裂解物或不含(对照)。FT:流出液,W:洗净,E:洗脱GydF4y2Ba

为了总结,降解不足以导致干净的色谱产物,这可以追溯到酶制剂的低体积活性,该酶制剂设定电流能力的限制。GydF4y2Ba

讨论GydF4y2Ba

在质粒DNA的色谱纯化过程中,RNA是主要的竞争对手。降低清除的裂解物饲料中RNA含量的策略通过允许更高的目标分子结合来提高色谱步骤的成功率[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].在当前工作中所描述的实验是开发一种重组核糖核酸酶将允许质粒DNA的有效的纯化,同时避免使用牛核糖核酸酶A的质量的关注,试图GydF4y2Ba

的重组表达GydF4y2Bab . amyloliquefaciensGydF4y2Ba高产率的RNaseGydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba已被称为非常具有挑战性。只要晶片酶以原生和活性形式表达,所有先前的研究都已经报告了共同表达细胞内抑制剂蛋白质Barstar的必要性。使用PHOA信号序列的周质靶向策略在当前的工作中提出。这应该充当毒性的安全措施,而尚未运输的任何细胞内晶酶都应被抑制剂中和。以前,voss等人。[GydF4y2Ba118博金宝网址 ],克隆用于周质表达,但发现PelB前导序列不适合这种情况,因此他们的工作重点是细胞质部分。GydF4y2Ba

BRP的低水平表达导致外膜通透性的半选择性增加,从而导致周质蛋白释放到细胞外介质中[GydF4y2Ba118博金宝网址 那GydF4y2Ba118博金宝网址 ].这GydF4y2Ba基尔GydF4y2Ba编码BRP pColE1的基因的弱生长相依赖的启动子的控制下共表达GydF4y2BaFic.GydF4y2Ba基因。这将允许对细胞外表达的强度、时间和自动BRP激活进行调节,同时避免准裂解和致死。细胞外表达的优点不仅是防止了有毒蛋白在细胞内的积累,而且由于不涉及额外的裂解步骤和特异性靶蛋白浓度较高,因此比胞浆/细胞质表达的水平有所提高。另一方面,细胞外表达稀释了酶和挑战将处理大量的液体在下游加工。GydF4y2Ba

即使用有限量的重组RNase在质粒纯化期间提高RNA降解效率的一种方法是在碱性裂解之前改变TRIS-EDTA缓冲液中细胞的重新悬浮时间。我们已经观察到这一点GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba天然酶可以以一种方式,还没有被广泛表征是活动的。在其它实验中,导致更长的再悬浮次以降低的RNA水平,同时也普遍增加不同形式的质粒DNA,而不是所期望的形式CCC(未示出数据)。连续减小的RNA条带的荧光相对于再悬浮时间可以在琼脂糖凝胶中,其可以以设置与加入的重组核糖核酸酶的组合的策略可以更好地研究显示。在澄清的裂解物的内源性阶段RNA酶活动(通过幸存的碱裂解过程的酶)的作用利用,以提高所得到的质粒纯度[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].然而,对质粒DNA的附带损害也被清楚地观察到,因此这个策略必须被优化以确保重现性。必须指出,长时间的培养与大规模质粒生产的有效过程不相容。将ccc型转化为oc型会导致有用的质粒DNA的普遍丢失。GydF4y2Ba

Barnase的pI为9.2 [GydF4y2Ba118博金宝网址 ]和为5的缓冲液pH的阳离子交换色谱法决定被用作纯化的RNA酶PF的主要方法。这还具有以下优点,即任何污染性DNA分子可被分离开。对于阳离子交换剂,靶酶到SP琼脂糖结合Fast Flow柱是不可能的在18毫秒cm的电导率GydF4y2Ba- 1GydF4y2Ba.在当前的营养培养基中,发酵液的无细胞上清也被发现具有12 mS cm的电导率GydF4y2Ba- 1GydF4y2Ba.在我们的实验中,电导率必须减少到4毫秒GydF4y2Ba- 1GydF4y2Ba成功绑定到列。GydF4y2Ba

硫酸铵沉淀作为立即浓缩步骤,提供了将重悬的富盐蛋白直接用于色谱的可能性,从而发展HIC作为捕获步骤。如果该工艺规模扩大,那么硫酸铵将不是一个理想的选择,大量使用,因为它对环境有害。由于硫酸铵步骤没有导致显著减少体积,因为它是不可能绕过diafiltration阳离子交换色谱步骤时,硫酸铵沉淀被遗弃和过程开发最后一批上层清液直接切向流过滤。为了减轻过滤步骤,可以使用耐盐阳离子交换色谱介质,这将允许结合目标蛋白在一个相对较高的电导率。GydF4y2Ba

为避免在纯化初期DNA污染,可以先酸化培养上清液。细胞分离前培养液的酸化,由[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].在周质表达中,这也会释放周质蛋白[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].GydF4y2Ba

从图10的SDS-PAGE图像。GydF4y2Ba118博金宝网址 ,可见色谱洗脱液中仍有其他宿主细胞蛋白存在。使用如30 kDa的离心过滤器,应该可以去除大多数分子量较高的蛋白质。此外,纯化的RNase将应用于从碱性裂解中清除的裂解液,用于质粒制备。虽然这种被清除的裂解物的蛋白质含量减少了,但它仍然含有同样来源于GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba.质粒纯化的色谱步骤已被证明是非常有效的,在质粒制备中大幅度降低宿主细胞蛋白含量。GydF4y2Ba

关于酶活性的笔记GydF4y2Ba

最多4 KU毫升GydF4y2Ba- 1GydF4y2Ba可以在本研究中的酶制剂中测量。从10L发酵液中没有细胞上清液导致约210ku。基于不同启动子的文献报告,用于表达,产品的不同亚细胞位置,因此不同的纯化策略可提供510 ku的值[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].GydF4y2Ba

还难以比较文献报告,因为还使用基于260nm处的吸光度增加的酶活性测量的另一种方法。用于实际目的的比较方法是在可以用它用于质粒生产的细菌生物量的量来描述酶活性 - 通常,加入牛RNase以重悬于过量的细胞以进行过度消化并通过裂解步骤。GydF4y2Ba

当计算添加到清除的裂解液中的酶的数量时,宿主细胞RNA的水平在每个清除的裂解液中是高度可变的,这导致了不可复制的条件。延长的再悬浮时间对天然酶活性的利用不是完全可控的。基于荧光的RNA水平测定在清除的裂解物是不可靠的,因此一个更好的RNA定量方法是基于高压液相色谱的峰面积。在这种方法下,需要酶活性库尼茨单位来降解一定数量的RNA。这将有助于使程序标准化和明智地使用重组酶。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

RNase PF在大肠杆菌中重组表达GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba并从培养上清中纯化。它对质粒DNA纯化的适用性表明,因此有必要调整程序,允许在清除碱性裂解液阶段添加重组酶。总结我们所有的结果,如果这个过程要有意义地扩大,显然有必要提高酶的比生产力。为此,我们最近将表达质粒转入T7启动子系统。由于启动子活性极度泄漏,导致相应的表达菌株难以表达,最终找到了可控制RNase PF表达的最佳表达菌株。为了继续这项工作,需要评估基于t7的表达是否能提高特定酶的生产能力,使酶制剂的容量活性增加至少100倍。然后,目的将是有意义地帮助裂解50克细菌生物量,用于如上所述的质粒制备。GydF4y2Ba

方法GydF4y2Ba

宿主菌株和质粒GydF4y2Ba

大肠杆菌GydF4y2Ba在整个研究中使用了DH5α,用于克隆重组晶酶基因以及测试其表达。GydF4y2Ba

质粒PF1680的建设GydF4y2Ba

首先,用含无启动子的芽孢杆菌RNA酶基因和完整的芽孢杆菌RNA酶表达单位的片段PF1650合成(欧陆GmbH)中。为了克隆芽孢杆菌RNA酶基因的启动子的上游,从质粒PP11(PlasmidFactory GMBH&Co. KG的)的1.3kb片段包含PGydF4y2Ba坏GydF4y2Ba推动者和促销员GydF4y2BaaraCGydF4y2Ba基因通过用EcoRI,HindIII和NotI限制性隔离。PF1650用EcoRI和HindIII将所得4468 bp片段限制分离并用的Fastap去磷酸化。将两个片段的EcoRI和HindIII末端连接。所得的质粒称为PF1680(附加文件GydF4y2Ba118博金宝网址 ).GydF4y2Ba

Shake-flask种植GydF4y2Ba

实验在250mL工作体积中在1L摇瓶中在复合培养基中的烘烤烧瓶中进行。接种物是1ml验证克隆的甘油原液。将氨苄青霉素加入到100μgml的终浓度中GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba选择含质粒的细胞。在30至37℃的温度下进行培养。在水平轨道摇动器中以120 rpm和2厘米的偏转进行摇晃。GydF4y2Ba

用L-Arabinose诱导培养物(最终浓度10g lGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba)在指数增长阶段结束时。GydF4y2Ba

发酵GydF4y2Ba

在发酵罐(生物工程)中进行分批发酵,工作体积为10L。发酵瓶以1%v / v基础从摇瓶生长的预培养物中接种。氨苄青霉素(100μgmlGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba)仅在预测中使用。曝气速率为1 VVM,初始叶轮速度为200 rpm,pH为7.0,温度为37°C是要控制的条件。将溶解的氧浓度级联以叶轮速度保持在至少60%的饱和度。在发酵时间6小时,用L-阿拉伯糖诱导培养物以10g l的最终浓度诱导GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba. 在具有类似操作条件的Biostat CPlus发酵罐(Sartorius)中进行20 L体积的放大发酵。GydF4y2Ba

下游处理GydF4y2Ba

将培养液中的细胞在1-16k离心机(Sigma)中分离10分钟,以8000×GydF4y2BaGGydF4y2Ba.在itially, ammonium sulphate at up to 60 % saturation was used to precipitate the proteins in the final supernatant from the batch cultivation after harvest. Overnight storage at 4 °C resulted in settled proteins. These proteins were centrifuged at 8000 ×GGydF4y2Ba在4℃10分钟,并再悬浮在10mM乙酸钠缓冲液(pH 5.1)。电导率是使用WTW Tetracon 325探针(WTW GmbH)中进行测定。对于通过经典透析脱盐,使用具有3.5千道尔顿MWCO(卡尔罗斯)一个ZelluTrans /Roth®纤维素膜。为100毫升的样品,使用和对通过缓慢搅拌过夜4.5升蒸馏水透析19厘米管。脱盐试验也通过超滤在切向流过滤过程进行体积高达500毫升含50厘米Pellicon®XL盒式GydF4y2Ba2GydF4y2BaBiomax®膜(Merck Millipore)或Vivaflow 200,带有200厘米GydF4y2Ba2GydF4y2Ba聚醚砜膜(Sartorius)都与5kDa的MWCO。对于一个放大的过程中,蛋白质溶液通过5μmMDI ClariCapPP聚丙烯囊式过滤器(高级微型器件)的预过滤。对于TFF甲Quattroflow泵系统中组合使用用Omega Centramate膜(OS005T12,PALL),其具有5kDa的MWCO和0.1μm的表面积GydF4y2Ba2GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

阳离子交换层析GydF4y2Ba

超滤的保留物在Äkta纯化层析系统中使用SP Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences)树脂进行纯化。平衡缓冲液(缓冲液A或A1)为0.1 M或0.01 M醋酸钠/醋酸缓冲液(pH 5.0)。洗脱缓冲缓冲区(B)包含1 M氯化钠,100毫米三10毫米EDTA (pH值7)。这种酶使用0到100%的盐梯度筛选了缓冲B / 1 h或通过步进式增加到25%,50 - 100%的缓冲B Cleaning-in-Place使用0.5 M氢氧化钠通过A2泵的入口。GydF4y2Ba

规模SP琼脂糖FF达GydF4y2Ba

为了以相对较高的流速来处理大量,所述色谱柱的扩大被实现为显示在表GydF4y2Ba118博金宝网址 .主要指导条件是该列的直径要被增加以容纳更多的材料,体积流动速率要被增加仅保持通过该柱相同的线速度。为了便于操作,与XK26柱流速向上舍入到10毫升分钟GydF4y2Ba- 1GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

表3 SP琼脂糖快速流动柱的比例放大GydF4y2Ba

疏水作用色谱法GydF4y2Ba

将Capto-Phenyl High Sub(GE Healthcare)或Toyopearl 650 M-丁基(Tosoh Bioscience)树脂装入XK26/20柱(GE Healthcare)中,其床体积分别为25 mL和23.7 mL,并使用Äkta纯化器色谱系统进行操作,以测试HIC,作为二级纯化步骤。使用含有2M硫酸铵的高盐缓冲液对色谱柱进行平衡。色谱进料溶液与3 M硫酸铵(pH 5.3)混合,以在样品中产生2 M的最终浓度。操作体积流率为20ml minGydF4y2Ba- 1GydF4y2Ba对于Capto苯基柱和5mL minGydF4y2Ba- 1GydF4y2Ba丰田珍珠专栏。用去离子水作为“缓冲液B”洗脱蛋白质。GydF4y2Ba

去除DNAGydF4y2Ba

使用床体积为1mL的膜吸附剂Sartobind STIC PA(Sartorius)用于从先前的色谱步骤中除去纯化的和浓缩的酶馏分中的污染DNA。对于小体积,使用手动注射器用于将样品通过膜吸附器推动。对于较大的体积,吸附器连接到ÄKTA净化器色谱系统,并在5mL min以5毫升操作GydF4y2Ba- 1GydF4y2Ba.样品使用所述试剂盒的FastStart DNA基本绿色万事达(Roche)的采取验证通过qPCR。设计引物以扩增在PF1680β-内酰胺酶基因中的116 bp片段。含有氨苄青霉素抗性基因的质粒pUC21更多是在已知浓度作为标准使用。分析在LightCycler仪器96(Roche)的执行。GydF4y2Ba

测定核糖核酸酶活性的方法GydF4y2Ba

用于测试的酶活性的底物为从来自Roche质粒分离或酵母RNA(可以是澄清的裂解物2.5毫克毫升GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba在去离子水)。浓度100的磷酸钠缓冲剂mM和pH为6或pH 7.5也适合于溶解在衬底。GydF4y2Ba

在15µL底物中,在1.5 mL PP管中加入等量的供试品或水作为阴性对照,并在37°C下培养15分钟。反应后,将样品与凝胶负载染料紫色6X(新英格兰生物实验室)混合,并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。酶活性表现为RNA条带荧光消失。使用来自PlasmidFactory GmbH&Co.KG的1 kb DNA分子大小标记来检查质粒的释放。GydF4y2Ba

酶活性量化GydF4y2Ba

根据Kunitz原理定量纯化样品中的RNase活性[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].根据Sigma-Aldrich根据协议进行测定[GydF4y2Ba118博金宝网址 ]与仅在总反应体积至1.5毫升的变化。通过测量在300nm处消光减少的测定法如下酵母RNA的降解。GydF4y2Ba

SDS页面GydF4y2Ba

通过离心过滤器(UFC501008,Merck Millipore)浓缩样品,其中分子量为10kDa。然后通过用4x加载缓冲液(含有5%(w / v)2-巯基乙醇和2%(w / v)Sds)和在96℃下沸腾5分钟来制备样品。通过Tris-甘氨酸缓冲液中的电泳在12%聚丙烯酰胺凝胶中溶解蛋白质。使用的分子尺寸标记是PageRulterm Prested蛋白梯(Thermo Fisher Scientific)。将凝胶在去离子水中洗涤15分钟,用0.02%Coomassie亮蓝G-250(Bio-rad)染色过夜,然后在去离子水中脱去2小时。GydF4y2Ba

总蛋白质浓度的测定GydF4y2Ba

使用改性的Bradford测试套件(Carl Roth)估计总蛋白质。测量吸收在595nm和450nm处,它们用于使用牛血清白蛋白作为标准的蛋白质浓度与蛋白质浓度相关的比率。使用Costar 3596 96孔细胞培养簇(康宁掺入)和滤光片效果进行测量来进行测量。GydF4y2Ba

重悬细胞溶液中RNase活性的试验GydF4y2Ba

含有0.05mg ml的RNase PF的纯化酶馏分GydF4y2Ba- 1GydF4y2Ba通过分光光度法分析,发现蛋白质的活性为2.6库尼茨单位mLGydF4y2Ba- 1GydF4y2Ba(KU毫升GydF4y2Ba- 1GydF4y2Ba).这比从市售牛核糖核酸酶A(Sigma-Aldrich公司)制成的制剂更小约500倍。这两个RNA酶制剂在其effectivities进行比较细菌的碱裂解过程中降解RNA。酶制剂加入到重悬在再悬浮缓冲液(25毫摩尔Tris,10mM的EDTA,50mM的葡萄糖,pH 8.5)的细胞。GydF4y2Ba

商业核糖核酸酶A含有114个Kunitz单位mg蛋白质GydF4y2Ba- 1GydF4y2Ba其中只有约这里测试所述重组酶的两倍的比活性。对于该实验,将250mg的每个生物质用3.75 KU RNA酶A或3.75 KU RNA酶PF任裂解。将澄清裂解物通过琼脂糖凝胶电泳分析。从没有添加RNA酶生物质裂解的澄清的裂解液作为对照。此外,为了这个裂解物的10μL,RNA酶PF10μL的溶液中加入并孵育在37℃下15分钟,在该阶段,以测试所述酶的活性。GydF4y2Ba

应用到DNA纯化GydF4y2Ba

根据一项基于原始碱性裂解方法的协议对解冻的生物质进行裂解[GydF4y2Ba118博金宝网址 ].清除的裂解物要么用牛RNaseA或RNasePF处理,并与阴性对照相比而不加入RNase。使用ÄKTA净化器色谱系统使用专有的阴离子交换色谱方案进行质粒纯化。在第一个实验中,将40g生物质重悬于400ml的1倍重悬浮缓冲液中。在进行裂解和中和缓冲剂后,通过以9600rpm离心7分钟,通过离心产生清除裂解物。通过0.2μmMDI滤波器(先进的Microdevice)过滤上清液。这被分成三个反应管,其中第二和第三管分别接受牛RNaseA和RNasePF。因此,有效地,对每种情况进行了测试的13.3g生物质。如上所述进行RNase活性测定。在随后的缩放实验中,裂解100g生物质,将得到的3000ml清除裂解物分成两个反应容器。 One served as control whereas the other received 100 mL RNase PF preparation with a volumetric activity of 1.5 KU mL- 1GydF4y2Ba.因此,有效量的生物质这里测试RNA酶PF的应用为50g。GydF4y2Ba

可用性数据和材料GydF4y2Ba

本研究中生成的数据属于PlasmidFactory GmbH & Co. KG的专有信息,不对外公开。然而,在可能的情况下,相应的作者可以根据合理的要求提供数据集。GydF4y2Ba

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下载参考GydF4y2Ba

致谢GydF4y2Ba

作者感谢Florian Weber、Stefan Bruning、Christa Krüsemann、Robert Merz、Barbara Tiemann和Thomas Wojtulewicz提供的技术支持。作者感谢Katja Schleef和Tim Serrano对这些数字的帮助。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

这项工作是由PlasmidFactory GMBH&Co. KG的支持。GydF4y2Ba

作者信息GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

作者GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

MS和MS设计了研究项目。RS和NS进行了所有实验并准备了稿件。JMR和KF监督工作并修订了稿件。所有作者阅读并认可的终稿。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2BaRam Shankar.GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

伦理宣言GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

KG公司采用RS, NS, MS和MS。GydF4y2Ba

额外的信息GydF4y2Ba

出版商的注意GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

补充信息GydF4y2Ba

附加文件1。GydF4y2Ba

构建PF1680的RNase PF表达质粒图谱。GydF4y2Ba

额外的文件2。GydF4y2Ba

DH5α-PF1680的批量生产曲线。镶嵌:在20L级发酵期间在相应的时间点(0-12小时)的细胞外级分中的RNase活性测定。S:RNA,N:阴性对照。M:DNA分子大小标记。GydF4y2Ba

额外的文件3。GydF4y2Ba

从Toyopearl 650m丁基疏水相互作用色谱无细胞上清与3m硫酸铵混合制备HIC。以25%、75%、100%的去离子水作为缓冲液B分步洗脱后,用10%异丙醇(E8)进一步洗脱。镶嵌:各组分rna酶活性测定。S: RNA底物,N:阴性对照,F:发酵液上清,FGydF4y2BaD.GydF4y2Ba:稀释的无细胞上清,FT:流过馏分,E1-E8:洗脱馏分。高浓度的硫酸铵引起了洗脱馏分的涂污和RNA带置换。GydF4y2Ba

附加文件4。GydF4y2Ba

RNase活性测定,以测试的Sartobind阴离子交换膜吸附器的适用性从纯化的酶级分的除去残余质粒DNA。S:RNA底物,N:阴性对照,EN:纯化酶组份,FT:流出液,W:洗净,E:洗脱和C:在CIP的Sartobind膜吸附器。L:DNA分子大小标记物。GydF4y2Ba

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开放获取GydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证,这允许在任何中或格式中使用,共享,适应,分发和复制,只要您向原始作者和来源提供适当的信贷,提供了一个链接到Creative Commons许可证,并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明,否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中,除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中,法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用,您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本,请访问GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba.创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本文提供的数据,除非在数据的信贷额度中另有说明。GydF4y2Ba

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Shankar,R.,Schäffer,N.,Schmeer,M。GydF4y2Ba等等。GydF4y2Ba巴纳酶在大肠杆菌中的重组表达GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba及其在质粒纯化中的应用。GydF4y2BaMicroB细胞事实GydF4y2Ba20,GydF4y2Ba171(2021)。https://doi.org/10.1186/s12934-021-01642-yGydF4y2Ba

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关键词GydF4y2Ba

  • 核糖核酸酶GydF4y2Ba
  • 巴纳斯GydF4y2Ba
  • 质粒GydF4y2Ba
  • 碱性溶菌作用GydF4y2Ba
  • 阳离子交换层析GydF4y2Ba