跳到主要内容GydF4y2Ba

酶基补料分批发酵的细胞工程方法GydF4y2Ba

摘要GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

与之相关的基本问题GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba发酵是在批量培养中实现高细胞密度的困难,在很大程度上归因于醋酸的生产和积累,通过一种称为溢出代谢的现象,当提供足够的葡萄糖以满足细胞密度所需时。尽管补料批配置是减少此类问题的标准方法,但传统补料批系统所需要的组件在小规模应用时就会出现问题。一种替代方法是发展一种系统,利用淀粉的酶降解以控制的速度释放葡萄糖。然而,到目前为止,淀粉酶仅用于外源性培养,而我们的目标是设计和构建一个自我分泌的淀粉酶基础上的自我调节的分批补料发酵。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

一种推测的葡萄糖淀粉酶GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba已被克隆并表达GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaBL21(DE3)和W3110,其表现出显着的葡萄糖释放淀粉溶液活性。在用DSBA信号序列替代酶的酶天然信号肽后提高细胞外淀粉溶液活性,有助于葡糖淀粉酶分泌菌株,其能够利用淀粉作为所定义的培养基中的唯一碳源。介绍GydF4y2BaPcstAGydF4y2Ba,葡萄糖敏感的K12兼容启动子,以及与之诉讼GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡糖淀粉酶在GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaW3110,给人们增加细胞密度生长在淀粉文化(ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba〜GydF4y2Ba 30) compared to those grown on an equivalent amount of glucose (OD600GydF4y2Ba〜GydF4y2Ba15)。最后,提出了一种基于自分泌酶的间歇补料发酵系统GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡萄糖淀粉酶和一种重组蛋白(eGFP),在含有淀粉的培养基中生长时,产量比葡萄糖等价物增加四倍。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

通过分泌先前没有特征的细菌葡糖淀粉酶,这项研究开发了一种新的淀粉氨酸GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba能直接将淀粉转化为葡萄糖的菌株。与等量葡萄糖相比,该菌株在淀粉上生长时能够实现细胞密度的增加以及重组蛋白产量的相关增加,这首次证明了一种基于酶的分批补料发酵的细胞工程方法。GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

溢出代谢是限制细胞密度和重组蛋白产量的主要因素GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba发酵。在有氧条件下快速摄取葡萄糖时,乙酰辅酶a通过GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba中枢代谢从三羧酸(TCA)循环转移,并朝向醋酸盐的产生转移[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba].由此产生的醋酸盐的积累降低了培养基的pH值,导致了生长的减少[GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba]和重组蛋白产量的减少[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba].为了达到许多目的所需的细胞密度,在开始时将所有的葡萄糖添加到培养基中,将导致溢出代谢和醋酸盐的积累。通过限制葡萄糖的可得性,可以将培养细胞的特定生长速率降低到启动溢出代谢所需的阈值以下,从而最大限度地减少醋酸盐的产生和积累。底物有限补料分批发酵的概念是一种常用的方法,以最大限度地减少溢出代谢的有害影响,提高细胞密度和重组蛋白产量。传统的系统在衬底传递方式上有很大的不同;有些是用预先确定的进料速率编程的,例如常数或指数,而其他依赖于自动反馈控制[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba].无论其机理如何,传统的补料分批发酵通常是较小规模的发酵,例如在摇瓶中,由于控制系统的所需的复杂性,以及其他的技术困难,包括不能令人满意的流动和小的混合不切实际溶液,浓缩饲料卷。许多这些问题正在通过发展挑战,增加了微型生物反应器的可用性,例如从赛多利斯或Eppendorf公司的DASbox®的ambr®250,但是摇瓶还提供了可重复执行多种类型的industrially-一种廉价和有效的方法有关细胞培养中的工艺开发,并因此仍然被广泛整个产业界和学术界[使用GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

传统补料分批发酵概念的另一种替代方法,也可以直接应用于摇瓶,是通过内部供应机制开发基质输送[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba].一个具体到葡萄糖供应的例子是使用含有葡萄糖晶体的硅酮弹性体圆盘,当浸入介质时,通过扩散释放葡萄糖[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba].另一种方法是发展以酶为基础的分批补料发酵,在这种发酵中,葡萄糖通过淀粉的酶降解提供给培养物,即在添加淀粉酶后,代谢上不活跃的多糖转化为代谢上有活性的单糖[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba,GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba].该技术被称为EnBase®,已由BioSilta商业化开发[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]作为EnPresso®培养基,并使用从EnPresso®中分离的淀粉葡萄糖苷酶或葡萄糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)GydF4y2Ba黑曲霉GydF4y2Ba将淀粉转化为葡萄糖,通过葡萄糖释放的速率通过供应给培养物的葡糖淀粉酶的浓度确定。原始实验工作使用由矿物盐介质(MSM)组成的两相介质系统,与淀粉浸润琼脂层组成[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba[提供足够浓度的淀粉以实现高细胞密度,同时还避免与溶解度相关的问题。淀粉注入的琼脂层允许淀粉随着时间的推移连续溶解到培养基中。开发人员能够用100g / l淀粉注入凝胶,这基于一个葡萄糖可以产生约0.5g干细胞的假设,它们计算得足以使理论细胞密度为30克/升干燥细胞体重,相当于ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba大约100.优化的葡糖淀粉酶浓度产生了具有OD的细胞密度GydF4y2Ba600GydF4y2Ba的20至30,或约6至9克/升的干细胞重量的值,一个显著优于更常规使用复合培养基如LB [GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

尽管有这些优点,但到目前为止,这些系统仍然受到限制,因为它们需要添加外部供应的淀粉酶。在本研究中,我们描述了一种新的自分泌淀粉酶的发展和应用GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba菌株,提供了细胞工程方法的第一个示范的例子,以酶为基础的补料分批发酵。这里描述的工作范围包括鉴定和特征以前未报道的细菌糖化酶克隆GydF4y2Ba埃米氏菌族菌GydF4y2Ba,受到这种葡糖淀粉酶的调节表达和分泌GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba,最后应用该淀粉酶菌株增强摇瓶生物过程,从而提高细胞密度和重组蛋白产量。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

新型细菌葡萄糖淀粉酶的鉴定与特性GydF4y2Ba

葡糖淀粉酶能够从多糖的非还原末端连续地水解末端α-1,4糖苷连杆[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba],主要产生葡萄糖,而不是其他麦芽糖糊精。它们是目前基于酶的补料批量发酵系统的选择的酶,然而,大多数以前表征的葡糖淀粉酶以及主要用于工业目的的那些是真菌来源,主要是来自GydF4y2Ba黑曲霉GydF4y2Ba和GydF4y2Ba米根霉GydF4y2Ba[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba].大多数情况下,真菌的葡萄糖淀粉酶是高度糖基化的,这被认为对它们的稳定性很重要[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba],意味着他们往往很难成功表达GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba.一个显著的例外是来自GydF4y2Ba酿酒酵母酿酒酵母GydF4y2Ba(var。GydF4y2Ba道格拉GydF4y2Ba),已成功表达GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba以前作为非糖基化版本[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba].然而,由于在文献中缺乏例子,鉴定假定的细菌葡萄糖淀粉酶似乎是合适的,以促进表达和分泌GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba主持人。预先表达的细菌衍生的葡糖淀粉酶的少数例中的一种GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba耐高温葡萄糖淀粉酶(TtcGA)来自哪里GydF4y2Ba嗜热tengcongensisGydF4y2BaMB4 [GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba].利用碳水化合物活性酶数据库[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba],来自糖苷水解酶家族15推定的细菌葡糖淀粉酶进行了鉴定和选择基于它们的相关性的GydF4y2BaT.Tengcongensis.GydF4y2Ba葡糖淀粉酶[分子进化遗传学分析7.0(MEGA7)软件]使用图2中的树示出了这些细菌葡糖淀粉酶的关系。GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba.两种新的葡萄糖淀粉酶GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba和GydF4y2BaC. violaecum.GydF4y2Ba然后和GydF4y2BaT.Tengcongensis.GydF4y2Ba衍生的葡萄糖淀粉酶,转化成pET29a和pET28a表达载体。我们发现使用pET28或pET29时表达没有差异。本文详细研究了这三种糖淀粉酶(图中红色部分)之间的关系。GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba)显示在附加文件的对齐中GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba:图。S1。GydF4y2Ba

图。1GydF4y2Ba
图1GydF4y2Ba

假定细菌葡糖淀粉酶的进化树。假定的细菌葡糖淀粉酶十字内部可用生物引用。选择用于初始筛选(红色)的酶由于它们关联到以前表征的GydF4y2BaT.Tengcongensis.GydF4y2Ba糖化酶。通过分子进化遗传分析7.0版(MEGA7)软件使用邻接方法创建的系统发育树(MEGA7)软件GydF4y2Ba

图2GydF4y2Ba
图2.GydF4y2Ba

从细胞自由提取物中淀粉降解和葡萄糖积累GydF4y2BaD地热。腾冲GydF4y2Ba和GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡糖淀粉酶。来自BL21(DE3)的细胞免疫提取物含PQR1706(GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba葡糖淀粉酶,pQR1707 (GydF4y2BaT.Tengcongensis.GydF4y2Ba葡糖淀粉酶)或PQR1708(GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba糖化酶),在OD下用0.4 mM IPTG诱导GydF4y2Ba600GydF4y2Ba在25°C, 180 rpm的TB中培养24小时。GydF4y2BaA.GydF4y2Ba每个CFE淀粉酶测定1小时后剩余淀粉(深灰色)和累积葡萄糖(浅灰色)的浓度(mg/mL)。GydF4y2BaBGydF4y2Ba淀粉降解活动单位(深灰色)定义为1毫克/毫升的消失的淀粉/碘复杂每分钟每克干电池的重量,和葡萄糖积累活动单位(浅灰色)定义为积累1毫克/毫升的葡萄糖每分钟每克干细胞重量,每个CFE。淀粉酶中淀粉的降解通过淀粉/碘复合物在600 nm处的吸光度变化来测定,葡萄糖的积累通过HPAEC-PAD分析来测定。误差条表示标准差,n = 3GydF4y2Ba

两个淀粉降解和葡萄糖蓄积测定法用于确定无细胞提取物的活动GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba,GydF4y2BaT.Tengcongensis.GydF4y2Ba,GydF4y2BaC. violaeciumGydF4y2Ba葡糖淀粉酶。每一种酶产生葡萄糖作为主要的水解产物,剩余淀粉和累积葡萄糖在1小时的检测时间的联合质量大约等于检测中淀粉的初始浓度(2.5 mg/mL)(图)。GydF4y2Ba2.GydF4y2Baa) 。淀粉降解率和葡萄糖积累率之间的差异对于试验组是明显的GydF4y2BaT. tengcongesisGydF4y2Ba葡萄糖淀粉酶,但不是GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba或者是GydF4y2BaC. violaeciumGydF4y2Ba葡糖淀粉酶(图。GydF4y2Ba2.GydF4y2Bab)。与葡萄糖积累相比,淀粉降解率增加GydF4y2BaT.Tengcongensis.GydF4y2Ba葡糖淀粉酶表明,后两种酶具有较低的内发活性和更清洁的水解产物曲线(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)。GydF4y2Ba

图3.GydF4y2Ba
图3.GydF4y2Ba

的色谱图GydF4y2BaD地热。腾冲GydF4y2Ba和GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba糖化酶水解产物。淀粉酶分析样品的ICS色谱图示例1小时后移除,用于GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaBL21(DE3)表达GydF4y2BaA.GydF4y2BaPQR1706,GydF4y2BaBGydF4y2BaPQR1707,和GydF4y2BaCGydF4y2BaPQR1708,在25℃,180rpm的Tb培养24小时(在OD下用0.4mm IPTG诱导GydF4y2Ba600GydF4y2Ba0.8)GydF4y2Ba

同时与GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba和GydF4y2BaC. violaeciumGydF4y2Ba葡糖淀粉酶引起合适的水解产物简档,每一个酶进行了研究,基于它们定位到周质中并依赖于外膜的渗透性为释放到胞外介质的分泌的潜力。如果检查目前,天然信号序列,是外源的信号肽的DsbA的(最初从硫醇二硫化物氧化还原酶衍生在许多细菌物种,包括发现GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba)[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba]或的pelB(最初从果胶酸裂合酶B来源GydF4y2Ba胶杆Carotovorum.GydF4y2Ba)[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba,通过SRP引导蛋白质[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]或Sec [GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba)分别通路。的GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba葡糖淀粉酶没有含有天然分泌信号序列(信号4.1),结果没有显示任何细胞外活动(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种)。既不加入外源信号序列DSBA(PQR1709)或PELB(PQR1710),增加细胞外活动。事实上,它们的添加减少了细胞免疫提取物活动。相比之下,GydF4y2BaC. violaeciumGydF4y2Ba葡萄糖淀粉酶确实包含一个天然的分泌信号序列,并显示出未经修饰的细胞外活性(图)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab)。这项活动被淘汰去除天然信号序列(pQR1711)之后,但在另外的DsbA信号序列(pQR1712)依照原来的略有改善救出。GydF4y2Ba

图4.GydF4y2Ba
图4.GydF4y2Ba

细胞外和细胞外提取活性GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba和GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba添加外源信号序列后的葡萄糖淀粉酶。细胞外(深灰色)和细胞游离提取物(浅灰色)的活性以单位表示(定义为每毫升培养液中1毫克/毫升淀粉/碘复合物每分钟的消失量)。在BL21(DE3)中表达的构建物,在LB中25°C, 180 rpm培养24小时(OD条件下由0.4 mM IPTG诱导)GydF4y2Ba600GydF4y2Ba0.6-0.8)。GydF4y2BaA.GydF4y2BapQR1703 (GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba葡糖淀粉酶),PQR1709(GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba含DsbAss的葡萄糖淀粉酶)或pQR1710 (GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba含PelB信号序列的葡萄糖淀粉酶)。GydF4y2BaBGydF4y2BapQR1705(GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡糖淀粉酶),pQR1711(截GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba或pQR1712 (GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba含DsbA信号序列的葡萄糖淀粉酶)。误差条表示标准差,n = 6GydF4y2Ba

确保位于细胞外GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡萄糖淀粉酶在典型状态下仍保持活性GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba在温度范围为20-60℃的温度下使用淀粉酶测定测量培养温度,淀粉降解(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)。酶的最佳活性被认为是在大约30℃,同时仍保持50%的活性在20℃下。GydF4y2Ba

图5.GydF4y2Ba
图5.GydF4y2Ba

相关的活动GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡糖淀粉酶与温度。细胞外的活动GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba不同温度(20°C至60°C)下的葡萄糖淀粉酶,以37°C下进行的标准淀粉酶分析的活性百分比表示。从含有pQR1705的BL21(DE3)中提取的测定的细胞外培养基样品(GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡萄糖淀粉酶)在LB中培养24小时,25°C, 180 rpm (0.4 mM IPTG诱导,ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba0.6-0.8)。标准淀粉酶测定中的活性通过600nm处的淀粉/碘配合物的吸光度变化确定。误差条表示标准差,n = 3GydF4y2Ba

利用淀粉作为唯一的碳源通过葡萄糖释放淀粉水解GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba应变GydF4y2Ba

大肠杆菌GydF4y2BaBL21 (DE3)表示GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡萄糖淀粉酶能够在含淀粉作为唯一碳源的无葡萄糖MSM中生长(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba一种)。在24小时的培养期间导致ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba对于在含有2.5mg / ml淀粉的葡萄糖自由MSM中生长的PQR1708(天然信号序列)和PQR1712(DSBA信号序列)超过1.5的值。相反,BL21(DE3)控制培养物没有达到远远超出初始接种物密度的密度(ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba0.25)。随着细胞密度的增加,两种葡萄糖淀粉酶表达菌株的淀粉降解也显著高于未转化的对照,24 h内超过一半的可用淀粉(> 1.5 mg/mL)被降解(图)。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab)。在培养物中观察到含质粒细胞的类似生长优势GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaW3110与表达质粒pQR187的A-淀粉酶,附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba:图S3。GydF4y2Ba

图6.GydF4y2Ba
图6.GydF4y2Ba

葡萄糖释放淀粉电压GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba菌株及其利用淀粉作为唯一的碳源。GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaBL21(DE3)含有pQR1708(原生信号序列)或pQR1712 (DsbA信号序列),接种有初始OD值GydF4y2Ba600GydF4y2Ba0.25且在30℃,250rpm的24小时内培养,在补充有2.5mg / ml淀粉的葡萄糖免疫MSM中。GydF4y2BaA.GydF4y2Ba细胞密度(ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba)后培养24小时。GydF4y2BaBGydF4y2Ba培养24 h后培养基中淀粉降解量(mg/mL),淀粉降解测定中淀粉/碘络合物在600 nm处的吸光度。误差条表示标准差,n = 3GydF4y2Ba

在摇瓶中使用淀粉/琼脂层进一步探索了含有pQR1712的BL21(DE3)的生长特性(附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba:图S4),显着提高葡萄糖无MSM内淀粉的可用性。这些培养物达到了od的细胞密度GydF4y2Ba600GydF4y2Ba约为15(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba),相当于常用的复合培养基,如LB或TB,但培养时间较长,为72小时。然而,与含有等量溶解葡萄糖(50 mg/mL)的MSM烧瓶相比,在含有淀粉的培养基中培养的表达糖化酶的BL21(DE3)细胞在最终细胞密度方面没有优势。GydF4y2Ba

图7.GydF4y2Ba
图7.GydF4y2Ba

葡萄糖淀粉酶分泌的生长曲线GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba在含淀粉或葡萄糖的MSM中培养。生长曲线超过72 hGydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba含有pQR1712的BL21(DE3)在含淀粉琼脂层的MSM(圆形)或添加50 mg/mL葡萄糖(方形)的MSM中培养(接种时用0.4 mM IPTG诱导[相当于初始OD值的接种量]GydF4y2Ba600GydF4y2Ba0.1)]GydF4y2Ba

自分泌的基于酶补​​料分批发酵的示范GydF4y2Ba

大肠杆菌GydF4y2BaBL21(DE3)被广泛报道比其他菌株如W3110更不容易溢出代谢。因此,我们利用K12兼容启动子研究了释放葡萄糖的W3110淀粉酶菌株在以淀粉为碳源培养时,与等量葡萄糖相比,是否能实现更高的细胞密度。葡萄糖敏感的表达GydF4y2BaPcstAGydF4y2Ba通过测量含有不同浓度葡萄糖的LB的生长后测量细胞外血糖酰基酶活性的启动子。随着葡萄糖的浓度增加,细胞外葡糖淀粉酶活性降低,从0至20mM葡萄糖的活性减少了四倍(图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba)。GydF4y2Ba

图8GydF4y2Ba
图8.GydF4y2Ba

描述的GydF4y2BaPcstAGydF4y2Ba规范的GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba补充0-20 mM葡萄糖的LB培养基中的糖化酶分泌。细胞外糖化酶活性GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaW3110在37°C,250 rpm,含有一系列葡萄糖浓度(0-20mm)的LB中培养了PQR1715(BBA_K118011-CV2DSBA)。每克干细胞重量为单位(定义为每分钟1mg / ml淀粉/碘络合物的淀粉/碘络合物)的活性,并通过600nm处的淀粉/碘配合物的吸光度的变化来确定。误差条表示标准差,n = 3GydF4y2Ba

对生长自调节的葡糖淀粉酶的表达的效果可通过使用淀粉/琼脂层(附加文件证明GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba:图S4)和摇瓶中的无葡萄糖MSM。GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba含有pQR1715的W3110在淀粉(OD)培养基上培养时,细胞密度显著提高GydF4y2Ba600GydF4y2Ba约。30)中,用葡萄糖的等效量相比(ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba约。(图15)。GydF4y2Ba9GydF4y2Ba一种)。相关联的细胞外葡糖淀粉酶活性测定,并表示为每培养毫升和U二者每1U克(DCW),其中一个单位定义为1毫克淀粉 - 碘复合物每分钟的消失。出人意料的是,在整个培养期间有每培养毫升任一U(图中淀粉和葡萄糖媒体之间测量葡糖淀粉酶活性没有差别。GydF4y2Ba9GydF4y2Bab)或U每g(DCW)(图。GydF4y2Ba9GydF4y2Bac).在前30 h,两种培养基类型的U / mL培养液的初始含量均有所增加,随后进入平稳期。当恢复到正常状态时,细胞密度活性在前10小时迅速下降,随后在剩余的培养期间趋于稳定。GydF4y2Ba

图9.GydF4y2Ba
图9.GydF4y2Ba

PcstAGydF4y2Ba规范的GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡糖淀粉酶的表达及其对含淀粉 - 琼脂层MSM生长的影响。GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba含有pQR1715 (BBa_K118011-CV2DsbA)的W3110在30°C, 180 rpm,无葡萄糖培养基中添加淀粉琼脂层(圆形)或添加50 g/L葡萄糖的培养基中培养72小时(方形)。GydF4y2BaA.GydF4y2Ba每种条件的生长曲线重复。GydF4y2BaBGydF4y2Ba在37°C下通过淀粉酶测定测定细胞外培养基中的葡萄糖淀粉酶活性,并以每mL培养物的单位表示。GydF4y2BaCGydF4y2Ba细胞外介质中的葡糖淀粉酶活性通过淀粉酶测定在37℃下测定,并表达为每克干细胞重量的单位。单位定义为每分钟1mg / ml淀粉/碘络合物的失踪,通过600nm处的淀粉/碘配合物的吸光度变化确定GydF4y2Ba

为了确定细胞密度的增加是否反映重组蛋白产量的增加,设计了一种同时表达重组蛋白的载体GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡糖淀粉酶和感兴趣中的eGFP(pQR1720)的形式的重组蛋白。数字GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba显示该质粒,其中GFP和葡糖淀粉酶构造成在操纵子中并从LAC启动子表达。含淀粉的培养物始终如一地实现了细胞密度的较大增加(图。GydF4y2Ba10.GydF4y2Baa)和eGFP荧光(图。GydF4y2Ba10.GydF4y2Bac、 d)与葡萄糖当量相比,从0到48小时;首次证明了通过基于自分泌酶的补料分批发酵直接提高重组蛋白产量。GydF4y2Ba

图10GydF4y2Ba
图10GydF4y2Ba

通过同时表达,自我分泌基于酶的酶联批量发酵GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba糖化酶和EGFP在GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaW3110。GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaW3110窝藏pQR1720,在含有葡萄糖自由MSM与淀粉琼脂层或MSM瓶中培养在补充有50g / L的葡萄糖,在37℃,250rpm下48小时[在接种用0.4mM IPTG诱导(初始ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba(0.25的数值)。GydF4y2BaA.GydF4y2Ba增加细胞密度(ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba)每种培养基类型培养48小时以上。GydF4y2BaBGydF4y2Ba在48小时内,每种培养基类型的细胞外培养基葡萄糖淀粉酶活性增加,以每mL培养物的葡萄糖淀粉酶活性单位表达,通过淀粉酶测定在37°C下,以每mL培养物的单位表达。单位定义为每分钟1 mg/mL淀粉/碘络合物的消失量,由淀粉/碘络合物在600 nm处的吸光度变化确定。GydF4y2BaCGydF4y2Ba在总的eGFP荧光单位增加超过对于每种媒体类型48小时,使用的535nm的483 nm,发射波长的激发波长整齐全细胞的样品上测量仪(Tecan无限200 pro)的。GydF4y2BaDGydF4y2Ba每种介质组合在蓝光下的eGFP表达图像,一式三份。误差条表示标准差,n = 3GydF4y2Ba

讨论GydF4y2Ba

两部小说的特点GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba和GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba本研究中的葡萄糖淀粉酶显示两者都比先前描述的更具有外作用GydF4y2BaT.Tengcongensis.GydF4y2Ba葡萄糖淀粉酶,与高性能阴离子交换色谱数据显示,葡萄糖积累增加相对较长链寡糖时,前者水解淀粉。此外,淀粉水解和葡萄糖积累的质量平衡对两者的负作用较小GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba和GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba糖化酶,比为GydF4y2BaT.Tengcongensis.GydF4y2Ba葡糖淀粉酶,表明除了后一酶的葡萄糖之外的产物的积累。GydF4y2Ba

增加的能力GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba分泌到细胞外培养基中的糖化酶可能是由于存在一个天然信号序列,而不是GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba葡萄糖淀粉酶,它不包含固有的信号序列。本机信号序列的替换GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡萄糖淀粉酶与DsbA信号序列在分泌方面有边际但仍然显著的改善。事实上GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba葡糖淀粉酶没有含有可识别的天然信号序列表明它通常不会导出,因此可能不是细胞外应用的最佳候选酶。实际上,尽管添加了DSBA信号序列或PELB信号序列,但检测到细胞外介质中的任何活性,表明GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba葡萄糖淀粉酶不易通过SRP或Sec途径分泌。相反,GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡萄糖淀粉酶是自然分泌的,显然能够通过GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba通过天然信号序列和外源DSBA信号序列。标准有两个略有不同的路线GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba识别和处理信号序列。这些是SEC和SRP途径。PelB信号序列通过SEC途径处理,DsbA序列通过SRP途径处理。在某些情况下,SRP信号序列有助于分泌某些不能通过SEC途径有效分泌的蛋白质。但就GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2BaSRP和SEC途径都不允许分泌。GydF4y2Ba

分泌GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba经由任一信号肽的葡糖淀粉酶显示出相当大的葡萄糖在胞外介质,足以允许表达菌株包含生长期间培养基内降解淀粉释放淀粉分解活性。此外,GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba表达和分泌的BL21(DE3)GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡萄糖淀粉酶能够利用淀粉作为唯一的碳源,据我们所知,这是第一个工程实例GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba将淀粉直接转化为葡萄糖以促进生长。为了模拟分批补料发酵使用可利用碳的缓慢释放,定义培养基(无葡萄糖MSM)和淀粉琼脂层的组合被开发GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡糖淀粉酶GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaW3110表达菌株。的分泌GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡萄糖淀粉酶被设计成由其自身的水解产物负调控,从理论上讲,在整个培养过程中,无论细胞密度如何,培养基中的葡萄糖浓度都是恒定的。一种环磷酸腺苷(cAMP)敏感启动子(GydF4y2BaPcstAGydF4y2Ba选择并表征。GydF4y2BaPcstAGydF4y2Ba本身,来自GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaJM109,通常参与碳饥饿反应基因的调控(GydF4y2BaCSTA.GydF4y2Ba),其葡萄糖饥饿期间上调[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba].这背后的机制是基于cAMP诱导分解代谢物基因激活蛋白(CAP)构象改变的能力,增强其与CAP依赖启动子的结合[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba],和促进表达。在不存在葡萄糖的,细胞内cAMP水平升高[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba],导致CAP到启动子和靶基因的转录之后的结合。在高葡萄糖浓度,细胞内cAMP减少,从而导致结合的CAP的减少,并在基因转录的后续还原。GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaW3110表达GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡糖淀粉酶在调节下GydF4y2BaPcstAGydF4y2Ba能够达到大约两倍于在等量葡萄糖下培养的密度;证明了细胞密度的增加是基于自我调节酶的分批补料发酵的直接结果。GydF4y2Ba

然而,对于该系统的主要警告是,对于至少摇动烧瓶,至少可以特异于K12菌株,因为BL21(DE3)出现不受益于来自淀粉的葡萄糖的缓慢释放,可能是因为BL21(DE3),是一个b株GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba,在首先,在高浓度葡萄糖的生长方面没有表现出任何不利影响。这可能是B菌株,BL21(DE3)的结果,使用乙醛酸盐分流的能力,降低醋酸盐的积累,最大限度地减少溢流代谢的不利影响[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

没有质粒与含有质粒分泌相同的主机对主机的数据菌株GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡萄糖淀粉酶或α淀粉酶在含淀粉培养基中显示,在有质粒的细胞中,这两种情况下的生长速度和最终OD值都显著增大。这表明,在我们这里描述的系统中,分泌酶的运输和表达没有“负担”。的数据GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba有无质粒表达GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡糖淀粉酶在无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba在附加文件中GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba图S3显示,在富含淀粉的培养基中,α -淀粉酶表达质粒的生长速度和最终OD值明显高于游离质粒细胞。GydF4y2Ba

最后,在尝试使用增强的细胞块作为重组蛋白表达的平台,同时表达淀粉酶和一个感兴趣的重组蛋白的研究。而不是使用两个独立的载体,两个基因都是从同一个载体表达的。其基本原理是,这将消除相容性问题,减少与多种抗生素抗性基因相关的代谢负担,并简化转化方法。此外,它还将为一个多功能系统提供基础,在这个系统中,已经包含自我调节淀粉酶的质粒可以被设计成包含一个多克隆位点,以便插入另一个感兴趣的基因,在概念上类似于目前市面上可用的载体,如pETDuet™(Novagen)或pACYCDuet™(Novagen),但专门用于以淀粉为底物的高密度生长。pQR1720的构建包括一个包含eGFP的操纵子,紧接着是GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡糖淀粉酶(无花果。GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba),受GydF4y2Ba虫胶GydF4y2Ba启动子,成功地证明了以淀粉为唯一碳源的重组蛋白表达系统。pQR1720基于pUC19,是一个拷贝数非常高的质粒,每个细胞大约有500-700个拷贝。pQR1720中的eGFP是由lac启动子表达的,而lac启动子在pET结构中比T7启动子弱得多。pET中先前的结构处于低/中拷贝数骨干中,每个细胞有15-20个拷贝。pUC和pET的基因剂量相差25- 45倍(pUCGydF4y2Ba\(\ gg \)GydF4y2Ba pET) which evens out the influence of the weaker promoter. So although the promoter pPlac is weaker than the T7 promoter, the large increase in copy number makes up for this.

图11GydF4y2Ba
figure11GydF4y2Ba

为同时表达eGFP和GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba糖化酶。pQR1720的矢量地图,使用多个插入件CPEC以下使用引物对指示插入物和载体的PCR反应构建。使用CPEC8_GFP.rv和CPEC9_GFP.fw引物,具有pQR1344作为模板,镶刀1(eGFP)的扩增插入物2(GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba具有连接的DsbA信号序列的葡糖淀粉酶),使用CPEC9_CVprimer2Dsb.rv和CPEC9_CVprimer2Dsb.fw引物,具有pQR1712作为模板,扩增,并使用CPEC9_pUC19.rv和CPEC8_pUC19.fw引物作为模板,扩增,用的pUC19载体主链GydF4y2Ba

此外,在含淀粉的培养基中重组蛋白(eGFP)的产量高于含等量葡萄糖的培养基;第一个增强重组蛋白表达的例子直接从细胞工程的方法,以酶为基础的补料分批发酵。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

本研究为微生物发酵的基本问题提供了一个创新的解决方案,实现了高细胞密度和提高批量培养重组蛋白产量。结合酶基分批补料发酵和工程淀粉水解的原理GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba菌株,一个概念证明已经被证明有潜力提供一个替代当前传统的馈批方法。更广泛地说,这项工作突出了细胞工程增强生物处理的能力,并为寻求将其与其他细胞工程方法结合起来提高整体生物处理效率的进一步项目提供了一个平台。GydF4y2Ba

方法GydF4y2Ba

菌株和质粒GydF4y2Ba

大肠杆菌GydF4y2Ba本研究使用的菌株为W3110 (FGydF4y2Ba-GydF4y2BaλGydF4y2Ba-GydF4y2Barph-1GydF4y2Ba,GydF4y2Ba发票GydF4y2Ba(GydF4y2BarrnDGydF4y2Ba,GydF4y2BarrnEGydF4y2Ba))[72],和BL21(DE3)[73](FGydF4y2Ba-GydF4y2BaompTGydF4y2Ba,GydF4y2Ba加GydF4y2Ba,GydF4y2Ba扩张型心肌病GydF4y2Ba,GydF4y2BalonGydF4y2Ba,GydF4y2BaHSDS.GydF4y2BaBGydF4y2Ba(GydF4y2BaRGydF4y2BaBGydF4y2Ba-GydF4y2BaMGydF4y2BaBGydF4y2Ba-GydF4y2Ba)l(de3 [GydF4y2Ba拉西GydF4y2Ba普拉库夫5GydF4y2Ba-GydF4y2BaT7p07GydF4y2Baind1GydF4y2Basam7GydF4y2Banin5GydF4y2Ba])(Novagen)。HST08(Stellar™化学主管,克拿尼克)和Top10(化学竞争力,Thermo Fisher Scientific)用于亚克隆的实验。使用Syngene(1.1.3)软件设计了所有载体,引物和寡核苷酸。寡核苷酸被Eurofins基因组学合成并提供。在PCR中使用,将冻干的寡核苷酸重新悬浮在MILIQ水中并稀释至10μm的浓度。用于连接,将互补寡核苷酸的等摩尔浓度混合,加热至98℃并冷却至室温。使用传统的限制消化和结扎或通过圆形聚合酶延伸克隆构建载体。通过限制性分析和测序(Eurofins Genomics)进行正确施工的确认。使用选择性LB琼脂平板保持并繁殖所有菌株,补充有卡那霉素(20μg/ ml),氨苄青霉素(50μg/ ml)或氯霉素(30μg/ ml)(表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)。GydF4y2Ba

表1构建体本研究中使用的GydF4y2Ba

染色体DNA的制备GydF4y2Ba

嗜热tengcongensisGydF4y2Ba由莱布尼茨研究所DSMZ(DSM编号15242)提供冻干GydF4y2BaCaldanaerobacter subterraneusGydF4y2Ba亚普。GydF4y2BatengcongesisGydF4y2Ba),并重新悬浮在1ml 20% (w/v)甘油中。GydF4y2Ba埃米氏菌族菌GydF4y2Ba和GydF4y2BaDeinococcus Geothermalis.GydF4y2Ba由J.沃德甘油原种提供。染色体DNA,通过用无菌水稀释甘油原液1中10制备。溶菌酶加至该稀释,得到50微克/毫升的最终浓度,并将该混合物在37℃℃15分钟。然后加入SDS,得到的1%(V / V)的最终浓度,转动混合物清晰和粘性。该溶液的250微升用P2(250μL)和N3的涡旋混合物合并(350μL)试剂(的QIAprep小量制备试剂盒,Qiagen)中,并在17000离心10分钟×GydF4y2BaGGydF4y2Ba.将上清液加载到旋转柱上(QIAprep Miniprep Kit, Qiagen),从此时开始采用标准的Miniprep方案。用100µL EB缓冲液洗脱基因组DNA,直接用于PCR。基因组DNA从GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba由玛丽亚·鲍恩医生提供。GydF4y2Ba

质粒构建GydF4y2Ba

从糖化酶基因GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba,GydF4y2BaT.Tengcongensis.GydF4y2Ba,GydF4y2BaC. violaeciumGydF4y2Ba在标准条件下使用PCR扩增[Phusion®high fidelity PCR master mix with HF Buffer (New England Biolabs)]。退火温度梯度10°C(最低引物T的任何一边5°CGydF4y2BaMGydF4y2Ba)每次PCR均产生预期大小的条带;GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba(2396个基点),GydF4y2BaT.Tengcongensis.GydF4y2Ba(2111个基点)GydF4y2BaC. violaeciumGydF4y2Ba(2624 BP)。在凝胶提取和纯化(Qiaquick凝胶提取试剂盒,Qiaquick凝胶提取试剂盒,Qiagen),DNA带用Ndei和Xhoi(新英格兰Biolabs)消化,并连接(T4 DNA连接酶,新英格兰Biolabs)以纯化Ndei / Xhoi消化PET29A或PET28A骨架(Novagen)。通过限制消化分析和测序(Eurofins基因组学),分别证实所得构建体,PQR1703,PQR1704,PQR1705和PQR1706,PQR1705和PQR1708。GydF4y2Ba

加入信号肽与中GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba通过对DsbA和PelB信号序列(由Eurofins Genomics合成)对应的互补寡核苷酸进行退火,使意义链的5 '端和反义链的3 '端相互错开,形成一个与XbaI限制性位点兼容的连接,意义链的3 '端和反义链的5 '端交错排列,以与NdeI限制性位点兼容。在XbaI限制位点和起始密码子之间包含一个核糖体结合位点和一个间隔区。在XbaI/NdeI酶切pQR1703后,退火寡核苷酸连接到主链上形成pQR1703- dsba和pQR1703- pelb,分别命名为pQR1709和pQR1710。将DsbA信号序列添加到GydF4y2Bac . violaceumGydF4y2Ba葡糖淀粉酶首先需要使用排除天然信号序列但包含在悬垂区域中的NDEI位点(包括起始密码子)的替代前底序列来移除天然序列。然后将截短的基因克隆到PET29a中形成pQR1711,其本身用作插入退火的互补寡核苷酸的骨架,产生PQR1711-DSBA,指定PQR1712。GydF4y2Ba

使用圆形聚合酶延伸克隆(CPEC)构建质粒pQR1715和PQR1720 [GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba].在含有HF缓冲液的25μL的25μL的25μL的25μL的总量为50μl的总体积中进行反应,纯化的载体(200ng)与纯化插入物为1:1摩尔比。CPEC反应的热循环条件使用98℃的初始变性时间为30秒,然后循环变性(98℃,15s),退火(55℃,30°C)和延伸(72°C每1000个碱基对25秒),最终延伸为72°C 5分钟。对单插入CPEC(PQR1715)进行一个循环,但对于多个插入物(PQR1720),这增加到20个循环。CPEC反应产物直接用于转化(4μLCPEC产物,在50μL态度中;表GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba)。GydF4y2Ba

的引物和寡核苷酸的表2的核苷酸序列在载体构建中使用GydF4y2Ba

媒体和摇瓶组成GydF4y2Ba

将25 g溶于1 L水中,制得含有10 g/L色氨酸、10 g/L NaCl和5 g/L酵母提取物的Miller 's LB Broth (Sigma Aldrich)。极好的肉汤(Sigma Aldrich),含12 g/L胰蛋白胨,24 g/L酵母提取物,9.4 g/L KGydF4y2Ba2.GydF4y2BaHPOGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba2.2 g / l khGydF4y2Ba2.GydF4y2Ba宝GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba,通过将47.6克外加8毫升甘油加入到1升水中来制备。两者都在121℃下高压灭菌15分钟。GydF4y2Ba

无糖无机盐培养基(MSM)取自Krause等[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba],每升水溶解2.0 g NaGydF4y2Ba2.GydF4y2Ba所以GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba, 6.12 g (NHGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba所以GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba, 0.50克nhhGydF4y2Ba4.GydF4y2BaCl, 14.60 g KGydF4y2Ba2.GydF4y2BaHPOGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba, 3.60 g NaHGydF4y2Ba2.GydF4y2Ba宝GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba·HGydF4y2Ba2.GydF4y2BaO、 1.00克(新罕布什尔州)GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba-GydF4y2BaHGydF4y2Ba-柠檬酸盐,3毫米MgSOGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba, 0.1 g盐酸硫胺,2 mL SM6微量元素溶液(由104 g/L柠檬酸,5.22 g/L氯化钙组成)GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba·2HGydF4y2Ba2.GydF4y2BaO, 2.06 g/L ZnSOGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba·7HGydF4y2Ba2.GydF4y2BaO, 2.72 g/L MnSOGydF4y2Ba4.GydF4y2Bah·4GydF4y2Ba2.GydF4y2BaO,0.81克/ L的CuSOGydF4y2Ba4.GydF4y2Bah·5GydF4y2Ba2.GydF4y2BaO,0.42克/ L COSOGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba·7HGydF4y2Ba2.GydF4y2BaO, 10.06 g/L FeClGydF4y2Ba3.GydF4y2Bah·6GydF4y2Ba2.GydF4y2BaO, 0.03 g/L HGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba博GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba,0.02 g / l naGydF4y2Ba2.GydF4y2BaMoOGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba·2HGydF4y2Ba2.GydF4y2BaO) 。使用0.22µm微孔快车对溶液进行过滤消毒™ 加上带真空泵的stericup®。MSM以三种形式制备,即无糖MSM、添加2.5 mg/mL葡萄糖(西格玛)的MSM或添加2.5 mg/mL淀粉(可溶性马铃薯淀粉,西格玛)的MSM。为了帮助溶解淀粉,在添加其他成分和过滤消毒之前,后者需要含有足够淀粉的预高压灭菌水,最终浓度为2.5 mg/mL。GydF4y2Ba

淀粉琼脂层内的500mL带挡板摇瓶中制备,并且在与葡萄糖自由MSM介质结合使用。首先,50的50mL溶液毫克/毫升淀粉和2毫克/毫升琼脂加入到烧瓶中并在121℃下高压灭菌15分钟。一旦冷却,50毫升的预高压灭菌50毫克/毫升琼脂倾倒在原始层的顶部上,并使其冷却。最后,50 mL葡萄糖自由MSM加入到烧瓶中,残留在上述层(附加文件GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba:图S4)。GydF4y2Ba

生长和表达研究GydF4y2Ba

所有用于生长和表达研究的摇瓶都接种过夜培养的1 / 20稀释液,或接种到初始ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba0.1或0.25。过夜培养通常是5 mL LB在50 mL猎鹰管(含适当的抗生素)从甘油种子,并生长在37°C 250 rpm。除非另有说明,否则使用500 mL折流板锥形摇瓶,其中包含50 mL选定的培养基,在某些情况下还包括前面描述的淀粉/琼脂层。除培养基外,如果需要,还提供以下浓度的抗生素:卡那霉素(20µg/mL);氨苄青霉素(50µg / mL);氯霉素(30µg / mL)。对于本研究中使用的所有诱导启动子的诱导,在培养物达到OD时加入0.4 mM IPTGGydF4y2Ba600GydF4y2Ba0.6–0.8,或在接种时,用于涉及淀粉分解菌株的生长试验。摇瓶培养是在不同的温度和持续时间下进行的,这取决于实验的性质(详情见单独的实验),但所有的培养都是在标准的轨道培养摇瓶(innova)中进行的™ 4330,新不伦瑞克科学公司),转速为250或180转/分。GydF4y2Ba

细胞游离萃取物(1 mL)于17000 ×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba5分钟。将所得颗粒重新悬浮在300μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.4)中,并进行超声处理(3个周期,20秒开启,20秒关闭,振幅为10微米,MSE Soniprep 150)。随后的整个细胞部分在17000×10℃下进一步离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba5分钟并收集作为澄清的裂解物上清液。GydF4y2Ba

细胞外部分:细胞外培养基中淀粉酶的分泌量测定,1 mL, 17000 ×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba将所得上清液收集为细胞外介质级分的5分钟。为了从该级分中量化活性,将样品直接加入淀粉酶测定中。GydF4y2Ba

淀粉溶解活性测定GydF4y2Ba

淀粉的水解活性是通过测定淀粉-碘复合物的降解速率来确定的,该方法由Blanchin-Roland和Masson调整[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba],或通过脉冲安培检测(HPAEC-PAD)的高效阴离子交换色谱分析葡萄糖的积累。除非另有说明淀粉分解的活性测定设置使用一个50µL细胞外媒体或细胞样本免费提取由0.5毫升,15毫米钠磷酸盐缓冲剂(pH5.8)和孵化37°C 0.5毫升淀粉溶液(5毫克/毫升淀粉15毫米钠磷酸盐缓冲剂(pH5.8)]。随后在多个时间点取50µL的样品,加入1ml碘化钾/碘溶液[新鲜制备的加入200 μL 2.2% IGydF4y2Ba2.GydF4y2Ba/4.4% KI(W / V)到100ml的2%(W ​​/ V)KI溶液]与吸光度在600nm处测得的相应减少。酶活性的一个单位定义为1毫克/每分钟的淀粉 - 碘复合物溶液在37℃的消失。另外,还采取了样品HPAEC-PAD分析,用于从淀粉的淀粉分解水解产生单 - 和小链寡糖的检测和定量。Detection was carried out by injecting 25 µL samples into a Reagent-Free Ion Chromatography System (ICS 5000+, Dionex) equipped with a Dionex CarboPac™ PA100 anion exchange column (2 × 250 mm) fitted with a Dionex CarboPac™ PA100 guard column (2 × 50 mm), and an electrochemical detector system. Elution was carried out using a linear gradient of 100 mM NaOH at 0 min, to 60 mM NaOH and 400 mM NaOAc at 18 min, followed by a step of 40 mM NaOH and 600 mM NaOAc for a further 2 min. The column was re-equilibrated for 5 min with 100 mM NaOH. The flow rate remained at 0.25 mL min−1.GydF4y2Ba系统压力约为2500 psi。使用Chromeleon软件版本7执行数据收集和分析。GydF4y2Ba

使用前面描述的淀粉分解活性测定法测定培养基中的淀粉降解,其中将50µL澄清培养基样品直接添加到1 mL碘化钾/碘溶液中[通过添加200μL 2.2%碘新鲜制备]GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba/4.4%Ki(w / v)成100ml 2%(w / v)ki溶液。用600nm的碘化钾/碘溶液坯料测量吸光度,标准曲线制备以确定浓度。对于超出分光光度计线性范围的淀粉浓度,澄清培养基的样品适当稀释并以相同的比例加入碘化钾/碘溶液中。GydF4y2Ba

分别使用483 nm和535nm的激发和发射波长(Tecan公司无限临M200)的测定从在24个或96微孔板分配整齐细胞培养物的样品的eGFP的荧光测量荧光强度。增益是为进行每个实验进行优化。被显示的荧光单位或者不论细胞密度,或归一化至OD600取决于进行的特定实验。GydF4y2Ba

数据和材料的可用性GydF4y2Ba

本研究期间生成或分析的数据包括在本发表的文章中。对该研究进行的任何进一步的数据都可以从相应的作者获得。GydF4y2Ba

参考文献GydF4y2Ba

  1. 1。GydF4y2Ba

    Åkesson M,等。水中乙酸形成的在线检测GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba培养物用溶解的氧反应,进料瞬变。Biotechnol Bioeng。1999; 64:590-8。GydF4y2Ba

    文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  2. 2。GydF4y2Ba

    卢利GW,斯特罗尔WR。生长、醋酸盐产生和醋酸盐抑制的比较GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba在分批菌株和补料分批发酵。申请环境微生物。1990; 56:1004至1011年。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  3. 3.GydF4y2Ba

    Bauer KA,等。提高人白细胞介素-2在高细胞密度发酵罐培养的细胞中的表达GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaK-12由磷酸突变体。申请环境微生物。1990; 56:1296-302。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  4. 4.GydF4y2Ba

    yee l,blanch hw。重组蛋白表达在高细胞密度FED分批培养物中GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba.生物/技术。1992; 10:1550-6。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  5. 5。GydF4y2Ba

    贝茨JI,Baganz F.微型生物反应器:目前的做法和未来的机会。Microb细胞事实。2006; 5:21-35。GydF4y2Ba

    文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  6. 6。GydF4y2Ba

    Tyrrell EA,Mac Donald Re,Gerhardt P. Biphasic系统,用于浓缩培养中的Bactreia。J细菌。1958年; 75:1-4。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  7. 7.GydF4y2Ba

    吕伯C,德棉AL,控制释放聚合物,以进料铵到上Bergman K.使用GydF4y2Ba链霉菌属GydF4y2Ba带小棒GydF4y2Ba摇瓶中的头孢菌素发酵。苹果microbiol biotechnol。1986; 23:411。GydF4y2Ba

    谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  8. 8.GydF4y2Ba

    朱德等。采用慢速释放技术在摇瓶中进行补料。Biotechnol Bioeng。2006;95:433-45。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  9. 9。GydF4y2Ba

    等。一种新的补料分批培养方法提供了高细胞密度和提高可溶性重组蛋白的产量在摇瓶培养。Microb Cell Fact. 2010; 9:1-11。GydF4y2Ba

    文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  10. 10。GydF4y2Ba

    等。酶控制葡萄糖自动输送高细胞密度培养在微板和摇瓶。Microb Cell Fact. 2008; 7:31-45。GydF4y2Ba

    文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  11. 11.GydF4y2Ba

    基于酶的液体培养分批补料技术。谷歌的专利;2010.US20120045836A1。GydF4y2Ba

  12. 12.GydF4y2Ba

    亨利萨特B,戴维斯G。糖苷水解酶的结构和序列分类。当前意见结构生物。1997;7:637–44.GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  13. 13。GydF4y2Ba

    Norouzian d,等。真菌葡糖淀粉酶。Biotechnol adv。2006; 24:80-5。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  14. 14.GydF4y2Ba

    Coutinho PM, Reilly PJ。葡萄糖淀粉酶的结构、功能和进化关系。蛋白质结构与功能生物信息学1997;29:334-47。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  15. 15.GydF4y2Ba

    小林林F,中村Y。高效生产GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba重组蛋白使用盐水效应保护蛋白水解降解。Biotechnol Lett。2003; 25:779-82。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  16. 16。GydF4y2Ba

    Zheng Y,et al.小麦耐热糖化酶的克隆、表达和表征GydF4y2Ba嗜热tengcongensisGydF4y2BaMB4。苹果microbiol biotechnol。2010; 87:225-33。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  17. 17.GydF4y2Ba

    等。碳水化合物活性酶数据库(CAZy):糖基因组学的专家资源。核酸Res. 2009;37(数据库版):D233-8。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  18. 18.GydF4y2Ba

    路易林克J,多伯斯坦B。哺乳动物和GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba信号识别粒子。摩尔微生物学。1994;11:9–13.GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  19. 19。GydF4y2Ba

    Schierle CF,等。该DsbA的信号序列指导乘客蛋白质的高效,共翻译出口到GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba周质通过信号识别粒子途径。细菌志。2003;185:5706–13.GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  20. 20.GydF4y2Ba

    雷斯卡等。表征GydF4y2BaErwinia carotovoraGydF4y2BapelB基因及其产物果胶酸裂解酶。J Bacteriol。1987;169:4379 - 83。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  21. 21。GydF4y2Ba

    化合价的QA。信号识别颗粒介导的蛋白靶向GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba. 安东尼·范·列文胡克。2001;79:17–31.GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  22. 22。GydF4y2Ba

    Fekkes P,Driessen AJM。靶向细菌细胞质膜的蛋白质。Microbiol Mol Biol Rev. 1999; 63:161-73。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  23. 23。GydF4y2Ba

    王志强,王志强,王志强,等。水稻碳饥饿基因的分子和功能研究进展GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba. 摩尔生物学杂志。1991;218:129–40.GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  24. 24。GydF4y2Ba

    Busby S, Ebright RH。分解代谢物激活蛋白(CAP)的转录激活。中华医学会分子生物学分会。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  25. 25。GydF4y2Ba

    体外葡萄糖浓度与体内cAMP水平的关系GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba:磷酸转移酶介导腺苷酸环化酶调控模型的意义。Microbiol。1997;143:1909-18。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  26. 26。GydF4y2Ba

    Noronha SB,等。关于TCA循环和乙醛酸分流的研究GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaBL21和JM109使用13C-NMR / MS。Biotechnol Bioeng。2000; 68:316-27。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  27. 27。GydF4y2Ba

    吴建军,等。用半参数方法评价微阵列:在中枢碳代谢中的应用GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaBL21和JM109。基因组学。2007; 89:300-5。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  28. 28。GydF4y2Ba

    Phue J-N。高密度生长时的葡萄糖代谢GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba乐队GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba代谢途径的差异决定了人体对葡萄糖的有效利用GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaB通过微阵列和Northern印迹分析确定。生物技术生物工程。2005;90:805–20.GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  29. 29.GydF4y2Ba

    等。葡萄糖供应策略对醋酸盐积累、生长及重组蛋白生产的影响GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaBL21(λde3)和GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaJM109。Biotechnol Bioeng。1996年; 49:421-8。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  30. 30.GydF4y2Ba

    陈志强,王志强,王志强,等。两种重组菌醋酸盐积累机制的初步研究GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba高密度发酵过程中的菌种。Biotechnol Bioeng。1998;57:71-8。GydF4y2Ba

    文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  31. 31.GydF4y2Ba

    Yanisch-Perron C,Vieira J,Messing J.改进的M13噬菌体克隆载体和宿主菌株:M13MPL8和PUC19载体的核苷酸序列。基因。1985; 33:103-19。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  32. 32.GydF4y2Ba

    Quan J,Tian J.复合基因文库和途径的圆形聚合酶延伸克隆。Plos一个。2009; 4(7):E6441。GydF4y2Ba

    文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

  33. 33。GydF4y2Ba

    Blanchin-Roland S,Masson J-M。由合成基因控制的蛋白质分泌物GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba.蛋白质工程。1989; 2:473-80。GydF4y2Ba

    中科院GydF4y2Ba文章GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

下载参考GydF4y2Ba

致谢GydF4y2Ba

我们感谢Dragana Dobrijevic博士提供pQR1344和Maria Bawn博士提供GydF4y2Bad . geothermalisGydF4y2Ba基因组DNA。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

MS由EPSRC博士资助项目EP/K503332/1资助。JMW获得了BBSRC BB/L007444/1和BB/J019445/1的资助。GydF4y2Ba

作者信息GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

作者GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

MS执行实验并用JMW写下稿件。JMW构思了该研究和MS和JMW计划并设计了实验。所有作者阅读并认可的终稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba约翰·沃德GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

伦理宣言GydF4y2Ba

竞争利益GydF4y2Ba

作者声明没有竞争利益。GydF4y2Ba

附加信息GydF4y2Ba

出版商的注意GydF4y2Ba

Springer Nature在公布的地图和机构附属机构的管辖权主张方面保持中立。GydF4y2Ba

补充信息GydF4y2Ba

附加文件1:图S1。GydF4y2Ba

从葡糖淀粉酶的比对GydF4y2Ba嗜热tengcongensisGydF4y2BaMB4,GydF4y2BaDeinococcus Geothermalis.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba色素细菌violaecumGydF4y2Ba.GydF4y2Ba图S2。GydF4y2Ba粗(全细胞)和澄清的裂解物在SDS页分析pQR1706, pQR1707和pQR1708。GydF4y2Ba图S3。GydF4y2Baα-淀粉酶分泌的生长曲线GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba相比于质粒免费GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba在市售的高细胞密度培养基中培养。GydF4y2Ba图S4。GydF4y2Ba设计淀粉琼脂层系统,为高细胞密度应用提供充足的碳。GydF4y2Ba

权限GydF4y2Ba

开放访问GydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中,除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中,并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途,你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本,请浏览GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba.Creative Commons公共领域奉献豁免(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本文提供的数据,除非在数据的信贷额度中另有说明。GydF4y2Ba

再版和权限GydF4y2Ba

关于这篇文章GydF4y2Ba

通过Crossmark验证货币和真实性GydF4y2Ba

引用这篇文章GydF4y2Ba

以酶为基础的分批补料发酵的细胞工程方法。GydF4y2Ba活细胞的事实GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba146(2021)。https://doi.org/10.1186/s12934-021-01634-yGydF4y2Ba

下载引用GydF4y2Ba

关键字GydF4y2Ba

  • Enzyme-based馈料式发酵GydF4y2Ba
  • 细菌葡糖淀粉酶GydF4y2Ba
  • 淀粉转化葡萄糖GydF4y2Ba
  • 细胞工程的生物处理GydF4y2Ba