的产品trans- 通过全细胞生物转化产生胰酸L-phenylalanine在设计中CoryneBacterium谷氨酰胺

背景

trans- 基因酸（T-CA）是一种具有广谱的苯丙醇，具有抗氧化剂和抗菌活性，并且在食品和美容应用中也具有很高的潜力。虽然在生产中取得了重大进展T-CA使用微生物，其相对较低的产品效价仍需改进。在这项研究中，我们设计了CoryneBacterium谷氨酰胺作为生物转化的全细胞催化剂L苯丙氨酸（L-phe）进入T-CA并制定了重复生物转化过程。

结果

一种基于苯丙氨酸解氨酶编码基因的表达模块海洋链霉菌（SMPAL），调解转换L板式换热器进T-CA，被建造在C.谷氨酰胺．使用强大的启动子p_H36和核糖体结合位点（RBS）（在T7噬菌体的基因10的前面）和高拷贝数质粒，SMPAL可以表达到总蛋白质的39.1％的水平C.谷氨酰胺．接下来，改善T-CA在工业规模的生产中，优化了温度和pH值的反应条件;T-CA生产在最佳条件下的生物反应器最多时达到6.7毫摩尔/小时（50℃和pH 8.5，使用NaOH作为碱溶液）。最后，回收系统是由与生物反应器耦合膜过滤开发和工程C.谷氨酰胺成功生产了13.7毫米T从18.2毫-CA（24.3 G）L-苯丙氨酸(36克)，通过重复补充，产量为75% (0.75 mol/mol)。

结论

我们开发了一种高效的生物转化过程C.谷氨酰胺作为生物催化剂和基于微膜的细胞再循环系统。据我们所知，这是第一个报告T-CA生产C.谷氨酰胺，而且这种强大的平台将有助于开发工业相关平台的生产T-CA使用微生物。

trans- 肉桂酸（3-苯基丙烯酸，T-Ca）是植物中的主要酚类化合物，其作为各种多酚的前体，例如斯蒂芬和黄酮类化合物[1.］.许多研究报告说，T-CA具有广泛的生物活性，包括抗氧化和抗菌活性，在食品和化妆品中也有很高的应用潜力[2.,3.,4.,5.］.此外，由于T-CA被认为是“普遍认为是安全（GRAS）”化合物通过食品和药物给药（FDA），它可能有几种用途;所以，T-CA是将注意力吸引为人类的重要物质[6.］.由于广泛的适用性T-CA，生产的研究tCA在近年来已经积极地进行。T-CA可从植物中分离；然而，由于难以优化环境和地理条件，该方法尚未克服产量低的问题[7.］.此外，T-CA可以通过有机化学合成方法合成：乙酸钠存在乙酸酐和苯甲醛的缩合反应[8.,9,10.］.虽然化学合成占最大部分T-CA生产到目前为止，它是一种能源密集型和非绿色过程，因为它需要高温条件和化石资源[11.,12.］.因此，迫切需要开发更简便、更安全的方法，如生物方法;因此，微生物的生产T-CA是将注意力视为替代策略。

当然,，T-CA可以合成L苯丙氨酸（L-phe）通过苯丙氨酸氨裂解酶（PAL，EC 4.3.1.5）[13.］.PAL催化非氧化脱胺L-phe并将其转换为Tca(无花果。1.a).近年来，PAL在临床、工业和生物技术应用方面引起了极大的兴趣[14.］.特别是，在T采用微生物-CA生产方法，PAL被公认为合成所需的一种必需酶T-约。通过最近的进化和多样化的代谢工程策略，各种微生物，如大肠杆菌,Streptomyces Lividans.,酿酒酵母酿酒酵母， 和Pseudomonas普蒂达，已被用来产生0.8克/升T-CA [11.,12.,15.,16.,17.,18.］.此外，在先前的研究中，通过在表达PAL大肠杆菌并优化栽培条件，我们能够生产6.9克/升T-CA通过在2L生物反应器规模处通过FED分批发酵[19.］.据我们所知，这是最高滴度T-CA制作到目前为止。但是，虽然在生产中取得了重大进展T-CA使用微生物，仍然需要改善相对较低的生产率。

一般来说，与化学合成的生产过程相比，使用微生物的全细胞生物催化剂的化学品提供了几个优点：（i）环保生产，（ii）高级区域选择性，（iii）辅助因子再生步骤反应[20.］.然而，为了在全细胞生物催化剂的生产中获得高产量，需要一种可以满足以下条件的微生物：（i）被认为是生产的安全宿主，（ii）高细胞密度培养物（iii) the ability to easily induce high expression of the genes coding for heterologous proteins, and (iv) maintenance of cell viability during harsh conditions, e.g., changes in temperature or pH [21.,22.]. 在这方面,，CoryneBacterium谷氨酰胺备受关注的适合使用全细胞生物催化剂系统以可持续的生物过程中使用的细菌。C.谷氨酰胺是一种非产孢菌和革兰氏阳性菌吗L- 氨基酸，如L谷氨酸和L-赖氨酸[23.,24.,25.］.C.谷氨酰胺由于它可以在有限的空间内非常密集地生长，因此与其他细菌相比，它可以获得较高的细胞生物量浓度，因此被广泛用作工业菌株。此外,由于C.谷氨酰胺通常被认为是安全的（GRAS），所生产的任何感兴趣的化合物的也是安全的，降低了对下游应用的限制。此外，最近在基因工程的进步使不同应用C.谷氨酰胺作为一种潜在的工业品[26.,27.,28.,29.］.考虑到这些有益的特性，C.谷氨酰胺已被用作全细胞生物催化剂以产生各种化学品，如花青素，酮基脂肪酸，十一碳-9-烯酸，和庚基酯[30.,31.,32.,33.,34.,35.］.

在这里，我们报告的工程C.谷氨酰胺作为生产的全细胞生物催化剂T-约。首先，我们构建了一个用于PAL编码基因的表达系统海洋链霉菌（SmPAL），用于转换L-phe到T-约。接下来，以提高生物转化成T-CA，反应条件，包括温度，pH值，和碱源进行了优化。最后，横流微滤膜组件耦合到所述生物反应器，并再循环全细胞生物催化剂的转化率与基板的重复加入（执行L-苯丙醚)，以达到高产量T-约。

的表达SmPAL基因C.谷氨酰胺为了T-CA生产

以前，我们检查了少数PAL酶的生物合成的效率T-CA在大肠杆菌和SmPAL显示出最高的生产T-CA [36.］.此外，与其他PAL不同，SMPAL也已知具有相对较低的（酪氨酸氨酶）活性（酪氨酸氨酶）活性P-coumaric酸代替T-CA [37.,38.］.因此，使用的酶适用于在生物转化过程中减少侧产物形成。根据这些特征，我们决定使用SMPAL来合成T-CA在C.谷氨酰胺并构建该基因的表达系统。在全细胞生物催化剂系统中，T-CA生物转化率可以与SmPAL的在细胞中的内容相关联;因此，我们使用了高拷贝数的质粒pHCMS [39.]克隆SmPAL基因在强合成组成启动子P_H36[40] （无花果。1.b） 。此外，核糖体结合位点（RBS）（位于T7噬菌体基因10的前面），已知其可促进细胞中的高效基因表达C.谷氨酰胺，也是因为，不管转录起始位点的强度如何，启动子和起始密码子之间的非翻译区(UTR)序列SmPAL基因可以影响基因表达C.谷氨酰胺（无花果。1.b).使用该构建物(pHCMS-SmPAL)，我们通过SDS-PAGE确认SmPAL (56 kDa)已成功合成C.谷氨酰胺（无花果。1.c). SmPAL以可溶性形式产生，其最高含量为总蛋白量的39.1%(图3)。1.C）。

评估生物转化进入Tca与工程C.谷氨酰胺

和C.谷氨酰胺窝藏PHCMS-SMPAL，生物转化L-phe到T-CA在烧瓶规模培养进行评价。在摇瓶培养物中，将细胞在30培养℃和22小时（图后达到稳定期。2.一种）。18.2毫米L然后加入-phe（3g / l），生物转化物L-phe到T-立即观察到CA（图。2.b）。为18.2毫L-Phe，大约18小时后，观察到所述衬底的完全消耗，并且我们发现其中15.9毫T已经合成了0.8mm / h的转化率，产率为87％（0.87mol / mol）（图。2.b） 。接下来，使用更高浓度的水来评估生物转化效率L-phe（36.3和54.5 mm）。当浓度为36.3毫米L-使用苯丙氨酸（6 g/L），底物在30小时内完全消耗，并且在29.7 mM的时间内T-Ca是生产的，转化率为81％（0.81mol / mol）（图。2.C）。另外，使用54.5毫米L-phe（9 g / l），36小时后达到总消耗，42.5毫米T-CA是生产的，转化率为78％（0.78mol / mol）（图。2.d).尽管已经明确证实了工程细胞可以转化L板式换热器进T-CA，产生高收益率，转化率不够高，因此我们试图进一步优化反应条件。

提高转换率T-CA通过增加反应温度

以前，据报道，PAL酶的活动来自于穆萨SPP。，Triticum Aestivum.,麻黄， 和vitis Vinifera随着反应温度的增加，随着反应温度的增加而迅速增加[41.］.因此，我们比较的转化率L-phe到T-CA在不同反应温度(30、37、45、50和55℃)下被SmPAL催化。细胞在30℃的指数生长期在烧瓶中培养，在达到固定期后，进一步培养30 min，以达到各目标温度。随后,18.2毫米L-phe被添加，和金额T-CA产生每时间单位进行分析。总体而言，随着反应温度的升高（图2中的转化率迅速增加。3.a, b).特别是在50℃时，完全消耗整个18.2 mML-苯丙氨酸在2.5 h时出现，与30℃时相比，反应速率提高了约4倍1.）.为18.2毫L-呸,，T3 h产生的-CA为15.3 mM(图3)。3.b），与...相比没有显着差异T- 在30℃反应（18h）时基质完全消耗，当基材完全消耗时 - C最终产量（图。2.b）。因此，确认反应温度的增加有助于提高转化率，但不会影响T-CA产量。同时，在55℃下观察到反应速率的急剧降低（图。3.a，b）。基于这些数据，我们决定在50℃下将温度设定为在生物反应器中进行反应。

生物转化进入Tca与工程C.谷氨酰胺在生物反应器中

接下来，为了确认开发的全细胞生物催化剂的可行性大规模，性能C.谷氨酰胺对于转换L-phe到T-CA在2l生物反应器中进行评价。细胞在30°C孵育并生长到外径₆₀₀7小时后50（图。4.a） 。当细胞到达固定相时，将其进一步培养1小时以达到50℃，并通过添加5 M氨溶液将pH调节至7.5。然后，21.2毫米的L为生物转化反应加入-phe（3.5g / l）T-约。如图1所示。4.b、 增加L-phe迅速转换为T-CA在生物反应器中。完全消耗L在大约3.5小时观察到-phe;那时，转换了T-Ca浓度为17.5mm，表明生产率为5.0mm / h（图。4.b）。因为在培养中供应包括Casamino酸和BHI在内的复杂成分，T-CA可以使用残差来合成L转化反应过程-Phe不论L-Phe补充，这可能包括在成品率分析。为了获得准确的产量分析，我们进行了相同的生物转化反应没有补充的L-咳，我们发现T-CA滴度为约0.4mm（附加文件1.：图S1），与补充L-呸。因此，证实了T-CA滴度图观察到的。4.B大多来自加入底物的反应。

此外，我们还比较了大型生物反应器中pH变化对反应速率的影响。以前的研究已经证实，PAL在pH值6.5到9.0之间具有活性，而SmPAL在pH值8.5时表现出最大活性[37.］.在烧瓶中培养C.谷氨酰胺窝藏pHCMS-SmPAL，我们还证实，反应速率逐渐增加，随着pH从6.5增加到8.5（附加文件2.：图S2）。基于这些烧瓶结果，我们在pH8.5的生物反应器中进行了转化反应，以确保转换效率最高。在pH 7.0和30℃下培养细胞后，将温度升至50℃，通过加入5M氨溶液将培养基的pH增加到pH8.5。然而，与烧瓶的结果相反，pH8.5（4.3mm / h）的反应速率低于生物反应器中pH7.5（5.0mm / h）的反应速率（图。4.C）。这是以前研究中的结果[37.］.Maldonado等人。据报道，与正常情况相比，反应中氨的存在降低了从Cherimoya提取到33％的PAL的相对活性[42.］.因此，我们假设用于pH控制的氨将平衡转移到底物一侧(L-Phe）中的转换L-phe到T-CA通过PAL酶。因此，代替5M氨溶液，我们使用了10M NaOH溶液来控制pH并观察到这一点L-Phe在2.5 h内完全消耗，比使用氨水(pH为8.5或7.5)快约1 h，转化率提高到6.7 mM/h(图5)。4.C）。

接下来，我们在更高浓度的情况下分析了转化效率L-Phe加入33.3 mM, 42.4 mM, 54.5 mM的培养基中L-phe是33.3毫米，在9小时内观察到氨基酸的完全消耗，27.7毫米T-CA的产率为83％（0.83mol / mol）（附加文件3.：图S3）。然而，在高浓度的L-phe，在不完全消耗底物的情况下停止生物转化。浓度为42.4毫米L-Phe，28.3毫T-10小时后生成CA，产率为66%（0.66 mol/mol），反应结束时残留7.3 mM的钙L-Phe（附加文件3.：图S3）。而且，浓度为54.5毫米L-phe，43.2毫米T-CA在10小时后产生79％（0.79mol / mol），反应终止10.9毫米L-Phe剩余的（附加文件3.：图S3）。这些结果表明高浓度的转换L-phe到T-CA通过单批反应器不是获得高产量的合适方法。因此，有必要开发一种新的方法。

的产品T-CA使用横流基于膜的细胞回收系统

为了用大量底物进行生物转化反应，我们开发了一种横流膜的细胞再循环系统，其中生物反应器和横流微滤膜组件偶联。在这个系统中，L-Phe（18.2毫摩尔）被反复提供给生物反应器，而产生T通过横流膜过滤除去-Ca，并且细胞循环到下一轮反应中的生物反应器（图。5.一种）。与所述一个间歇反应相比，更L-phe可以为生物转化提供，并使用膜过滤，合成T-CA周期性地从反应器中除去，通过该毒性积累（T可以防止生物反应器中的CA）。在第一轮，提供L-Phe (18.2 mM)被完全消耗，14.2 mM的T-CA已成功合成（图。5.b） 。生物转化反应再重复三次，如图所示。5.B，生产T-CA在四个周期中保持在相似的水平，表明重复的周期也没有破坏细胞的完整性。在四个周期，共18.2毫米L-苯丙氨酸(36 g)， 13.7 mMT-CA（24.3g）生产，产率为75％（0.75mol / mol）。从细胞培养到四周期转化反应的整个过程在20小时内完成，可以实现高达0.7mm / h的生产率。

T-CA可广泛应用于健康，食品和药业部门。它使用微生物的生产可以是有机化学合成的有吸引力的替代品，这导致环境污染问题。为了提高生产T-CA，我们设计了C.谷氨酰胺作为全细胞生物催化剂，通过优化生物反应器中的生物转化反应，结合细胞回收和膜过滤系统，可以获得较高的产量。在早期的研究中，我们设计了大肠杆菌为生产T-CA并获得6.9克/升T-CA通过补料分批培养与工程菌株[19.］.虽然这种滴度是最高的记录，但由于长种植（86小时），生产率并不高（0.138克/小时）[19.］.为了改善这一次，考虑了反应温度的改性。如图所示，SMPAL在50°C下显示其最高活动;比30℃高四倍的活动（图。3.）.很遗憾，大肠杆菌和大多数细菌宿主不能在50℃下进行培养，但通常30和37℃，在该所述PAL酶的活性不够高之间生长。此温度差的障碍之一生产的要解决T-CA使用微生物。与此相反大肠杆菌,C.谷氨酰胺具有非常刚性的细胞壁结构，由灰霉酸，阿拉伯半酸酐和肽聚糖层组成[43.］.由于这种明显的结构，C.谷氨酰胺因其对各种化学品和极端条件(如高温、pH值和洗涤剂)的高耐受性而闻名，因此它已成为一个强大的和潜在的平台，用于生产有毒化学品和在极端条件下的生产[44.,45.,46.］.虽然C.谷氨酰胺细胞在50℃下没有活着，C.谷氨酰胺由于细胞壁结构坚固，细胞不易被破坏，SmPAL在50°C仍然活跃，在此温度条件下不会释放。利用这种刚性宿主，生物转化反应T-CA可以在50°C下进行，与使用的使用相比，可以实现更高的转化率（5.3±0.4mm / h）大肠杆菌（桌子1.）.此外，由于其对高温的高耐受性C.谷氨酰胺平台可以耦合到回收系统，并且细胞一直显示t即使在50°C的所有四轮连续反应中也是CA生产能力。然而，在反复转化反应中，我们也发现了T-CA产量逐渐降低（图。5.b） 这可能归因于SmPAL活性的丧失。达到最高产量的高温和pH条件会反过来降低PAL酶的稳定性。在之前的一项研究中，据报道，与30°C相比，PAL在50°C下的稳定性降低了4倍或更多[47.[因此，为了提高当前系统的可重用性，可以考虑具有高酶活性的PAL工程，即使在高温下高温或高温稳定性，这将是我们的下一个工作。

在所有生物转化反应中，C.谷氨酰胺表现出高潜力作为整个细胞生物催化剂的生产T-CA，但我们无法达到100％的转换产量。一种原因可能是与苯丙醇固有的降解相关的分解代谢途径的活化C.谷氨酰胺．在C.谷氨酰胺， 这博士鉴定基因簇以通过COA依赖性，β-氧化脱乙酰化途径使用苯丙烷醇的利用[48.］.虽然转录调节器PHDR用于激活博士基因簇与T-CA [48.]它可以由其他苯基丙醇（例如）激活P-香豆酸、咖啡酸和阿瓦酸，这些都是从氨基酸中提取的L- 葡萄酒和L-phe，因此合成T-CA可以降级[48.］.在这项工作中，即使我们在50℃下进行反应，在哪个细胞不活着，选择性除去苯基丙醇醇降解途径可以被认为是进一步提高生产效率的策略T-约。

在整个细胞生物催化剂的发展中，编码关键酶的基因的表达也是至关重要的。在大多数发酵过程中，编码关键酶的基因的表达水平需要优化以降低生产宿主的代谢负担：编码关键酶的基因的高度表达可能导致细胞生长差，因此，目标材料的生产滴度降低[49.］.然而，在全细胞生物催化剂的平台，我们不需要考虑主机的代谢负担，所以表达水平可以提高到最高水平，并且能够实现有效的生物转化。在这方面，使用C.谷氨酰胺作为全细胞催化剂相比，这些从显示出有益的结果大肠杆菌发酵过程。在基因表达之前，我们的团队开发了许多有用的合成工具C.谷氨酰胺，包括合成启动子，RB和高拷贝数质粒[39.,40］.在本研究中，我们考虑了所有这些工具来优化SmPAL基因编码的表达，SmPAL是生物转化的关键酶T-约。放置SmPAL基因在强启动子P_H36和在高拷贝数质粒中的RBS（T7噬菌体的基因10面前），SMPAL含量达到总蛋白质的39.1％C.谷氨酰胺用作宿主的菌株;这种内容远高于获得的内容大肠杆菌在强IPTG诱导启动子P_TRC[19.］.

除了表达水平之外，酶的溶解度对于宿主中的酶反应至关重要。以前，当基因表达时，检测到SMPAL进入不溶性包容体的聚集大肠杆菌即使在不同启动子的控制下（p_tac，P._TRC和p_坏的）.这种聚集导致在这两个酶活性和生产效价降低。相比之下，虽然的表达水平SmPAL基因在C.谷氨酰胺，最SmPAL酶不聚集成包涵体但在一个高度可溶形式（图制作。1.C），其允许高效的酶促反应。根据更高的表达水平SmPAL基因和SmPAL的溶解性，C.谷氨酰胺可以作为潜在宿主进行生产吗t加利福尼亚州。

在这项研究中，我们开发了采用了高效生物转化过程C.谷氨酰胺作为生物催化剂。和A.high-level gene expression system, the reaction condition was optimized (i.e. 50 °C and pH 8.5, using NaOH as a base solution), and by using a recycling system coupled with membrane filtration, we could achieve much improved productivity (0.7 mM/h). To the best of our knowledge, this is the first report onT-CA生产C.谷氨酰胺，而生产率也是最高的记录在微生物生产系统日期[19.］.与需要更长的培养时间（〜几天）的微生物发酵过程相比，并且由于毒性而具有生产滴度的极限T-CA [12.,19.]，我们的生物转化系统与强劲C.谷氨酰胺是竞争力的竞争力，代表了一个高度稳定和性价比的平台。通过将关键的酶（即SMPAL）向更高的活动和建立最佳的下游方法进行纯化，整个过程可以进一步提高，我们相信我们的生物转化系统可以是商业生产的主要贡献者T-CA在生物工业中。

细菌宿主和培养条件

本研究中使用的细菌菌株和质粒列于表中2.．大肠杆菌XL1蓝用于基因克隆和质粒维护，以及C.谷氨酰胺ATCC 13,032用作生物转化的主要宿主。大肠杆菌XL1-Blue在Luria-Bertani培养基(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)中培养，37℃，200 rpm。C.谷氨酰胺在CGXII培养基中培养（3克/ 1 k_2.HPO_4.，1克/升_2.宝_4.， 2 g/L尿素，10 g/L (NH_4.)_2.所以_4.，2 g / l mgso_4.，200μg/ l生物素，5 mg / L硫胺素，10 mg / L钙泛酸钙，10 mg / L Feso_4.，1 mg / l mnso_4，1 mg / l znso_4.，200微克/升的硫酸铜_4.， 10 mg/L CaCl_2.和20克/升葡萄糖）[50.]提供15克/ L脑心脏输注（BHI [BD]）和7克/ L钙氨基酸。作为唯一的抗生素将卡那霉素（25μg/ ml）加入所有培养基中。

质粒构建

用于基因表达C.谷氨酰胺，pHCMS，高拷贝数质粒衍生物pCES208的，用作骨架质粒[39.］.使用C1000TM进行聚合酶链反应（PCR）热循环仪（Bio-Rad公司，里士满，CA，USA）和用PrimeSTAR HS DNA聚合酶（Takara Bio公司，志贺，日本）。为了表达SmPAL，本机SmPAL基因从pHB-104中扩增[36.]通过使用引物F-T7R-SmPAL和R-SmPAL（附加文件PCR4.：表S1）。用限制酶消化PCR产物XBA.我和不I和克隆到pHCMS中，产生pHCMS SmPAL，其中SmPAL基因在强合成启动子P_H36[40］.

蛋白质制备与分析

在摇瓶中30℃培养12小时后，通过离心（6000 rpm，10 min，4℃）收集细胞，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS；135毫米氯化钠，2.7毫米氯化钾，4.3毫米\（{\ text {na}} _ {{2}} {\ text {hpo}} _ {{4}} \），pH 7.2）中。然后，将细胞通过超声处理（7分钟，用5-S脉冲和3-S冷却时间，20％振幅）破坏。收集的总级分后，将不溶沉淀通过离心分离（13,000转，5分钟，4℃）除去，和将可溶性级分从上清液收集。用于SDS-PAGE分析，将蛋白质样品加载到12％聚丙烯酰胺凝胶。电泳后，将凝胶用考马斯亮蓝（50％[染色v / V.]甲醇，10％[v / V.]乙酸，1g / l coomassie亮蓝色r-250）为1小时，然后用剥离溶液抵抗（10％[v / V.]甲醇，10％[v / V.]乙酸)。使用Image Lab软件(Bio-Rad)进行密度分析。

摇瓶中的全细胞生物转化

分析T-CA在30°C下生产，C.谷氨酰胺将含有pHCMS SmPAL的菌株接种到BHI（BD）培养基中。12小时后，将细胞以1:100的稀释度转移到250 mL折流瓶中的50 mL半限定培养基中，并在30℃下振荡（200 rpm）生长。通过测量600 nm处的光密度（OD）来测定细胞生长₆₀₀）使用分光光度计（Optizen Pop; MeCasys，Daejeon，大韩民国）。细胞达到固定相后，通过在4℃下以6000rpm离心10分钟来收获它们。收获后，将细胞重悬于pH7.5的50ml 100mM Tris-HCl缓冲液中，并在摇动培养箱中孵育30分钟以达到30℃。然后，25ml 100 mm Tris-HCl缓冲液pH 7.5含有225mgL-phe将预热至30℃加入到细胞中。在摇动培养箱中以200rpm进行摇瓶中的所有转化反应。

为了比较各种反应温度的转化率，在收获细胞中重新悬浮在50ml 100mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）中并在摇动培养箱中孵育30分钟以达到目标温度。然后，25ml 100 mm Tris-HCl缓冲液pH 7.5含有225mgL-Phe预热至相应的目标温度下加入到细胞中。

为了评估不同pH条件下的转化率，在上述相同条件下收获细胞后，在不同目标pH值下重悬于50 mL的100 mM Tris-HCl缓冲液中。然后在摇瓶培养箱中孵育30 min至30℃。然后，取25 mL 100 mM的Tris-HCl缓冲液，在相应的pH值下加入225 mg的L-Phe，预热至℃加入到该单元30。

生物反应器中的全细胞生物转化

CoryneBacterium谷氨酰胺将PhCMS-SMPAL接种到BHI（BD）培养基中并培养12小时;然后，将细胞转移到200ml在四个250ml挡板烧伤中（每个烧瓶中50ml）中的半定义培养基。将所有种子培养物倒入5升罐生物反应器（Biocns，大韩民国）中的1.8升新鲜半定义的培养基。培养温度设定为30℃，直至细胞达到固定相。当细胞生长时，将pH调节至pH 7，用硫酸（当pH值高于7.06）或5M氨溶液或10米NaOH时（pH值低于6.97），具有在线监测。细胞达到固定相后，将温度升至50℃，将pH调节至pH 7.5或pH8.5。然后，在pH 7.5或pH8.5的pH 7.5或pH8.5下，1L 100mM Tris-HCl缓冲液L-Phe预热至℃，加入到生物反应器50。

高效液相色谱（HPLC）分析

测量…的数量L-phe和T-CA，通过在4℃下以13,000rpm离心5分钟，通过0.22μm注射器过滤器（Futecs，Daejeon，Korea）过滤上清液来沉积细胞。过滤的上清液在10％以10％稀释1:10（v / V.）乙腈并通过HPLC分析。HPLC系统（Shimadzu，京都，日本）由泵（LC-20AD），自动进样器（SIL-30AC），柱烤箱（CTO-20 A）和折射率检测器（RID-10a）组成，并配备Zorbax Eclipse AAA柱（150×4.6mm，3.5微米; Agilent Technologies，PA，CA，USA）。使用具有流动相A的二元非线性梯度分离样品（0.1％[v / V.[三氟乙酸[TFA])和流动相B(乙腈)。柱温保持在40℃，流速为1 mL/min。为L-phe分析，洗脱条件如下：（i）将柱与10％流动相B平衡6分钟，（ii）从10至70％的流动相B运行4分钟，（iii）在70维持流动％流动相B持续7分钟，（IV）从70至10％流动相B运行梯度3分钟，（v）用10％的流动相B洗涤5分钟。使用280nm的UV检测器检测样品。

为T-CA分析，洗脱条件如下：（i）将柱与10％流动相B平衡1分钟，（ii）从10至70％的流动相B运行梯度19分钟，（iii）从70开始梯度达到10％的流动阶段B 5分钟，（IV）用10％流动相B清洁3分钟。色谱软件实验室解决方案（Shimadzu，Kyoto，日本）用于样品采集和数据分析。使用UV检测器在210nm处检测样品。

转换使用基于膜的细胞回收模块

种子培养准备遵循与生物反应器培养相同的程序。然后，将种子培养物倒入1.8 L新鲜的半定义培养基中，置于5 L的瓶生物反应器(BioCNS)中。培养温度设置在30℃，直到细胞达到固定相。在细胞生长过程中，用10 M NaOH调节pH至pH 7 (pH低于6.97)，并在线监测。当细胞达到固定相后，将温度提高到50℃，用10 M NaOH调节pH至pH 8.5。然后，1 L 100 mM Tris-HCl pH 8.5缓冲液，含9 gL-Phe预热至℃，加入到生物反应器50。

使用5L生物反应器（Biocns）用于重复转化，工作体积为3L。生物反应器连接到横流微滤膜组件（Labio203,0.1μm; Philos，Gwangmyeong，Korea）。安装来自生物反应器的入口线，安装到生物反应器的出口线和来自膜组件的渗透线（图。5.a).在渗透管上安装压力表，监测跨膜压力，保持在40mmhg以下。压缩机的空气管路连接到模块的进口。系统中装配了一个5l的产品容器来收集渗透液。发酵液以380ml /min的速度通过微滤膜模块循环，并使用两个蠕动泵模型(Cole-Parmer Instrument, Vernon Hills, IL, USA)去除。每次运行后，用300ppm NaOCl清洗和消毒微滤膜。用消毒去离子水冲洗模块，去除残留的NaOCl溶液。每次实验前，生物反应器、进料容器和成品容器在121℃下蒸压15 min。

请联系相应的对数据的请求的作者。

L-苯丙氨酸：

L- 苯丙氨酸

T-CA:

trans- 肉桂酸

朋友：

苯丙氨酸氨裂解酶

SMPAL：

苯丙氨酸氨裂解酶海洋链霉菌

苏格兰皇家银行：

核糖体结合位点

IPTG：

异丙基-β-D-thiogalactopyranoside

不适用。

这项工作得到了韩国粮食、农业和林业技术规划与评价研究所(IPET)通过作物病毒和害虫反应产业技术开发计划的支持，由农业、粮食和农村事务部(MAFRA)资助(批准号:321109-04-1-HD020);NRF-2020R1A2C2012537)。

隶属关系

1. 化学和生物分子工程系，BK21加上计划，Kaist，291 Daehak-Ro，Yuseong-Gu，Daejeon，34141，大韩民国

   Jaewoo Son，Jun Hong Jang，在Hyeok Choi，Chang Gyu Lim，Eun Jung Jeon，Hyun Bae Bang＆Ki Jun Jeong

2. 研究所BioCentury，KAIST，291大学路，儒城区，大田，34141，大韩民国

   Ki 6月宋

贡献

JS和KJJ设计了整体实验，解释了数据并写了稿件。JS和EJJ进行了质粒建设。JS，JJH进行了培养和分析产品。JS，IHC，CGI和HBB分析了数据。JS和KJJ构思了该研究，修订了稿件，并批准了出版的最终版本。所有作者阅读并认可的终稿。

通讯作者

对应于Ki 6月宋．

伦理批准和同意参与

我们的稿子不报告从人或动物所收集的数据。

同意出版物

我们的稿件不包含任何形式的个人数据。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

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