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一种新的二聚体LL37变种的设计和异体表达GydF4y2BaPichia Pastoris.GydF4y2Ba

抽象的GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

抗微生物肽L137由白细胞(主要是中性粒细胞)和各种上皮细胞产生,并且具有参与免疫调节的突出优势,引起免疫细胞的趋化性和促进伤口愈合。然而,LL37的中心域需要在抗微生物活性方面得到改善。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

本研究采用氨基酸替代法提高LL37活性中心的抑菌活性,并选择具有更好选择指标的二聚体设计。选择一个柔性链接器并与6 × His-SUMO标签相结合,成功表达LGGydF4y2BaPichia Pastoris.GydF4y2Ba作为主人。通过破坏细菌的细胞膜但具有低溶血活性,重组Lg显示出强抗微生物活性。另外,与单体肽FR相比,RLG具有改善耐受盐离子的能力。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

本研究为微生物系统中改性放大器的生产及其在工业生产中的应用提供了新的思路。GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

在畜牧业生产中滥用和过度使用抗生素导致耐药菌株出现的同时,其残留问题也对乳制品和肉制品的安全产生不利影响,并威胁人类健康[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba].随着研究的逐步深入,抗菌肽(AMPs)具有广谱抗菌的特点和独特的作用机制,可以避免传统抗生素在畜牧业中的负面影响,因此具有很大的潜力成为一种新的饲料添加剂[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba].LL37是人类抗菌肽家族的唯一成员,由白细胞(主要是中性粒细胞)和各种上皮细胞产生,广泛存在于各种人体组织和体液中[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba].由于其突出的参与免疫调节,免疫引起细胞趋化,促进伤口愈合的优势,LL37一直保持在近几年高的研究兴趣[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba].此外,它还显示对许多类型的病原体的防御,包括细菌,真菌,病毒,寄生虫和甚至癌细胞[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba].一系列的研究表明,残基17-29的螺旋结构区域是为LL37的生物学功能[密钥域GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba].为了进一步改善该结构域的生物活性,已经采用了几种策略,例如氨基酸取代和序列杂交。Tan等人。用FV7杂交这个域(FRIRVRV-NHGydF4y2Ba2GydF4y2Ba),其有效增强其抗微生物活性[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

目前,获得改性安培的方法主要取决于化学合成方法,合成的高成本大大限制了其在畜牧业生产中的应用[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba].利用微生物重组表达修饰的amp似乎是克服这一障碍的可行手段。真核生物,GydF4y2BaPichia Pastoris.GydF4y2Ba,甲基脱发酵母,具有后期加工和修饰的优点,可以将产生的异源蛋白质分泌到培养基中,这还促进了后期重组蛋白的分离和纯化[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba].此外,靶基因可以与酵母基因组直接集成,这有助于稳定靶蛋白的表达[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba].然而,改性的安培通常具有小分子量的特点,并且微生物蛋白酶容易降解,这使得微生物系统中重组改性肽的表达更具攻击性[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba].AMPS反复表达的融合或串联表达为该问题提供了解决方案。融合接头肽策略可以为融合蛋白提供其他优点,例如改善生物活性和扩增表达产量[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba].通常,接头被分成两类:柔性接头和刚性连接基[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba].然而,在融合蛋白的设计中,连接肽的选择并不是固定的。Fan和同事的研究结果表明,与其他连接子相比,刚性连接子可以显著改善融合蛋白VRT的自然结构和生物活性[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba].Zhang等人发现,在连接两种酶(FDH和LeuDH)时,F-R-L(刚性连接剂)可以独立折叠并保证结构稳定,而F-S-L(柔性连接剂)由于结构域的紧密性,获得了最佳的辅因子通道效应[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba].因此,接头的理性设计起到保证蛋白质的生物活性的重要作用。GydF4y2Ba

本研究替换LL37活性中心的特异性氨基酸,以提高其抗菌活性。为进一步提高该修饰肽的抗菌活性,促进其在大肠杆菌中的重组表达GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Ba,本研究评估三种设计(直接连接、刚性连接和柔性连接)对形成的二聚体的抗菌活性和溶血毒性的影响。希望这种串联表达策略能为微生物系统中修饰amp的生产以及修饰amp在工业生产中的应用提供新的思路。GydF4y2Ba

结果和讨论GydF4y2Ba

肽的抗微生物活性和溶血活性GydF4y2Ba

抗菌活性如表所示GydF4y2Ba1GydF4y2Ba.与FD(FKRIVQRIKDFLR)相比,通过用精氨酸(R)用精氨酸(R)代替天冬氨酸(D)而获得的FR(Fkrivqrikrflr)的抗微生物活性显着改善。Wang等人。指出,安培的阳离子是影响安培抗微生物活性的重要参数[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba].AMPS的正电荷可以在微生物细胞表面上静电地与带负电的组分相互作用,导致细胞膜渗透性和细胞死亡的干扰[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba].赖氨酸(K),R和组氨酸(H)的存在是AMPS带正电荷的原因。h是一种易受环境影响的两亲分离氨基酸。由H组成的AMPS通常不如由抗微生物活性组成的AMPS,因此H不常用于AMPS修饰的研究中,而K和R在AMPS的分子设计中很常见。尽管K和R具有相同的电荷,但含有R的AMPS通常比不同放大器中的k和r的数量保持相同的抗微生物活性而含有k的安培。这可能是由于它们不同的膜结合特性。R侧链中的胍基团具有与细胞膜的双层磷脂建立强氢键的显着能力,而K的侧链只能与单一脂质头组相互作用[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba].一旦进入细胞,就含R肽的DNA肽似乎高于含K肽的亲和力[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba].因此,在本研究中,为了提高FD,氨基酸r为优先选择以替换原始氨基酸D.此外,先前的研究已经表明,在一定范围内,在总阳离子的增加的抗微生物活性负责省级机构将显著增强肽的抗菌能力[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba].与此类似研究中,龚等人的结果。replaced the uncharged alanine (A) in DRP-AC4b with K, and the number of charges increased from + 3 to + 4, thereby reducing the MIC value from 21.53 to 14.49 μM [30.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

表1肽的麦克风(μm)值GydF4y2Ba

修改后的AMP FR包含13种氨基酸,有一个小的分子量(kDa的1.76),这导致其与重组表达的分离,纯化和鉴定很大的困难的特性。为了克服这些障碍,融合两个区一起,形成一个新的二聚体蛋白可能是一个不错的选择的方法。Wang和同事连接PMAP-36以反并联的方式形成二聚体(PMAP-36)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba并发现(PMAP-36)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba体外对革兰氏-和革兰氏+菌有较强的耐药性,未表现出溶血活性[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba].然而,在本研究中,融合蛋白(FR)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba通过直接连接获得的抗菌活性最高,毒性最强(见表)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba和图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba).在最高肽浓度(128 μM)时,(FR)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba可能会破坏血细胞的大约43%,因此,其在产品应用安全性不能被保证(图GydF4y2Ba1GydF4y2Ba).因此,一个合适的连接肽对于所需的功能是必不可少的。刚性连接子通常在蛋白质结构域之间保持一定的距离,防止结构域之间的不良相互作用[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba].相反,柔性接头肽富含氨基酸,例如甘氨酸(G)和丝氨酸,其通常会增加结构域的柔韧性并改善融合蛋白的折叠[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33GydF4y2Ba].在这项研究中,由柔性接头肽GGGGS形成的LG(Fkrivqrikrflrggggggsfkrivqrikrflr)优于由抗微生物活性和毒性(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba和图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba).GydF4y2Ba

图。1GydF4y2Ba
图1GydF4y2Ba

多肽对人红细胞的溶血活性测定GydF4y2Ba

三种设计((FR)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba,LG和La)具有相同数量的正支,但表现出完全不同的抗微生物和溶血活性,这可能是由于疏水性的影响。疏水性影响肽分配到脂质双层中的能力,可以与效力和宿主细胞毒性直接相关[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba].因此,疏水性是影响安培的生物活性的另一个关键指标。在最佳范围之外的疏水性增加或减少可能导致抗微生物活性的降低和血细胞裂解的增加[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36GydF4y2Ba].陈等。使用亮氨酸(L)和A来改变抗微生物肽V13K的疏水性GydF4y2BaL.GydF4y2Ba并且发现随着疏水值的增加,溶血活性也增加,并且当疏水值适当时,它显示出最佳的抗微生物活性[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba].本研究以“选择指数”作为选择靶标amp的依据。如表所示GydF4y2Ba2GydF4y2Ba, LG的选择指数最高,因此被选为下一步研究的目标肽。与本研究结果类似,Baghbeheshti等人测定了肽对四种革兰氏菌的MIC值,包括GydF4y2Ba假单胞菌铜绿假单胞菌GydF4y2Ba(GydF4y2Ba铜绿假单胞菌GydF4y2Ba)ATCC 27853,GydF4y2Ba埃斯克里希亚洲GydF4y2Ba科利GydF4y2Ba(GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba)ATCC 25922,抗生素抗性GydF4y2Ba铜绿假单胞菌GydF4y2Ba和GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba结果发现,由柔性连接子组成的S3-4 mer-GS的抗菌活性比由刚性连接子组成的S3-4 mer-DP的抗菌活性高25% [GydF4y2Ba21GydF4y2Ba].此外,Dipti等人。发现通过柔性接头连接的R-HCV-F-MEP可以实现更高水平的蛋白质表达GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba比r-HCV-R-MEP(具有刚性连接)[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

表2肽的MHC(μm),gm(μm)和Si值GydF4y2Ba

将靶基因与靶基因集成GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Ba6 × His-SUMO-LG基因的表达GydF4y2Ba

朱和他的同事的研究结果表明,表达产物GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Ba比表达产物更好的性能和免疫效应GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba].到目前为止,GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Ba已成功用于生产amp(如TH2-3)、酶制剂(如木聚糖酶)和疫苗(如PpSP15) [GydF4y2Ba39GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba那GydF4y2Ba41GydF4y2Ba].因此,这项研究选择了GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Ba作为LG的生产工厂。GydF4y2Ba

为了避免细胞蛋白酶的LG降解并简化分离和纯化过程,考虑标签伴侣用于Lg重组表达的方法。6×HIS标签可以特异性结合相应的抗HIS标签抗体,并且6×他的标签可以与Ni-NTA进行亲和层析,这使得重组蛋白的鉴定和纯化过程非常方便。此外,Sumo标签具有促进蛋白质的正确折叠和可溶性表达的优点[GydF4y2Ba42GydF4y2Ba].在这项研究中,GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Ba构建表达载体pPICZαA-6 × His-SUMO-LG,其中包含密码子优化后的6 × His-SUMO标签和LG基因(附加文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S1A)。其他文件中的结果GydF4y2Ba1GydF4y2Ba图S1B显示pPICZαA-6 × His-SUMO-LG基因成功整合到基因组GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Bax 33。将获得的阳性克隆进行发酵,并对发酵上清进行Tricine-SDS-PAGE和Western blotting分析。如图所示。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa和附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:图S2与空质粒ppiczaa的发酵上清相比,6×HIS-SUMO-LG的发酵上清液在14.4和20.1kDa之间具有特定带。在蛋白质印迹测定中,特定蛋白质可以与抗HIS标签抗体结合(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab和附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba:图S3)。此外,带的大小与理论尺寸(16.22 kDa)基本一致。根据以上结果,初步确定目标蛋白6 × hiso - sumo - lg已成功表达。GydF4y2Ba

图2GydF4y2Ba
图2.GydF4y2Ba

融合蛋白的表达鉴定GydF4y2BaPichia Pastoris.GydF4y2BaX33。GydF4y2Ba一种GydF4y2BaTricine-SDS-PAGE检测融合蛋白的表达GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2BaX33GydF4y2Ba.GydF4y2Ba泳道1:在空载体pPICZαA的蛋白质表达GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2BaX33;通道2:低范围预染色蛋白标记物;Lanes 3-6: pPICZαA-6 × His-SUMO-LG蛋白在大肠杆菌中的表达GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2BaX33。GydF4y2BaB.GydF4y2BaWestern Blotting检测融合蛋白的表达GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2BaX33GydF4y2Ba.GydF4y2Ba通道1:低范围预染色蛋白标记物;泳道2-5:6×HIS-SUMO-LG的蛋白质表达GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2BaX33GydF4y2Ba

时间、甲醇浓度和培养基pH对总蛋白得率的影响GydF4y2Ba

如图所示。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaA,总蛋白质表达水平随着发酵时间的延伸而逐渐增加,并在诱导发酵后在96小时内达到峰(154.8mg / L),以及湿重GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Ba继续增加至96小时。这可能如下所述:营养消耗,虽然是GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Ba微生物细胞仍在生长,它们已经处于老化状态,它们分泌蛋白质的能力已经下降[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba].此外,有报道称,复杂的代谢物GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Ba可能分泌可以部分降解异源蛋白的酶[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba].上述原因导致诱导后选择96小时,作为本研究的最佳诱导时间点。GydF4y2Ba

图3.GydF4y2Ba
图3.GydF4y2Ba

影响蛋白质表达水平的因素。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba时间对总蛋白质和细胞湿重量的影响GydF4y2Ba巴斯德毕赤酵母。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba甲醇浓度对总蛋白质产量和细胞湿重的影响GydF4y2Ba巴斯德毕赤酵母。GydF4y2BaCGydF4y2Ba总蛋白和细胞的湿重的产率培养基pH值的影响GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Ba

甲醇是主要的碳源和基因表达诱导GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Ba,其浓度与蛋白表达水平直接相关[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba].研究表明,产生重组蛋白所需的甲醇浓度至少为0.5%[GydF4y2Ba46GydF4y2Ba].在探究不同甲醇浓度对蛋白表达水平的影响时,结果发现随着甲醇浓度的增加,蛋白表达水平和蛋白的湿重GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Ba增加,直到甲醇浓度达到最大3%,然后开始减少(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaB).未经甲醇诱导的发酵液表达量最低,细胞质量最低,这也说明了添加甲醇的重要性。高浓度的甲醇会引起甲醛和过氧化氢的积累,对其有毒性作用GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Ba微生物细胞,从而降低它们的表达[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba].因此,有必要在发酵过程中确定甲醇水平以促进细胞生长并增加表达,同时避免甲醇毒性。GydF4y2Ba

将培养基的初始pH可影响宿主细胞的生长状态,从而影响总蛋白的表达水平。与其它的pH值,当培养基的初始pH为7.0相比,总蛋白质表达和宿主细胞的湿重达到最高水平(图GydF4y2Ba3.GydF4y2BaC)。因此,当培养基的初始pH为7.0时,用3%甲醇诱导后96小时是蛋白质表达的最佳条件。GydF4y2Ba

纯化6×HIS-SUMO-LG融合蛋白GydF4y2Ba

收集3%甲醇的96小时后的发酵上清液并将其与Ni-NTA树脂柱合并纯化6×HIS-SUMO-LG融合蛋白。数字GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa和附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:图S4显示6×HIS-SUMO-LG融合蛋白几乎完全与Ni-NTA树脂柱结合。当咪唑的洗脱缓冲液浓度为50mm时,6×HIS-SUMO-LG融合蛋白的振荡开始。当咪唑的洗脱缓冲浓度为80mm和150mm时,达到6倍的最大收率,并且当洗脱缓冲液达到250mM咪唑时获得具有最高纯度的融合蛋白。为了促进随后的研究,选择250mM咪唑作为最佳洗脱浓度,但这无疑导致重组蛋白的损失。用250mM咪唑洗脱后,6×HIS-SUMO-LG的产率约为28.63mg / L.GydF4y2Ba

图4.GydF4y2Ba
图4.GydF4y2Ba

纯化6×HIS-SUMO-LG融合蛋白和RLG。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba亲和层析纯化6 × His-SUMO-LG融合蛋白,Tricine-SDS-PAGE检测。通道1:低范围预染色蛋白标记物;2道:发酵上清;泳道3:可穿透尖端;Lanes 4-8:发酵上清用10 mM、50 mM、80 mM、150 mM、250 mM咪唑洗脱。GydF4y2BaB.GydF4y2BaSUMO蛋白酶切割的6倍HIS-SUMO-LG蛋白的​​TRICINE-SDS-PAGE分析。通道1:低范围预染色蛋白标记物;泳道2:6×他的sumo-lg没有切割;泳道3:6×他的sumo-lg由Sumo蛋白酶切割。GydF4y2BaCGydF4y2BarLG的Tricine-SDS-PAGE分析。通道1:低范围预染色蛋白标记物;巷2:针对激光。GydF4y2BaD.GydF4y2Ba纯化rLG的MALDI-TOF质谱GydF4y2Ba

6 × His-SUMO-LG的裂解及重组LG (rLG)的纯化GydF4y2Ba

In the Tricine-SDS-PAGE assay, the collected recombinant protein 6 × His-SUMO-LG was successfully cleaved by SUMO protease, and rLG was displayed at approximately 6 kDa (Fig.4.GydF4y2BaB,图GydF4y2Ba4.GydF4y2BaC,附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba:图S5和附加文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba:图S6)。据报道,由于富含疏水性氨基酸和正电荷,AMPS以高浓度形成低聚结构。因此,在SDS-PAGE分析中先前证明了表观分子量为理论分子量的2-4倍的现象[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba].这可能是RLG的表观分子量与理论分子量(3817.69A)之间的差异的原因。使用MALDI-TOF分析来进一步确定RLG的实际尺寸,结果表明,RLG的分子量为3816.29Da,其与3817.69Da的理论值一致(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bad)。纯化的肽RLG的产量为4.32毫克/升用的85.01%的纯度(附加文件GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba:图S7)。因此,成功地获得了一种生产和纯化RLG的方法GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Ba.GydF4y2Ba

本实验采用Ni-NTA两步法亲和层析完成融合蛋白的纯化和消化后重组蛋白的分离。这种纯化方法往往能获得纯度较高的重组蛋白,因此被广泛应用于各种表达系统中。当Zhang等人使用GydF4y2Ba枯草芽孢杆菌GydF4y2Ba经两步Ni-NTA亲和层析纯化,T9W纯度为> 93% [GydF4y2Ba49GydF4y2Ba].在本研究中,6 × His-SUMO-LG融合蛋白经SUMO蛋白酶裂解,镍柱纯化后,rLG回收率约为64%。GydF4y2Ba

RLG的抗微生物和溶血活性GydF4y2Ba

相扑标记的另一个突出的优点是其相应的相扑蛋白酶能具体地认识相扑的三级结构,减少靶蛋白的融合蛋白在相扑bisglycine终端,从而确保没有目标蛋白质的氨基酸残基的氨基端(GydF4y2Ba50GydF4y2Ba].然而,大多数的蛋白酶识别的氨基酸序列,以除去融合标记。例如,当TEV蛋白酶除去其相应的亲和标记物,它会导致S或G残基保持在所述目标蛋白的末端,其可影响目标蛋白的生物活性[GydF4y2Ba51GydF4y2Ba].在本研究中,纯化的rLG对革兰氏-菌和革兰氏+菌均有较强的抑菌活性,且与化学合成的LG的抑菌活性无显著差异(表)GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba).此外,在最高肽浓度(128 μM)下,rLG仅能导致约23%的血细胞破裂,显著低于蜂毒蛋白(91%)(图2)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba).GydF4y2Ba

表3中的MIC(μM)重组和合成LG的值GydF4y2Ba
图5.GydF4y2Ba
图5.GydF4y2Ba

RLG对人红细胞的溶血活性测定GydF4y2Ba

盐离子对rLG抗菌活性的影响GydF4y2Ba

为了评估生理浓度盐离子对AMPS抗微生物活性的影响,该研究确定了不同盐离子溶液中二聚体肽RLG和单体肽FR的MIC。如表所示GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba, NaGydF4y2Ba+GydF4y2Ba、镁GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba和加利福尼亚州GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba离子对单体肽Fr的抗微生物活性产生了更大的影响,并且NaGydF4y2Ba+GydF4y2Ba和加利福尼亚州GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba甚至导致FR失去抗菌活性。二聚体rLG在存在GGGGS的情况下仍能保持良好的活性GydF4y2Ba+GydF4y2Ba和米格GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba离子解决方案。盐离子的存在使单体肽FR的MIC值提高了2.44倍,而二聚体rLG的MIC值仅提高了1.81倍。结果表明,由连接子GGGGS得到的二聚体rLG比单体肽FR具有更好的盐离子稳定性。GydF4y2Ba

表4多肽的MIC值(µM)GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaATCC 25922在生理盐的存在下GydF4y2Ba

rLG的作用机理GydF4y2Ba

最传统抗生素通过抑制细菌细胞壁或DNA的合成而发挥抗微生物作用,所以细菌是可能发展为通过突变抗性[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba].然而,AMPS通常表现出独特的膜破坏机制,并且细菌难以为它们产生抗性[GydF4y2Ba52GydF4y2Ba].带正电的AMPs氨基酸帮助它们与带负电的细菌膜结合,穿透细胞壁,并在质膜表面平行聚集。随着AMPs在质膜上积累,它们形成通道,导致质膜的渗透和破坏,细菌内容物的泄漏,最终导致微生物细胞的死亡[GydF4y2Ba53GydF4y2Ba].在本研究中也得到了类似的结果。GydF4y2Ba

小分子疏水荧光染料1-GydF4y2BaNGydF4y2Ba- 苯基萘基氨基(NPN)可以在疏水环境中发出强荧光,但在水环境中不会发出荧光。当细菌细胞壁被破坏或破裂时,NPN可以接触细胞壁的疏水环境,导致荧光强度的增加,因此可用于间接评估RLG破坏细菌细胞壁的能力。数字GydF4y2Ba6.GydF4y2BaA显示rLG更容易穿透细菌细胞壁GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaATCC 25922随浓度的增加而增加。在低浓度(1、2和4 μ M)时,rLG损伤或破坏细菌细胞壁的能力GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaATCC 25922甚至比Melittin更好。GydF4y2Ba

图6.GydF4y2Ba
图6.GydF4y2Ba

rLG的作用机理。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba外膜渗透性GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba经肽处理的ATCC 25922。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba细胞质膜潜在变化GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba经肽处理的ATCC 25922。GydF4y2BaCGydF4y2BaTEM图像GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba用RLG治疗ATCC 25922。泳道1:视野放大5次;泳道2:视野放大10次;泳道3:视野放大20次GydF4y2Ba

重组LG (rLG)与细胞膜相互作用GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba通过细菌细胞壁后的ATCC 25922。阳离子染料,3,3'-双丙基亚二碳碳氰胺碘化物(圆盘GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba-5)是可以渗透到细胞膜中的染料,并作为非荧光聚合物存在于电池中。当细胞的血浆膜被破坏时,盘GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba-5被释放到外部环境,为单体,并且使荧光强度上升。因此,本研究中使用的荧光值来指示RLG对血浆膜电位的影响。它可以从图中可以看出。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaB,即使在最低测试浓度(1μm),RLG仍然导致荧光强度的快速增加,表明RLG可能导致损坏质膜电位GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaATCC 25922细胞,损伤呈剂量和时间依赖性。这种破坏作用甚至比16 μ M melittin的破坏作用更强。GydF4y2Ba

进一步直观地表明RLG对内部形态的影响GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaATCC 25922,TEM分析进行。数字GydF4y2Ba6.GydF4y2Bac表明未经治疗GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba膜具有完整的结构,充满了内容。用RLG治疗后,膜GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba被破坏,细胞内容物流出。GydF4y2Ba

总的来说,rLG可以穿透细胞壁屏障,使质膜去极化,在质膜表面形成孔洞或离子通道,导致细胞内内容物泄漏。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

本研究部分地取代了LL37活性中心氨基酸和获得了具有更好的抗微生物活性的新型AMP FR的。要修改FR的表达,具有最高选择索引二聚体LG是从二聚中选定的。LG显著提高单体肽FR的抗菌活性,并成功地表达GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Ba.RLG通过破坏细菌的细胞膜但具有低溶血活性而显示出强烈的抗微生物效果。另外,与单体肽Fr相比,RLG耐受盐离子的能力已得到改善。本研究为微生物系统中改性放大器的生产及其在工业生产中的应用提供了新的思路。GydF4y2Ba

材料和方法GydF4y2Ba

菌株,质粒和试剂GydF4y2Ba

用于抗微生物活性确定菌株GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaATCC 25922,GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba写明ATCC 078,GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba乌兰巴托,1005GydF4y2BaSalmonella typhimurium.GydF4y2Ba(GydF4y2BaS. Typhimurium.GydF4y2Ba7731 C),GydF4y2BaS. Typhimurium.GydF4y2BaATCC 14028,GydF4y2Ba铜绿假单胞菌GydF4y2Ba写明ATCC 27853,GydF4y2Ba金黄色葡萄球菌GydF4y2Ba(GydF4y2Ba金黄色葡萄球菌GydF4y2Ba)ATCC 29213,GydF4y2Ba金黄色葡萄球菌GydF4y2BaATCC 25923,GydF4y2Ba葡萄球菌表皮GydF4y2Ba(GydF4y2Ba美国epidermidisGydF4y2Ba)ATCC 12228,以及GydF4y2Ba粪链球菌GydF4y2Ba(GydF4y2BaS. FAECALIS.GydF4y2Ba) ATCC 29212,全部保存于东北农业大学动物营养研究所。载体pPICZaA购于中国北京六合华达基因技术有限公司。限制性内切酶购自赛莫费雪有限公司(美国沃尔瑟姆),SUMO蛋白酶购自广州Gene Copoeia。质粒提取试剂盒从Genstar(中国北京)获得。Ni-NTA Sefinose (TM)树脂试剂盒购自上海生工生物技术有限公司。所用的其他化学试剂纯度均为分析级。GydF4y2Ba

肽的特征GydF4y2Ba

表中显示了肽的氨基酸序列及其主要物理和化学参数GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba.在该研究中,R在原始活性中心(FD)序列中替代L137的D序列,以获得抗微生物肽FR。FR直接连接到FR以获得(FR)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba选择广泛使用的柔性连接器GGGGS和刚性接头AEAAAKA分别连接到FR以获得LG和LA。抗微生物肽FD,FR,(FR)GydF4y2Ba2GydF4y2BaLg和La由Sangon Biotech(中国上海)的固相综合合成。所有肽的纯度高于95%。GydF4y2Ba

表5氨基酸序列和关键物理化学参数GydF4y2Ba

抗菌肽活性测定GydF4y2Ba

最低抑菌浓度(MIC)是评价抗菌肽抑菌活性的重要指标。测定方法参照Dong等人改进的方法[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba].将测试的菌株接种在Mueller hinton肉汤(MHB)培养基中,并在200rpm和37℃下培养直至对数生长相,然后将菌落数调节至约10GydF4y2Ba5.GydF4y2BaCFU /毫升。96孔板第一行加入牛血清白蛋白(BSA)稀释剂(0.01%乙酸和0.2% BSA) 95µL和肽(1.28 mM) 5µL,其余各柱加入BSA稀释剂50µL。第一行混合后,抽吸50µL的混合物,加到第二列,以此类推,加到第11行。37℃培养18-24 h后,抑制细菌生长所需的最小肽浓度为MIC值。所有实验都至少进行了三次。GydF4y2Ba

肽的溶血活性测定GydF4y2Ba

通常通过溶血活性评估肽的安全性。来自健康供体的B型血液的收集的血液以1000×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba5分钟收集红细胞。然后洗涤红细胞并重悬于10mM PBS(pH7.4)中。在37℃下在96孔板中温育50微升稀释的红细胞和将相等体积的肽溶液(2-128μm)温育1小时。用0.1%Triton X-100处理的红细胞悬浮液用作阳性对照(100%溶血),并使用未处理的血细胞悬浮液作为阴性对照。96孔板以1000×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba在4℃下5分钟,然后将上清液转移到新的96孔板中。od的吸光度GydF4y2Ba570.GydF4y2Ba用酶标仪测定。GydF4y2Ba

重组质粒的构建GydF4y2Ba

抗菌肽LG的氨基酸序列FKRIVQRIKRFLRGGGGSFKRIVQRIKRFLR,结合密码子偏好GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Ba,遗传编码。这GydF4y2Ba生态GydF4y2BaRI限制性位点和编码基因6×他的SUMO在其5'结束时加入,并止码架和GydF4y2BaKpnGydF4y2Ba在3' 端添加I酶切位点。基因合成和亚克隆到表达载体的上述过程由北京六合华达基因技术有限公司完成GydF4y2Ba

转换成GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2Ba细胞和转化阳性选择GydF4y2Ba

将构建的重组质粒与空pPICZαA质粒进行酶切GydF4y2Ba囊GydF4y2Ba我形成线性结构。两种质粒与基因组相结合GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2BaX33经电转化(2500 V, 200 Ω和25µF)。转化体均匀包覆在含有100µg/mL Zeocin的YPD固体培养基上,置于30℃培养箱中培养3-5天。对所有单菌落进行PCR实验,筛选阳性克隆。GydF4y2Ba

6×HIS-SUMO-LG融合蛋白在振动瓶级的表达GydF4y2Ba

将阳性克隆接种于缓冲复合甘油培养基(BMGY)中,在30℃、250 rpm的摇床中培养至ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba文化为2-6。将发酵肉汤以13,000×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba10 min后,将收集的沉淀重悬于缓冲甲醇络合培养基(BMMY)中,并调整其浓度至ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba = 1.0.

发酵培养基的初始pH控制在7.0,和将发酵液在24,48,72,96,和感应与3.0%甲醇120 h后进行采样,以探索不同的时间点对蛋白质表达的影响。中的甲醇浓度控制为0%,0.5%,1.0%,1.5%,2.0%,2.5%,3.0%,3.5%和4.0%(V / V),和96小时的发酵液被收集到屏幕出最佳甲醇诱导浓度。此外,在感应用3%甲醇,发酵在介质的不同的初始的pH值下进行(5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5和8.0)。发酵液也收集诱导后96小时。通过以1000离心10毫升发酵液获得的细胞×GydF4y2BaGGydF4y2Ba称重30min,记录细胞湿重。采用Bradford法测定发酵上清液中总蛋白含量。GydF4y2Ba

纯化6倍His-Sumo-Lg融合蛋白和LG的释放GydF4y2Ba

发酵液95000 ×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba在4℃下静置10 min,然后在上清液中逐渐加入固体硫酸铵至70%饱和,过夜。沉淀溶于结合缓冲液(含10 mM咪唑,pH 8.0),透析过夜。将浓缩透析蛋白溶液加入Ni-NTA色谱柱中,用洗脱缓冲液(含250mm咪唑,pH 8.0)对融合蛋白进行洗涤,洗脱缓冲液的最终浓度为10 mM、50 mM、80 mM、150 mM和250mm咪唑。通过Tricine-SDS-PAGE筛选最佳洗脱浓度。GydF4y2Ba

将纯化的6 × His-SUMO-LG融合蛋白与SUMO蛋白酶和消化缓冲液(500 mM Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 2% NP-40, 10 mM DTT, pH 8.0)混合,4℃孵育16 h。混合体系再次通过镍柱。收集废水,用1kda的MWCO透析管透析,然后冻干。最后用Tricine-SDS-PAGE对纯化的rLG进行验证。采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定纯度。采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)测定肽的分子量。GydF4y2Ba

盐离子对rLG抗菌活性的影响GydF4y2Ba

将盐离子加入牛血清白蛋白溶液中,并配置成不同浓度的盐离子(150 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 6µM NH)GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba8 μ M氯化锌GydF4y2Ba2GydF4y2Ba, 1毫米氯化镁GydF4y2Ba2GydF4y2Ba, 2 mM CaClGydF4y2Ba2GydF4y2Ba和4μmfeclGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)解决方案。如上所述的方法被提及到确定RLG的MIC值GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaATCC 25922在存在不同浓度的盐离子。GydF4y2Ba

细胞壁透化作用GydF4y2Ba

通过监测荧光染料NPN(Sigma,USA)的荧光释放来测定细胞壁渗透性。GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba写明ATCC 25922 (ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba = 0.2) and NPN (10 µM) were incubated in 5 mM HEPES buffer (containing 5 mM glucose, pH 7.4) for 30 min. Then, 100 µL of peptides (0.5–32 µM) and an equal volume of bacteria were added to a 96-well plate. An F-4500 fluorescence spectrophotometer (Hitachi, Japan) was used to detect the fluorescence intensity of different wells at a 350 nm excitation wavelength and 420 nm emission wavelength. The peptide-free and polymyxin B-containing fluorescence values were set as negative and positive controls.

细胞质膜去极化GydF4y2Ba

圆盘GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba-5用于测量肽处理后血浆膜电位的变化。GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba写明ATCC 25922 (ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba= 0.05), 0.4µMGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba-5和100毫米KGydF4y2Ba+GydF4y2Ba在5 mM HEPES缓冲液中(含20 mM葡萄糖,pH 7.4),直到荧光稳定下降。随后,将2 mL细胞悬液加入无菌24孔板中,并与不同浓度的肽(2 - 32µM)混合。使用荧光分光光度计(Infinite 200 pro,中国特康)记录激发光波长622 nm和发射光波长670 nm下的荧光值。GydF4y2Ba

透射电子显微镜(TEM)表征GydF4y2Ba

大肠杆菌GydF4y2BaATCC 25922培养到对数生长阶段并离心以获得细菌。将细菌重悬于0.01M PBS(pH7.4)中两次并稀释至ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba = 0.3. The rLG and bacteria were mixed to a final concentration of 1/2 × MIC (1 μM), and the bacteria without peptide were used as a control. Both samples were incubated at 37 °C for 1 h. The incubated sample was centrifuged at 2500×GGydF4y2Ba用0.01 M PBS冲洗3次。在细菌颗粒中加入2毫升2.5%戊二醛缓冲液,轻轻吹制悬浮液,在4℃下固定过夜。0.01 M PBS洗涤细胞,在1%锇酸缓冲液中固定1 h,然后用不同浓度的乙醇梯度脱水(50%、70%、85%、95%、100%)。最后通过浸泡包埋法制备超薄切片,采用日立H-7650透射电镜(Hitachi H-7650 TEM, Hitachi, Japan)观察。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

的平均值和标准偏差(SD)用SPSS 16.0计算。D.ata were expressed as the mean ± SD. The comparison between each group of data was performed by ANOVA.P.GydF4y2Ba < 0.05 was defined as a significant difference. All experiments were conducted at least three times.

资助GydF4y2Ba

该项目由中国(32030101和31872368),黑龙江省(TD2019C001)的自然科学基金会自然科学基金会和财政部和MARA的中国农业研究系统的支持。GydF4y2Ba

数据和材料的可用性GydF4y2Ba

本研究期间生成和分析的所有数据集包含在此已发布的文章中及其附加文件中。GydF4y2Ba

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感谢国家自然科学基金项目、黑龙江省自然科学基金项目、财政部和农科院中国农业科研体系项目的支持。GydF4y2Ba

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隶属关系GydF4y2Ba

作者GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

新西兰:概念化、方法论、数据管理、形式分析、可视化和写作初稿。LZ:概念化、验证、数据管理、形式分析和写作-审查和编辑。调查和监督。YZ和XW:资源。JW:概念化。AS:概念化,监督工作和资金获取。所有作者阅读并批准了最终的手稿。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba鞍山山GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

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不适用。GydF4y2Ba

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不适用。GydF4y2Ba

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两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

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出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

补充信息GydF4y2Ba

附加文件1:图S1。GydF4y2Ba

PPICZαA-6×HIS-SUMO-LG表达载体的构建。(a)PPICZαA-6×HIS-SUMO-LG表达载体的示意图。(b)通过PCR扩增鉴定PPICZαa和PPICZαa-6×HIS-SUMO-LG的表达载体。通道1:低范围预染色蛋白标记物;泳道2:表达载体ppiczαa克隆;车道3-7:表达载体ppiczαa-6×他的sumo-lg克隆。GydF4y2Ba

附加文件2:图S2。GydF4y2Ba

Tricine-SDS-PAGE检测融合蛋白的表达GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2BaX33(图1的原始数字)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一种)GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

附加文件3:图S3。GydF4y2Ba

Western Blotting检测融合蛋白的表达GydF4y2Bap . pastorisGydF4y2BaX33(图1的原始数字)GydF4y2Ba2GydF4y2Bab)GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

附加文件4:图S4。GydF4y2Ba

亲和层析纯化6 × His-SUMO-LG融合蛋白,用Tricine-SDS-PAGE检测(原图)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种)。GydF4y2Ba

附加文件5:图S5。GydF4y2Ba

Tricine-SDS-PAGE analysis of the 6 × His-SUMO-LG protein cleaved by SUMO protease (original figure of Fig.4.GydF4y2BaB)。GydF4y2Ba

附加文件6:图S6。GydF4y2Ba

RLG的Tricine-SDS-PAGE分析(图1的原始数字)分析。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaC)。GydF4y2Ba

附加文件7:图S7。GydF4y2Ba

反相高效液相色谱法测定RLG的纯度。GydF4y2Ba

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詹宁,张磊,杨华。GydF4y2Baet al。GydF4y2Ba一种新的二聚体LL37变种的设计和异体表达GydF4y2BaPichia Pastoris.GydF4y2Ba.GydF4y2BaMicroB细胞事实GydF4y2Ba20,GydF4y2Ba143(2021)。https://doi.org/10.1186/s12934-021-01635-xGydF4y2Ba

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关键字GydF4y2Ba

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  • LL37GydF4y2Ba
  • Pichia Pastoris.GydF4y2Ba
  • 二聚体GydF4y2Ba
  • 融合表达GydF4y2Ba