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细胞外ATP在共培养中的信号传导作用Shiraiasp。S9和Pseudomonas Fulva.SB1用于提高羟色氨苄A的产量

摘要

背景

腺苷5'-三磷酸(ATP)在动物和植物的不同生理过程中发挥着中心作用,以及在不同生理过程中的关键细胞外信号传导作用。然而,关于微生物细胞外ATP(EatP)的信号作用的报道较少。Bumusicolous的患者是有效的抗癌光学性疗法(PDT)药物Shiraia真菌。的培养Shiraiasp. S9和一种细菌Pseudomonas Fulva.SB1隔绝Shiraia建立子实体以提高HA的产量。在共培养条件下,研究了eATP介导下丘脑红素生物合成的信号转导作用。

结果

共培养诱导释放Eatp在378nm至培养基中左右4小时。Eatp释放对细胞溶胶CA相互依赖2+浓度和活性氧(ROS)的产生。钙离子可抑制eATP的产生2+螯合剂EGTA或通道阻断剂La3+、活性氧清除剂维生素C和NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘氯化铵(DPI)。bacterium-induced H2O2活性蓝(RB)是一种特异的膜嘌呤受体抑制剂,它强烈地抑制了产物的生成,但依赖于诱导的Ca2+融入到共同文化中。另一方面,外源ATP (exATP)在10-300µM的应用,可使细胞生长发育良好Shiraia培养物也促进了真菌的分生和HA的产生,这两者都被嘌呤受体抑制剂pyridoxalphosphate-6- azphenyl -2 ', 4 ' -二磺酸(PPADS)和RB以及ATP水解酶apyrase有效地阻断了。在eATP或Ca的阻断下,HA生物合成基因的诱导表达和HA积累均明显受到抑制2+信号转导、共培养中ROS的清除。

结论

我们的结果表明,eATP的释放是细菌-真菌相互作用的早期事件,eATP在细菌诱导真菌代谢产物中发挥信号作用。Ca2+并且ROS密切相关,以激活诱导的ATP释放及其信号转导。这是真菌 - 细菌共同培养中吃EATP生产的第一份报告及其参与诱导的真菌代谢物生物合成。

图形摘要

背景

ATP (Adenosine 5’-triphosphate, ATP)通常被认为是一种普遍的细胞内能量货币,支持细胞内需要能量的生化反应,同时也作为质膜外的信号通路,参与多种生理过程[1].动物细胞具有产生细胞外ATP (eATP)的能力,以调节生长、免疫反应、细胞凋亡、神经传递和肌肉收缩[23.].研究发现,eATP结合并激活两类细胞表面受体,配体门控离子通道P2X和g蛋白偶联的P2Y受体,产生第二信使[4].新的证据表明,eATP参与植物的生长和发育,包括膜电位和气孔运动的调节,根毛和花粉管的生长,向地性和非生物/生物胁迫反应[5].DORN1,植物eATP受体,是一种凝集素受体激酶,结构上不同于动物ATP受体[6].eATP启动早期生理反应,如触发Ca2+内流、刺激活性氧(ROS)的生成、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因的上调表达,以及随后的反应,如诱导防御基因表达和抗病能力[7].虽然在先天免疫中eATP信号的作用在动物和植物中都有很好的文献记载,但对微生物中eATP信号的了解相对较少。最近在各种人类致病菌中发现了eATP的存在不动杆菌Aggregatibacter假单胞菌, 和克雷伯氏菌89]及肠道细菌[10.].丁和棕褐色发现,Eatp诱导牙周相关细菌的分散梭菌属nucleatum增强毒性以诱发牙周病发炎[11.].Eatp被报告为损伤相关的分子模式(潮湿),以诱导细胞源游离钙的流入([Ca.2+cyt.)并激活MAPK TMK1以用于丝状真菌的悬垂再生木霉属atroviride机械损坏[1213].虽然有报道外源性ATP (exATP)增强互变霉素链霉菌属griseochromogenes14],关于eATP在微生物次级代谢产物生物合成中的信号转导作用的报道较少。

兔子,主要的主要内金属Shiraia真菌,是光动力治疗(PDT)的新型非卟啉光敏剂,用于癌症[15免疫缺陷病毒[16].我们以前的一项研究表明,一些引出的策略,包括光/暗换档(24:24小时,200Lx)和超声暴露(0.28W / cm2在40千赫)成功地提高了羟色胺的产量Shiraia1718].在我们之前的研究中[19),一种细菌Pseudomonas Fulva.SB1从Shiraia结果表明,子实体显著增加下丘脑红素的产生。建立的共培养体系Shiraiap .叶SB1呈现出更高的胰蛋白酶A(HA)325.87mg / L,约3.20倍的轴静脉培养[20.].此外,我们发现ATP绑定盒的表达(美国广播公司)Shiraiasp. S9表达上调,约为对照的3.1倍。更多的证据支持ABC是ATP从细胞内储存到细胞外基质的主动运输的载体之一[2122].另一方面,ROS和CA的信令2+/calmodulin (CaM)已在Triton X - 100和真菌诱导子的应用中得到验证Shiraia用于生产甲酚[2324].自增加的水平以来2+cyt.和ROS已经被证明在动物和植物细胞中eATP的早期信号步骤[7],我们在此假设eATP可能参与了细菌与真菌相互作用过程中诱导的反应。近年来,模拟自然微生物群落的细菌-真菌共培养正成为扩大微生物化学多样性或提高代谢产物产量的有效策略。共培养中诱导的微生物代谢物(259种化合物)被Arora等人细分为9个显著簇,分为“非氮化合物”、“非生物碱含氮化合物”和“生物碱化合物”三组[25].共培养的诱导被揭示为微生物生物转化的结果[26,激活隐蔽的生物合成途径[27或增加组蛋白乙酰化[28].然而,对于通过共培养的化合物诱导的化学信号提供少量信息。作为我们努力阐明引发诱因诱导假期性生物合成的信令事件的后续行动[1820.24,我们检测了共培养中eATP的变化Shiraiasp. S9与细菌p .叶SB1。我们还探讨了eATP与诱导的ROS或Ca之间的关系2+涌入,及其对Hypocrellin生物合成的调解。了解Eatp在细菌 - 宿主相互作用中的信号作用可能为诱导机制提供新的洞察力,并导致新型共培养策略的真菌代谢产物生产。

结果

在共同文化中泻药释放

真菌细菌对抗测定(图。1A)被用来调查细菌的影响p .叶SB1对寄主真菌的降红素积累的影响Shiraiasp. S9在PDA培养基中。共培养2 ~ 6 d后,观察S9菌丝分泌红色色素的情况(图。1b).摇瓶培养的总HA产量为263.25 mg/L,是S9单培养第8天的2.48倍(图2)。1c). 15 min后,eATP显著增加,浓度在378 nM处达到峰值,约4 h(图)。1d).为了确定eATP产生的来源,我们测定了经活菌(B)处理的真菌培养物(F)、菌液提取物(BBE)、细菌粗多糖(BPS)和热杀菌(DB)处理的真菌培养物(F)中eATP的释放量(图)。1e).只有活菌能增加eATP浓度(图中F + B)。1e),而细菌提取物(BBE和BPS)处理不改变eATP浓度。相反,我们测量了由真菌多糖(FPS)或真菌肉汤提取物(FBE)以及HA处理的细菌培养中eATP的产生,浓度为5 mg/mL(图。1f). eATP浓度仅被HA轻微提高。这些结果表明,eATP的释放依赖于共培养中活菌和真菌的存在。

图1
图1

在共培养条件下,HA (Hypocrellin A)的产生和ATP的释放Shiraiasp。S9和p .叶SB1。一个方案在体外双培养板对抗测定。b活SB1对PDA平板S9生长及红色素分泌的影响4日龄真菌菌落用SB1处理2-6日龄。菌悬液(10µL)呈两条平行的直线,相距约7 cm。在28°C的PDA上保持培养。cS9在共培养中产生的HA总量。共培养保存在150-mL烧瓶中,其中含有50 mL液体培养基,转速为150 rpm,温度为28℃,培养8 d。d在共同培养中的ATP释放。将6天的真菌菌丝体用SB1(400个细胞/ mL)处理,并在150rpm和28℃下孵育。在加入SB1之前,在1小时将2U / mL的戊酶加入到培养物中。e活SB1 (B, 400细胞/mL)、热杀SB1 (DB, 400细胞/mL)、细菌粗多糖(BPS)和细菌肉汤提取物(BBE)在100 mg/mL条件下培养1 h,释放ATP。f真菌多糖(FPS)和乙酸乙酯提取物(FBE)在100 mg/mL和HA (5 mg/mL)作用1 h后释放ATP。值是来自三个独立实验的平均值±SD(*p< 0.05和**p< 0.01 vs.控制)。条形图上方不同的字母表示显著差异(p< 0.05)

eap诱导真菌HA产生和分生

将10-300µM的外泌atp应用于S9的固体培养,增加了红色素的分泌(图2)。2a).在液体培养中,胞内和胞外HA均被外atp(50-200µM)增强,且呈剂量依赖性(图2)。2b).为了验证ATP的作用,在共培养中使用嘌呤受体抑制剂pyridoxalphosphate-6-偶氮苯基-2 ',4 ' -二磺酸(PPADS)或活性蓝(RB)和ATP水解酶(2 U/mL)阻断eATP反应。如图所示。2c,在共培养中,apyrase或嘌呤受体抑制剂显著降低细胞内和细胞外HA。另一方面,我们进行了另一项对照实验,使用非水解形式的ATP (ATPγ s)和ATP衍生物(ADP和AMP)来诱导HA的产生(图。2d)。与ADP或AMP诱导低得多的HA增加水平,atpγs增加到类似水平的HA产生与类似水平的水平增加,表明在HA生产中不需要ATP水解。

图2
figure2

三磷酸腺苷(ATP)对血凝素A (HA)产生的影响Shiraiasp, S9。一个研究了外源ATP (extratp)对红色素分泌和生长的影响Shiraiasp。S9在PDA板中。用Exatp处理S9并在28℃下孵育10天。b外磷酸腺苷对液体培养HA产生的影响。在S9培养8天的第6天添加外磷酸腺苷。c嘌呤受体抑制剂和淀粉酶对sb1诱导的HA产生的影响。将6日龄的真菌菌丝与抑制剂pyridoxalphosphate-6-偶氮苯基-2 ',4 ' -二磺酸(PPADS)和活性蓝(RB)共10µM和apyrase (2 U/mL)共孵育1 h,然后加入SB1,再培养2 d。dATP模拟(ATPγS)和衍生物(ADP和AMP)对淹没培养中HA生产的影响。在S9的8天培养期间,分别在100μm时分别在100μm下添加EXATP,ATPγS,ADP和AMP。值是来自三个独立实验的平均值±SD(*p< 0.05和**p< 0.01 vs.对照组,p< 0.05和##p< 0.01 vs. SB1治疗)。条形图上方不同的字母表示显著差异(p< 0.05)

同时,我们发现,分别在100µM和300µM外泌atp处理后,S9的pycnidium数量和分生孢子浓度均呈剂量依赖性增加(图2)。3.a, b).在真菌-细菌对抗试验中,活菌SB1使真菌的分生孢子增加了134.1%(图中SB1)。3.c).嘌呤受体抑制剂和ATP水解物apyrase处理均显著抑制了诱导的分生(图。3.c),表明通过Eatp信号调节SB1诱导的结合。

图3
图3

ATP对空中菌丝生长的影响一个和分生孢子生产bShiraiasp, S9。在PDA板上。箭头(红色)表示Pycnidium。c嘌呤受体抑制剂和淀粉酶对sb1诱导的真菌分生作用的影响。用pyridoxalphosphate-6- azphenyl -2 ', 4 ' -二磺酸(PPADS)和活性蓝(RB)分别于10µM或apyrase (2 U/mL)处理S9 30 min,然后置于10 cm PDA平板中央。在28°C的PDA上培养8 d。数值为三次独立实验的平均值±SD (*p< 0.05和**p< 0.01 vs.对照组,p< 0.05和##p < 0.01 vs. SB1 treatment)

eATP对sb1诱导的ROS生成的影响

如图所示。4a,添加SB1后2 h内真菌菌丝中出现2,7 -二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)检测到的绿色荧光。12 h左右荧光强度达到最大值(为对照的9.32倍)。4b). sb1诱导的绿色荧光几乎被PPADS(10µM)、RB(10µM)或apyrase (2 U/mL)完全抑制(图2)。4c)。H2O2SB1处理12 h时菌丝含量达到峰值,为17.65µmol/g鲜重(FW),是对照的2.48倍。4d)。但是H.2O2在12 h时,PPADS、RB和apyrase分别使真菌菌丝含量降低55.3%、54.7%和59.9%(图;4d).这些结果表明SB1诱导ROS生成依赖于共培养中eATP的释放。

图4
装具

eATP对sb1诱导的ROS积累的影响Shiraiasp, S9。一个2,7 -二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)染色菌丝(×400)的亮视野图像(左)和荧光显微镜(右)。b添加SB1 400细胞/mL后,S9中活性氧(ROS)的积累。c吡啶氧磷酸-6-二苯基苯基-2',4'-二磺酸(PPAD),反应性蓝(Rb)和屏桂酶对SB1诱导的ROS积累的影响dH2O2S9的内容。用10µM DCFH-DA孵育6日龄的真菌菌丝30 min。SB1处理与图中相同。1.PPAD,Rb和亚紫酶的剂量与图1中规定的剂量相同。2.值为三个独立实验的平均值±标准差(**p< 0.01 vs.控制)

eATP对sb1诱导Ca的影响2+涌入

Ca2+利用荧光细胞渗透钙指示剂fluo - 3am直接观察SB1处理后真菌菌丝的积累。添加SB1后,真菌菌丝的荧光更加绿色(图。5).在15 min内检测到增强的荧光信号,在30 min左右达到峰值(对照的2.31倍),30 min后又回落到初始对照水平(图1)。5a,b)。绿色荧光通过PPAD,RB和α酶阻断(图。5c)和细胞溶质游离钙的诱导升高在SB1加入30分钟后分别降低66.7%,61.0%和66.5%(图。5d).这些结果表明,sb1诱导的Ca2+在共培养中,内流依赖于eATP。

图5
figure5

eATP对sb1诱导Ca的影响2+涌入Shiraiasp, S9。一个荧光-3 am染色菌丝(400 ×)的亮场图像(左)和荧光显微镜(右)。bCa2+在添加SB1 400细胞/mL后,S9细胞的积累。c亮场图像(左)和荧光显微镜(右)和d结果表明,吡啶磷酸盐-6-偶氮苯基-2 ',4 ' -二磺酸(PPADS)、活性蓝(RB)和apyrase处理的荧光强度为400 ×。SB1处理与图中相同。1.PPAD,Rb和亚紫酶的剂量与图1中规定的剂量相同。2.值为三个独立实验的平均值±标准差(**p< 0.01 vs.对照组,##p < 0.01 vs. SB1 treatment)

eatp,ros和ca的依赖性2+

进一步研究sb1诱导的ROS与Ca的相互作用2+,使用维生素C(Vc,0.1mm)和NADPH氧化酶抑制剂二苯基碘碘氯(DPI,5μm)来抑制ROS生成,而CA2+螯合剂(EGTA在5 mm)和膜通道阻挡机(LA3+在2 mM处)抑制Ca2+涌入(无花果。6).当VC和DPI消除了SB1诱导的ROS时,CA没有任何显着的变化2+荧光信号及其强度(图中SB1 + Vc或+ DPI相对于SB1)。6a, b)。然而,Ca后菌丝中ROS的生成减少2+通过EGTA或LA阻止信令3+(SB1 + EGTA或+ La3+图2中的SB1。6c, d).结果表明,ROS的产生可能发生在Ca的下游2+融入到共同文化中。此外,Vc和DPI抑制ROS或阻断Ca可有效抑制共培养中eATP的产生,达到控制水平2+大量涌入的拉3+(无花果。7).而在加入SB1前用EGTA预处理只能部分降低eATP的释放。这些结果表明Ca2+内流和ROS的产生也可能有助于调节共培养中eATP的外流。

图6
figure6

一个在共培养中,维生素C (Vc)或二苯基碘氯化铵(DPI)处理的荧光-3 am染色菌丝(×400)的亮视野图像(左)和荧光显微镜(右)。bCa2+在Vc或DPI处理的S9中积累。在加入SB1(400个细胞/mL)前1小时加入Vc (0.1 mM)或DPI(5µM)。c2,7 -二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)染色菌丝经EGTA (5mm)和La处理后的亮视野图像(左)和荧光显微镜(右)3+(×400)。dH2O2EGTA或LA处理的S9的含量3+在共同文化中。EGTA(5 mm)和la3+(2 mM)在加入SB1(400细胞/mL)前1小时加入培养物。值为三个独立实验的平均值±标准差(**p< 0.01 vs.控制)

图7
figure7

sb1诱导的ATP释放及其对Ca的依赖2+和活性氧Shiraiasp, S9。SB1处理与图中相同。1.测定了维生素C (Vc)、二苯碘铵(DPI)、EGTA和La的用量3+与图中所示相同。6.数值为三个独立实验的平均值±标准差

Eatp对HA的生物合成基因表达的影响

为了研究eATP对sb1诱导HA产生的作用机制,共培养24 h后,通过qRT-PCR分析8个HA生物合成基因的表达情况(图)。8).编码多酮合酶的基因(PKS.)、FAD/ fmn依赖的氧化还原酶(时尚),单氧酶(莫诺)、多铜氧化酶(相比),O甲基转移酶(Omef)、锌指转录因子(ZFTF.)、主要推动者超级家庭(MFS)及atp结合盒转运体(美国广播公司)全部调节,约为2.45-,1.71-,1.94-,2.97-,2.53-,2.91-,2.47-和4.94倍的控制。同时,100μm的exaTP也随着Live Sb1的类似趋势增加了它们的表达。然而,在共培养的Eatp释放后通过亚戊酶水解,表达PKS.下降到控制水平,然而时尚莫诺Omef美国广播公司表达下调(4.52-6.66倍)。

图8
figure8

eATP对血凝素A生物合成基因表达的影响Shiraiasp, S9。共培养方法与图1中规定的方法相同。1.外源ATP (exATP)和apyrase处理及其浓度与图中相同。2.将培养物保持在含有50ml液体培养基的150ml烧瓶中,在150rpm和28℃下保持8天。值是来自三个独立实验的平均值±SD(*p< 0.05和**p< 0.01 vs.控制)

进一步研究Eatp,ROS和CA的影响2+在共培养的HA生物合成中,外源性供体(exATP, H2O2和Ca2+)或特异性抑制剂(RB、Vc、La)3+)(图。9).在100µM处加入外泌atp后,H2O2在1mm或Ca2+2 g/L处理24 h后,转录水平显著升高PKS.(145.2-453.1%),时尚(111.6 - -166.9%),MFS(23.0-160.8%)和Omef(165.6 ~ 228.9%)。另一方面,Ca后活性SB1诱导的这些基因表达增强被抑制2+La阻断了ROS、eATP信号通路3+分别为SB1 + La3++ Vc或+ RB相对于SB1。9).同时,SB1、exATP、H2O2和Ca2+治疗,分别(图。10.).SB1和exATP分别使发酵液中HA的释放量提高了154.7%和183.0%。然而,La显著降低了细胞内和细胞外HA的产生3+,共同培养的VC或RB(SB1 + LA3++ Vc或+ RB相对于SB1。10.).综上所述,这些结果强烈表明sb1诱导的HA生物合成是由eATP、ROS和Ca介导的2+信号。

图9
figure9

SB1,外源ATP(EXATP),CA的效果2+和H2O2HA生物合成基因的表达。SB1和ATP处理与图中相同。2.H2O2在1mm和Ca2+(CaCl2),在7日龄培养第6天添加2 g/L。La的剂量3+,维生素C(Vc)和反应性蓝(Rb)与如图1和2中提到的规定的相同。56.培养在150-mL烧瓶中,含50 mL液体培养基,转速为150 rpm,温度为28℃,培养7天。数值为三个独立实验的平均值±标准差。条形图上方不同的字母表示显著差异(p< 0.05)

图10
图10

SB1、ATP、Ca的影响2+和H2O2HA (hypocrellin A)的产生Shiraiasp, S9。SB1和ATP处理与图中相同。7.H2O2在1mm和Ca2+(CaCl2), 2 g/L。La的剂量3+,维生素C(Vc)和反应性蓝(Rb)与图1和2中规定的相同。56.将培养物保持在含有50ml液体培养基的150ml烧瓶中,在150rpm和28℃下保持8天。值是来自三个独立实验的平均值±SD(*p< 0.05和**p< 0.01 vs.对照组,p< 0.05和##p < 0.01 vs. SB1 treatment)

讨论

eATP已被认为是一种重要的信号分子,影响植物和动物等多细胞生物的广泛生物过程[1].最近的研究表明,细菌、酵母和真菌也能将ATP释放到胞外隔间或培养基中。Ivanova等人(2006)的一份早期报告显示,一些革兰氏阴性α-proteobacteria和γ-proteobacteria可以从微摩尔到毫摩尔浓度释放eATP [29].一些肠球菌在培养上清液中1-3µM可分泌eATP,但两株细菌(大肠杆菌金黄色葡萄球菌)未能显示eATP分泌[30.].发现吃过的食品依赖于细菌糖酵解,呼吸和生长阶段[831].虽然有报道称牙周相关细菌或肠道内的共生细菌释放的eATP参与牙周或肠道炎症[11.32细菌Eatp的目的和重要性仍然很差。真菌如白色念珠菌和酵母酿酒酵母发现在葡萄糖存在的情况下会分泌ATP [33]或针对治疗抗真菌唾液组织汀[34].eATP从酿酒酵母在生长过程中升高,并作为细胞间信号诱导和同步酵母孢子生成[35].Medina-Castellanos等。(2014; 2018)展示了丝状真菌t . atroviride能通过eATP调控创伤反应、分生和菌丝再生[1213].在这项研究中,我们发现Eatp被释放在甘露出的真菌的共同培养中Shiraiasp. S9和子实体相关细菌p .叶在4小时期间Sb1至146-378nm,并通过在2u / ml中加入αU/ ml的α酶来完全抑制ATP的水解(图。1d).这些结果表明eATP的产生是由共培养引起的。这是首次报道真菌-细菌共培养产生eATP。

在我们的研究中,BBE、BPS和DB处理在真菌培养中没有表现出诱导eATP产生的能力(图。1e).活菌和无菌培养液对真菌的影响Arthrinium出口的。SacCharicola.研究[36].真菌的生长受到活菌的抑制Pseudoalteromonas piscida而细菌的无细胞培养液诱导了真菌代谢产物谱的变化,提高了真菌的抗菌活性。由细菌产生的信号分子可能有助于增强真菌的生物活性。此外,Schroeckh et al.(2009)证明了亲密的身体接触曲霉属真菌nidulans美国hygroscopicus在共培养中需要诱导沉默的聚酮代谢曲霉属真菌27].这些结果支持来自细菌的扩散信号分子和细菌亲密接触在共培养过程中都有生理作用。在本研究中,FBE和FPS也没有诱导细菌培养中eATP的产生(图。1f),表明活的细菌和真菌是eATP分泌到培养基中所必需的。在我们之前关于共培养的研究中Shiraiasp。S9和p .叶SB1 [20.的直接物理接触和菌丝的碎裂Shiraia观察到S9 sp。在植物中,在食草性、机械损伤或病原体攻击时,吃atp充当潮湿信号[5].在受损菌丝中也发现了eATP水平的增加t . atroviride用手术刀[12].因此,需要进一步的研究来验证EATP是否是与共同培养中的亲密细菌 - 真菌相互作用相关的潮湿信号。

在本研究中,与细菌SB1共培养后真菌分生孢子被激活(图。3.C)。分枝胞的浓度从3.47×10增加7到5.16 × 107鼻子处理后孢子/板(300μm)(图。3.b).在共培养中,sb1诱导的真菌分生完全被核苷酸受体拮抗剂(PPADS和RB在10µM)和ATP水解酶(apyrase在2 U/mL)阻断(图2)。3.c).这些结果与在t . atroviride以回应被手术刀造成的机械损伤[1213].我们的结果表明,外atp (10-300 μ M)显著促进PDA板中HA的分泌(图。2a)和HA在摇瓶中的产量(图。2b).此外,图中还观察到核苷酸受体拮抗剂RB或ATP水解酶apyrase对活菌诱导的HA产生的抑制。2c.因此,综上所述,我们的结果表明eATP受体的存在以及eATP对共培养真菌分生和HA生物合成的调节作用。

我们的研究表明RB、PPADS和apyrase可以有效阻断真菌ROS的产生(图)。4c, d).结果表明,eATP是ROS介导对活菌反应的关键信号。根据eATP释放的时间过程(图。1d)和H2O2生产(图。4d), SB1菌诱导的eATP峰值较h提前(4 h)2O2生产(12小时)。然而,DPI (NADPH氧化酶抑制剂)和VC (ROS清除剂)对共培养中eATP的完全抑制表明,ROS的产生也影响了eATP的水平(图)。7).在我们以前的研究中,已经诱导ROS生成介绍了非生物节食的HA生产的增强,包括超声刺激[18, Triton X-100治疗[24]及光/暗照射[17].虽然我们目前的结果还不足以确定eATP在共培养中是否作为ROS的上游或下游信号,但eATP和ROS是参与共培养代谢产物产生的必要信号分子Shiraia在引出。

植物和动物细胞有能力通过激活受体来触发细胞内钙的短暂增加来检测eATP2+作为伤害的主要“危险”信号[5和炎症过程[3.].ATP激活P2X和P2Y嘌呤能受体引发了细胞内Ca的短暂增加2+通过促进细胞外钙2+内流或内质网Ca2+神经分化中的释放[37].在拟南芥, DORN1,一个凝集素受体激酶与atp高亲和力结合,并需要诱导细胞内钙2+6].我们的数据显示了细胞内CA的累积2+(无花果。5)。应用核苷酸受体拮抗剂(PPADS或RB)可完全抑制sb1激活的Ca2+积累(图。5d),表明Eatp在CA中的调节作用2+积累。而释放的eATP则被Ca完全阻断2+膜通道阻挡者洛杉矶3+Ca显著降低2+螯合剂(无花果。7).虽然发现了eATP产生的强烈的钙依赖性,但目前的证据仍然不足以得出明确的结论,即eATP分泌是钙的下游2+融入共同文化,反之亦然。此外,Song et al.(2006)报道eATP诱导超氧化物的积累依赖于胞质钙2+浓度拟南芥38].ROS也介导胞质钙2+通过激活质膜超极化激活的Ca2+流入渠道(39].在本研究中,我们发现Vc或DPI抑制ROS生成并不影响Ca2+积累(图。6a),但螯合或块的CA2+在共培养中显着降低ROS生产(图。6c, d)。这些结果表明,ROS的产生可能发生在钙的下游2+流入共培养(图。11.).在Shiraiasp。SLF14,CA的转录水平2+sensor-encoding基因(凸轮可以, 和crz1)和生物合成基因(繁荣正义党omef.羟化酶)对HA的表达上调2+感应(23].在本研究中,HA生物合成基因(PKS.时尚, 和莫诺)在共培养或外泌atp 100µM时显著上调(图。8).在eATP或Ca的阻断下,共培养中HA生物合成基因的表达和HA积累均明显受到抑制2+RB或La的信号传导3+, Vc对ROS的清除作用(图。910.).这些结果表明,eATP可以作为Ca的信号信息2+-介导的信号转导导致共培养中HA的生物合成(图。11.).

图11
figure11

假设的细胞外ATP (eATP)信号通路导致HA的生物合成Shiraiasp。S9和Pseudomonas Fulva.SB1(ROS,反应性氧物种; NOx,NADPH氧化酶)

结论

我们证明了瞬时ATP释放是真菌宿主反应的早期事件Shiraiasp. S9与子实体相关的细菌p .叶SB1。eATP信号对RB和PPADS敏感,可能是细菌与真菌密切相互作用的DAMP信号。eATP与Ca紧密相连2+内流和ROS的产生成为真菌孢子活化和诱导HA生产的一个重要的早期事件。这些小分子信号可能有助于细菌-真菌之间的通讯,从而导致HA生物合成基因的转录诱导。据我们所知,这项研究是第一个证明细菌和真菌相互作用提高eATP的研究。这些发现增加了我们对eATP在微生物中的信号作用和密切的细菌-真菌相互作用的理解,以发展共同培养策略生产所需的真菌代谢物。

材料和方法

菌株、培养基和培养条件

Shiraiasp. S9和细菌p .叶SB1从新鲜中分离得到Shiraia我们以前的工作中的结果尸体[20.],保存于中国普通微生物培养收集中心(注册为CGMCC16369和CGMCC 13931)。SB1在4°C的Luria-Bertani (LB)斜(pH7.2)中储存,并在37°C的培养皿中LB培养基上初始生长2天。S9在4°C倾斜的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上保存,并在28°C的培养皿中PDA培养基上初始生长10天。作为预培养,改性液体培养基50 ml(马铃薯100 g/L,淀粉20 g/L,纳米4 g/L)3., 1.5 g/L KH2阿宝4, 0.5 g/L碳酸钙3.和0.01 g/L VB1, pH 6.3)接种107使用孢子/ mL。将预培养物在28℃下保持2天,摇动为150rpm,然后在150rpm和28℃下将(1ml)转移到含有50ml相同液体培养基的150ml烧瓶中8天。

共培养的Shiraiasp。S9和p .叶SB1

如前所述,在PDA平板上进行真菌-细菌共培养[20.].S9菌株最初在PDA上28°C培养8天。一小片S9 (5mm × 5mm)置于PDA平板(10cm)中央,28°C黑暗孵育4天。然后,将10µL的SB1悬液(共培养)或新鲜无菌LB肉汤(对照)在两条平行的直线上划线,彼此相距约7厘米(图)。1a).建立共同培养Shiraia在6天培养的菌丝培养基中加入400细胞/mL的活SB1,并保持在150 rpm和28°C [20.].

激发子和抑制剂溶液的制备

为了确定共培养中eATP的来源,我们使用细菌SB1或真菌菌株S9的提取物作为诱导剂,诱导从培养中释放eATP。12,000 rpm离心10 min, 12 h后收获细菌细胞(SB1)和培养液。用三倍体积的乙酸乙酯提取上清液,再用乙醇溶解为细菌肉汤提取物(BBE)。SB1粗多糖(BPS)是根据我们前面描述的方法制备的[20.].制备真菌提取物时,从6日龄的菌丝培养物中收集培养液,用400目滤膜过滤(中国天津东康),用3倍体积的95%乙醇提取。收集沉淀并透析去除小分子(< 3500 Da),最后冻干得到真菌多糖(FPS)。将培养液的乙酸乙酯萃取物真空蒸发,得到残渣(FBE)。

分别在6日龄的真菌S9培养物中加入活SB1 (B, 400 cells/mL)、蒸压SB1悬液(DB, 400 cells/mL)、BPS (100 mg/L)和BBE (100 mg/L),测定细菌诱导S9培养物中eATP的变化。将FPS (100 mg/L)、FBE (100 mg/L)和标准HA (5 mg/mL)加入到活SB1 (400 cells/mL)中,50 mL摇瓶中加入10 mL改性液体培养基,测定细菌培养中eATP的变化。处理1 h后检测eATP浓度。

为了确定细菌SB1诱导对eATP的依赖性,在培养物上应用了一些特异性拮抗剂,即RB(原叶生物技术)。,Shanghai, China) at 10 µM as an inhibitor of eATP signal transduction across the plasma membrane, PPADS (Abcam, Cambridge, MA, USA) at 10 µM as the purinoceptor inhibitor, and apyrase (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) at 2 U/mL as an enzyme for hydrolyzing ATP. These inhibitors and their dosages were chosen based on previous studies [4041].在加入SB1之前在1小时将抑制剂加入到培养物中。在100μm的菌丝菌培养物中,在菌丝培养物中,以100μm,以及两种水解的ATP衍生物,ADP和AMP,ADP和AMP的含有ATP,ATPγs(Sigma-Aldrich,St Louis,Mo,USA)进行了另外的对照实验)在100μm时,以确定ATP水解对诱导的影响。

细胞外ATP的检测

使用荧光素-荧光素酶ATP检测试剂盒(Beyotime Biotech)用荧光法测定eATP浓度。据Wu等人报道[41].在选定的时间间隔从每个摇瓶中收集发酵液(500µL),用GloMax 20/20发光仪(Promega, USA)进行亮度测量。

ROS生成检测

在菌丝中产生ROSShiraia用DCFH-DA (Beyotime Biotech)检测S9。,H一个imen, Jiangsu, China) under the fluorescence microscopy (BX51, Olympus, Tokyo, Japan) with excitation wavelength at 480 nm and emission wavelength at 520 nm [42].过氧化氢(H2O2)的测量方法如前所述[43].为了分析ROS在共培养中的信号转导作用,在共培养中加入SB1前1 h加入0.1 mM Vc或5µM DPI。

细胞内钙含量测定2+

细胞内钙的变化2+用Ca2+-敏感探针Fluo-3-AM中国江苏海门)。真菌微球在含0.2 mM CaCl的PBS中4°C孵育2小时2和5μmfluo-3-am [40].随后,将微球在真菌培养基中再培养2 h,然后进行各种处理。处理后采集微球,用荧光显微镜(BX51, Olympus, Tokyo, Japan)拍摄,激发波长为480 nm,发射波长为515 nm。荧光强度的整合定义为细胞内相对Ca2+浓度水平(40].Ca2+螯合剂EGTA在5毫米和膜通道阻挡者LA3+(LaCl3.),以确定Ca的信号传导作用2+在共同文化中[41].在加入培养物中加入1小时抑制剂。

分生孢子和HA产量的定量分析

在无菌水中采集分生孢子,用血球计进行定量。细胞内和细胞外HA是根据我们之前的报告提取的[24].采用反相Agilent 1260高效液相色谱系统(Agilent Co., Wilmington, DE, USA),采用Agilent HC-C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm)。以真标准定量(中国国家大院图书馆,中国上海)。

实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)分析

HA生物合成相关基因的引物序列和18S核糖体RNA作为内部参考基因列入额外的文件1S1:表。qRT-PCR方法参照我们之前的研究[44].利用2 . 2周期阈值计算基因的转录表达水平CTZhang等人所描述的方法[45].

统计分析

学生们t-检验为显著性检验,比较两组均数。采用单因素方差分析(ANOVA)评估多组间均数差异的显著性。所有结果均以均数±标准差(SD)表示。显著性水平设为p< 0.05。

数据和材料的可用性

本研究期间产生或分析的所有数据均包含在本文及其附加文件中。

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致谢

不适用。

资金

国家自然科学基金项目(no . 82073955, no . 81773696);江苏高等学校重点学科建设项目(no . PAPD)。关键词:岩石力学,数值模拟,数值模拟

作者信息

从属关系

作者

贡献

JWW和XPL构思并参与了研究的设计。XPL、LLZ、YHG进行了实验和数据分析。JWW和XPL起草了手稿。JWW指导了研究并对论文进行了修改。所有作者都对结果进行了讨论和评论。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

通讯作者

对应到剑王温

道德声明

伦理批准和同意参与

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同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

额外的信息

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施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

补充信息

附加文件1:表S1。

内参及靶基因的引物及相关信息。F:正向引物,R:反向引物。

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李晓平,周丽丽,郭玉华et al。细胞外ATP在共培养中的信号传导作用Shiraiasp。S9和Pseudomonas Fulva.SB1用于提高羟色氨苄A的产量。MicroB细胞事实20.144(2021)。https://doi.org/10.1186/s12934-021-01637-9

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关键字

  • Shiraia
  • Pseudomonas Fulva.SB1
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