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纤维素诱导蛋白1 (Cip1)Trichoderma Reesei.提高预处理木质纤维素的酶解性能

摘要

背景

Trichoderma Reesei.是目前商品化生产纤维素酶的主要菌株。纤维素诱导蛋白1 (Cip1)是植物胞外蛋白中含量最丰富的蛋白之一t . reesei.有关Cip1的文献报道主要集中在对Cip1的调控及其可能的酶活性,但尚未见Cip1对木质纤维素酶解的影响及其可能的机制的报道。

结果

在本研究中,来自t . reesei克隆、表达和纯化,并研究了其对几种预处理木质纤维素酶解的影响。结果表明,Cip1对预处理木质纤维素酶解有促进作用,且促进作用明显优于牛血清白蛋白(BSA)。特别是对于木质素含量较高的木质纤维素底物,如液体热水预处理的玉米秸秆和玉米芯渣,在添加等量蛋白质时,Cip1的促进效果甚至优于商用纤维素酶。金属离子Zn2+和铜2+影响了促进对酶水解的影响。CIP1蛋白没有裂解酶活性,但它可能破坏纤维素的晶体结构,并降低木质素对纤维素酶的非生产吸附,这部分解释了CIP1对木质纤维素酶水解的促进作用。

结论

Cip1从t . reesei能显著促进预处理木质纤维素的酶解,且Cip1对高木质素底物酶解的促进作用甚至高于工业纤维素酶。本研究将有助于我们更好地优化纤维素酶,提高其降解木质纤维素的能力,从而降低酶解所需酶的成本。

背景

木质纤维素生物质一直被认为是生产生物燃料和化学品的可持续来源[1].将木质纤维素生物转化为生物燃料(如乙醇)以部分替代化石燃料被认为是缓解能源危机和保护环境的一种切实可行的方法[2].在木质纤维素生物转化过程中,预处理木质纤维素酶水解为葡萄糖是一个重要步骤。文献中报道了降低酶解成本的不同策略,如开发有效的预处理方法[3.],筛选生产高效纤维素酶的微生物[4]酶和酶系统的工程改性[45,提高酶的回收效率[6)等。其中,开发高效、廉价的纤维素酶混合物是生物质转化的主要研究方向之一[7].

纤维素酶是由复杂的酶系统组成的混合物,通过多种酶的协同作用将纤维素完全水解为葡萄糖。主要包括三种糖苷水解酶:纤维生物水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和β-葡萄糖苷酶(BG)。EG作用于内部的纤维素链,产生游离链端。CBH将纤维素链从链端切开形成纤维二糖,而BG通过水解纤维二糖释放葡萄糖[8].此外,辅助蛋白的添加,如裂解多糖单加氧酶(lystic多糖monooxygenase, LPMO)、溶体素、Cip1和Cip2(分别为纤维素诱导蛋白1和2),也在木质纤维素的水解中起重要作用[91011121314].添加这些辅助蛋白是提高生物质酶水解效率的有效策略,从而减少了纤维素酶的使用和木质纤维素的糖化成本。例如,LPMO的添加有助于在高固体载荷下的生物质的快速液化,并减少纤维素酶剂量[10].通过促进基材的非晶化,添加溶胀蛋白通过促进底物的非晶化而改善了纤维素酶的可用性[11].Cip2能裂解4-甲酯O-甲基-d-葡萄糖醛酸,它在半纤维素-木质素交联的裂解中起作用[12].

纤维素诱导蛋白1 (Cip1)是细胞外分泌的主要蛋白之一t . reesei,相对含量约为7% [13].据报道,Cip1由一个碳水化合物结合模块(CBM)和一个功能未知的结构域组成[914].Forman等人。发现,对于各种各样的t . reesei具有不同纤维素酶的产能和不同生长条件的菌株,CIP1的调节与主要纤维素酶难以区分,尤其是CellobioHoHolaseCel7a [915].Xia等也报道了类似的结果,发现当纤维素酶(纤维生物水解酶CBHI和CBHII,内切葡聚糖酶EGVI)产量增加时,Cip1也高表达[16].Jacobson等鉴定了纯化的Cip1的潜在酶活性,发现被测植物细胞壁组分没有水解活性[14].此外,确定了Cip1核心结构域的晶体结构,结构同源性分析表明,Cip1与裂解酶具有高度的相似性[14].Lehmann等采用不同的酶混合物水解预处理玉米秸秆,通过偏最小二乘回归分析确定与水解性能最相关的蛋白质变异,发现Cip1与预处理玉米秸秆的酶性能高度相关[17]但是,这种结果来自模型模拟而不是实验,以及CIP1是否可以改善水解性能所需的进一步研究。到目前为止,CIP1的研究重点是蛋白质的调节及其可能的酶活性,并且猜测CIP1可以在复合纤维素基材的降解中起到相当大的功能(催化或碳水化合物结合)。然而,CIP1在木质纤维素酶水解中的功能和可能的机制尚未报道。理解CIP1在木质纤维素水解中的作用对于改性纤维素酶系统是重要的,以改善生物乙醇工业中使用的纤维素酶的水解效率。

在本研究中,Cip1基因t . reesei克隆并在低背景品系青霉属oxalicum.Cip1蛋白被纯化并用于几种预处理木质纤维素的酶解,用于研究Cip1在木质纤维素酶解中的作用。通过分析预处理底物中纤维素结晶度的变化、蛋白质对木质素的吸附等,推测了Cip1酶解木质纤维素的可能作用机制。我们认为该研究将为了解Cip1蛋白在木质纤维素酶解中的作用,改进纤维素酶体系提高纤维素酶水解效率,从而降低纤维素酶在木质纤维素生物转化中的成本提供非常有价值的参考。

材料和方法

材料

Avicel PH-101购自中国阿拉丁。将中国特兰集团提供的玉米芯(CC)和玉米秸秆(CS)机械粉碎,通过10目筛分,收集到塑料袋中混合使用。液体热水预处理玉米秸秆(LPCS)和氢氧化钠预处理玉米秸秆(NPCS)的制备方法是:将玉米秸秆切成2 ~ 3 cm段,分别用水或1%氢氧化钠(w/w)在150℃下处理1 h,然后用自来水冲洗。玉米芯残渣(CCR)是经稀酸处理后的玉米芯固体残渣,由山东长寿生物技术有限公司提供。

商用纤维素酶制剂SP是由中核化工有限公司(甘肃,中国)生产的固体酶粉末,其被发酵青霉属oxalicumJU-A10(一种抗性突变株)[13].

蛋白表达与纯化

Cip1蛋白来源于t . reesei(NCBI参考序列:XP_006961566.1)在具有低细胞外蛋白背景(本实验室前期构建)的菌株A11Δ中表达[18].将Cip1基因编码序列连接到携带淀粉酶基因启动子的质粒上15一个青霉属oxalicum的终结者trpC曲霉属真菌nidulans,和湿霉素B磷酸转移酶基因hph大肠杆菌.将构建的表达盒转化为蛋白表达株A11Δ。获得正确的重组菌株,在100 ml液体培养基(0.5%葡萄糖,1.5%淀粉,Vogel’s)中30℃发酵3天,过滤收集胞外蛋白。使用HisTrap™FF色谱柱(HisTrap, GE Healthcare, USA)纯化c端His6tag的重组蛋白Cip1。通过SDS-PAGE检测重组蛋白Cip1的分子量。根据制造商提供的协议,使用内糖苷酶H (Endo H, New England BioLabs, MA)对纯化的Cip1进行去糖基化。利用MALDI-TOF (APT, Shanghai, China)对目标频带进行截断和分析。Cip1-CD(非cbm区域)也通过上述方法表达和纯化。分离蛋白的纯度通过SDS-PAGE和SEC - HPLC(尺寸排除高效液相色谱)相结合的方法进行验证。以PBS缓冲液(pH 7.4)为洗脱液,在AKTA avant (GE Healthcare, Madison, WI, USA)上进行SEC-HPLC检测。 The flow rate was 0.5 ml/min and the detection wavelength was 280 nm.

酶法水解

酶解以5%干质量(DM)在pH为4.8的醋酸钠缓冲液(0.05 M)中进行,并加入1 mg/ml叠氮化钠。底物、酶和缓冲液混合在125 ml Erlenmeyer烧瓶中,反应体积为40 ml,在恒温空气浴摇床中,48℃,150 rpm进行水解反应。商业纤维素酶SP的用量为5 mg蛋白/g DM(约8个FPase单位/g DM)。在添加Cip1和BSA的实验中,Cip1和BSA蛋白的剂量为0.5 mg蛋白/g DM,蛋白浓度按Bradford法测定[19].

酶解至规定时间后,取一定量的酶解液,10000 rpm离心10 min, 0.22 μm滤器过滤得到上清液。采用岛津折射率检测器(岛津,京都,日本)通过高效液相色谱(HPLC)定量分析单糖的浓度。采用Bio-Rad HPX-87P色谱柱,以milliq水为洗脱液,78℃分离。流速为0.5 ml/min。

使用公式计算葡聚糖转换(1):

$ $葡聚糖\;转换~左(\ % \右)= \ \压裂{{葡萄糖\;发布\ \;水解左~ \({{\文本{mg}}} \右)}}{{衬底\;体重~ \离开({{\文本{mg}}} \右)葡聚糖\ \倍;内容左~ \(\ % \右)}}\乘以0.9 \ 100 \ % $ $
(1)

酶解过程中添加剂的增强系数(EC)由公式(2):

$$ eC \ left(\%\右)= \ frac {{ca - cc}} {{cc}} \ times 100 \%。$$
(2)

这里,CA和CC分别提到了有或没有添加剂的葡聚糖转换。

金属离子和EDTA的作用

为了评价金属离子和EDTA对Cip1的促进作用,0.4 M金属离子(Ni2+、镁2+、锌2+、铜2+)和EDTA溶液。金属离子和EDTA加入CCR的糖化系统(有或没有Cip1),最后的金属离子浓度和EDTA糖化系统4毫米。72 h的酶法水解后,水解液中葡萄糖浓度决心和葡聚糖转换计算。不添加任何金属离子和化学试剂作为对照。

纯化CIP1潜在活性分析

多糖裂解酶可以通过β-消除催化解聚反应,形成δ-4,5-不饱和末端,导致235nm处的吸光度的增加[20.2122].通过测定水解后上清液在235 nm处的吸光度来测定Cip1的裂解酶活性。分别于24 h、48 h、72 h提取含Cip1和不含Cip1酶解过程中的上清液,测量其在235 nm处的吸光度。同时,为了避免产物与纤维素酶对吸光度测定的干扰,我们还测定了单独使用Cip1的缓冲液(不添加纤维素酶)水解后235nm处的吸光度,并以不使用Cip1的相同程序作为对照。

不同的p-硝基苯基衍生物(Sigma,圣路易斯,美国),如p-Nitrophenyl -β-d-Glucopyranoside(pNPG),p-Nitrophenyl -d-cellobioside (p人大),p-Nitrophenyl -β-d木糖甙(pNPX)和p-Nitrophenyl -l-arabinofuranoside (pNPAf),以及羧甲基纤维素钠(原液生物技术有限公司,上海,中国),山毛榉材木聚糖(美国圣路易斯σ)和葡聚糖(原液生物技术有限公司,上海,中国)被用作测量基质净化的潜在活动Cip1根据文献中描述的方法(232425].所有活性测定均在0.05 M醋酸钠缓冲液(pH 4.8)中进行。

X射线衍射(XRD)分析

固体残留物通过过滤获得,并用50毫升蒸馏水清洗。然后对样品进行干燥和研磨,进行XRD分析。采用Bruker D8-Advance仪器(德国Bruker)进行分析,样品在2θ = 8°~ 2θ = 80°范围内扫描。数据采用MDI Jade 5.0软件进行分析。

木质素对纤维素酶的吸附

根据文献中所述的方法从LPCS中提取木质素26].简而言之,LPCS经过纤维素酶反复处理,直到残糖含量小于2%,再通过蛋白酶去除纤维素酶得到木质素。在1ml反应体系中加入木质素(0.03 g)和纤维素酶(10 mg/g木质素),在50 mM醋酸缓冲液(pH 4.8)中,在48℃,150 rpm的摇床速度下孵育24 h。在添加Cip1和Cip1- cd的实验中,Cip1和Cip1- cd蛋白的用量均为1 mg/g木质素。孵育后,将样品离心,用上清液进行不同酶活性分析。

分析方法

木质纤维素材料的化学成分,例如纤维素、木聚糖和木质素的含量,是根据NREL方法提供的方法测定的[27].参照文献方法测定滤纸活性(FPA)及CBH、EG、BG活性[232425].简而言之,以50 mg滤纸,1.5 ml醋酸缓冲液(pH 4.8, 0.05 M)为底物,在50℃下反应1 h,测定FPApNPC(借助d葡糖酸-d-内酯为抑制剂),羧甲基纤维素钠和p使用NPG作为底物以分别确定CBH,例如和BG的活性。将反应在0.05M乙酸盐缓冲液(pH4.8)中在50℃下进行30分钟。每分钟产生1μmol产物所需的酶量定义为酶活性单位。使用SPSS程序(版本22.0),使用学生的T检验进行控制和测试样本之间的差异统计分析。

结果与讨论

Cip1的表达和纯化

在这项研究中,一个低细胞外蛋白背景菌株A11Δ [18]用于表达CIP1(NCBI参考序列:XP_0069615666.1)t . reeseiQM6a。简而言之,将Cip1基因编码区克隆到载体K-hph-p15A中,转化到菌株A11Δ中。以淀粉为诱导剂制备重组蛋白Cip1,经HisTrap™FF柱纯化[28].SDS-PAGE分析表明,纯化CIP1的分子量为约46kd,如图2所示。1,高于计算分子量。经内糖苷酶H脱糖基化后,纯化的Cip1的分子质量降低(图)。1),表明纯化CIP1的分子量的增加应该是由于糖基化。通过质谱法进一步鉴定CIP1蛋白(数据未显示)。

图1
图1

CIP1的SDS-PAGE分析。泳道M:蛋白质标记;泳道1:纯化CIP1;泳道2和3:endo h治疗后的不同浓度的CIP1

Cip1对木质纤维素酶解的影响

在本研究中,我们选择了多种木质纤维素基质,包括玉米秸秆(CS)、液体热水预处理玉米秸秆(LPCS)、氢氧化钠预处理玉米秸秆(NPCS)、玉米芯(CC)和玉米芯残基(CCR)来评估Cip1蛋白对木质纤维素酶解的影响。底物的化学组成见表1.结果表明,CS中半纤维素和木质素的含量约为25%。CC的半纤维素含量高于CS。由于液体热水和酸预处理去除了大部分的半纤维素[26[分别为8.82%和5.01%,LPC和CCR的半纤维素含量分别为8.82%。对于NPC,作为碱预处理导致木质素溶解[29[NPC的木质素含量约为9.78%,但在NPC中保留更多的纤维素和半纤维素组分。利用具有不同化学组合物和底物的预处理的木质纤维素材料作为基材,通过将CIP1(0.5mg / g DM)添加到商业纤维素酶SP(5mg / g DM)和牛来研究CIP1对酶水解的影响。和牛血清白蛋白(BSA,0.5mg / g DM)被CIP1蛋白作为对照取代。数字2显示酶水解的葡聚糖转化为72小时,并计算纤维素酶SP酶水解上的辅助蛋白质的增强系数,并显示在表中2

表1不同预处理木质纤维素的化学组成
图2
figure2

添加BSA、商用纤维素酶SP和Cip1对CS (一个),LPC(b),NPC(c)、CC (d)、CCR (e)和Avicel (f)在24小时,48小时和72小时。其中,加入0.5mg / g DM的蛋白质剂量。标有**的数据表示有显着差异(P <0.05)和星号*意味着差异不显着(P> 0.05)

表2计算添加BSA、SP、Cip1对CS、LPCS、NPCS、CC、CCR、Avicel酶解72 h的增强系数

它是在Fig。2加入CIP1和BSA对酶水解的葡聚糖转化产生了一些影响,但对于木质纤维素的酶水解,加入CIP1后葡聚糖转化率增加。桌子2结果表明,Cip1蛋白对CS、LPCS、NPCS、CC和CCR酶解的增强系数分别为3.25%、10.75%、5.86%、3.65%和9.68%,明显高于BSA。特别是对于底物中木质素含量较高的LPCS和CCR, Cip1的加入有效地促进了木质纤维素的酶解。有研究表明,添加牛血清白蛋白可显著促进不同预处理方法预处理木质纤维素的酶解[30.31].本研究表明,Cip1对木质纤维素酶解底物的增强作用显著高于BSA,说明Cip1是一种更有效的木质纤维素酶解辅助蛋白。此外,它也被发现,葡萄糖不能被发现在玉米胚芽蛋白酶解物只有Cip1添加到上面的水解过程(结果未显示),这进一步表明,增加在葡聚糖转换Cip1除了是因为Cip1的促进作用与纤维素酶水解,而不是通过Cip1直接水解底物。

为了进一步评价Cip1对酶解的促进作用,我们在酶解体系中加入相同蛋白量(0.5 mg/g DM)的商用纤维素酶SP,并比较添加纤维素酶和Cip1对酶解的影响。实验结果如图所示。2和表2.结果表明,无论是添加Cip1还是添加纤维素酶SP,葡聚糖的转化率都有所提高,即添加Cip1和纤维素酶SP均能促进木质纤维素的酶解。对于木质素含量较高的预处理底物,如LPCS和CCR,添加Cip1对酶解的促进作用(增强系数分别为10.75%和9.68%)高于添加纤维素酶SP(增强系数分别为8.60%和8.00%)。但在NPCS等木质含量较低的预处理底物的酶解过程中,Cip1的添加促进作用较纤维素酶SP弱,尤其是Avicel,Cip1在酶法水解的促进效果显著低于纤维素酶SP。它应该归因于复杂的纤维素酶酶系统SP(例如,CBH,例如,BG等等),纯化Cip1蛋白相比,可以有效地降低Avicel高纤维素的结晶度。对于未经过预处理的木质纤维素如CC、CS,添加Cip1对水解的促进作用略弱于添加纤维素酶SP,但高于BSA。可能的原因是,除酶系统成分的影响外,未经预处理的原料细胞壁结构紧凑也影响纤维素酶的水解效率。结果表明,Cip1的加入能有效促进预处理木质纤维素材料的水解,特别是对于木质素含量较高的木质纤维素,如LPCS和CCR。也就是说,在相同的葡萄糖产率下,加入Cip1可以减少纤维素酶的用量,从而降低木质纤维素酶解的酶成本。另一方面,通过计算Cip1在24 h、48 h和72 h对LPCS和CCR酶解的增强系数,发现其维持在10%左右,说明Cip1在酶解过程中的促进作用相对稳定。

金属离子和EDTA对CIP1增强的影响

生物质的组合物是复杂的并且通常含有一些矿物质。此外,预处理过程中使用的预处理液体(通常用工业自来水制备)也可含有一定量的金属离子。许多研究表明,金属离子的存在可能影响酶的活性。一些金属离子增加酶活性,但一些金属离子导致酶活性的丧失[323334].

为了验证Cip1对木质纤维素酶解的促进作用是否与金属离子有关,本研究将Ni2+、镁2+、锌2+、铜2+在CCR的酶水解系统中加入最终浓度为4mm的EDTA,评价不同金属离子和EDTA的效果对CIP1的促进,如图2所示。3..与对照组相比,添加EDTA降低了CCR的葡聚糖转化率,但与添加EDTA相比,同时添加EDTA和Cip1对酶解仍有促进作用。由于EDTA对金属离子具有螯合作用,说明加入Cip1后葡聚糖转化率的提高并不依赖于金属离子。数字3.结果表明,与对照相比,Mg2+在酶解体系中,有利于在一定程度上提高酶解效率,但不影响Cip1对酶解的促进作用。一般来说,Mg的加入2+和倪2+对Cip1的促进作用影响不大。然而,锌2+和铜2+添加Zn后,葡聚糖的转化率显著降低(分别为18.7%和72.3%),同时也影响了Cip1对酶解的促进作用(与添加Zn相比)2+和铜2+单独添加Cip1,在Zn存在下葡聚糖转化率没有增加2+和铜2+)。

图3
图3

金属离子和EDTA对Cip1的促进作用。未加入任何金属离子和化学试剂作为对照,葡聚糖相对转化率为100%。在水解体系中,金属离子与EDTA的最终浓度为4 mM。用**和*标记的数据分别表示差异有显著性(p < 0.05)和无显著性(p > 0.05)

一些文献也报道了金属离子对木质纤维素酶降解的影响。Du等人的研究表明,Mg的添加2+能促进预处理玉米秸秆的酶解[35].微量锌2+和铜2+可能是酶活性所必需的,其作用为酶辅因子,以产生对酶的活化作用并促进酶活性[3637].例如,一些文献报道,GH61酶是一种独特的铜依赖氧化酶系列,并且需要GH61酶的最大活性2+38].然而,过量的锌2+和铜2+影响纤维素酶的空间结构,从而对酶的活性产生抑制作用[39].Wang等也报道Cu2+和菲3+抑制纤维素的水解[34].我们的研究表明,锌的存在2+和铜2+在酶水解体系中,严重影响了木质纤维素的水解效率和CIP1对酶水解的促进作用,也可能是由于纤维素酶活性位点的金属离子,这抑制了主要纤维素酶的活性[34].

CIP1潜在酶活性分析

Jacobson等通过结构同源性分析发现Cip1与来自的海藻酸裂解酶vAL-1结构相似性最高小球藻病毒和葡萄糖醛酶csgl来自h . jecorina14].Cip1预测活性位点的残基大多带电,与两种裂解酶高度相似[14,提示Cip1可能具有裂解酶活性。多糖裂解酶可以通过β消除催化解聚反应,在非还原端C4和C5之间形成双键产物。裂解酶的活性可以通过在235 nm处形成Δ-4,5个不饱和双键端[20.2122].

为了研究Cip1是否具有多糖裂解酶活性,我们获得了加入Cip1的CCR酶解液上清液,并测定其在235 nm处的吸光度。桌子3.结果表明,加入Cip1酶解后24 h、48 h和72 h上清液的吸光度与未加入Cip1酶解后上清液的吸光度基本一致。为了排除可能的干扰的酶法水解产品在235 nm的吸光度,我们只添加缓冲有或没有Cip1水解系统的基质(没有添加纤维素酶SP),和上层清液的吸光度从水解系统在24小时,48 h和72 h进行比较。在相同的反应时间内,它们的吸光度相似。这些结果表明,Cip1不表现出多糖裂解酶的活性,其促进水解的作用不应归因于多糖裂解酶的作用。

表3不同水解时间下,酶解CCR时上清液在235 nm处的吸光度

Cip1具有CBM,与主要纤维素酶共调控t . reesei15,提示Cip1可能在木质纤维素降解(碳水化合物结合或催化)中发挥重要作用。对纯化的cip1的其他可能与木质纤维素降解有关的酶活性也进行了分析p海中试验靶场,pNPC,pNPX,pNPAF,羧甲基纤维素,Beechwood木聚糖和葡聚糖作为基质。结果发现纯化的CIP1对不同底物的催化活性很少显示,这表明CIP1对酶水解的促进作用不是由上述常规纤维素酶和半纤维素酶活性引起的。

酶解后固体残渣的XRD分析

通过葡聚糖链之间的大量氢键形成纤维素的晶体结构。结晶结构降低了纤维素酶的可达性并减慢了糖化率,这是木质纤维素酶水解的不利因素[4041].目前,纤维素的晶体结构通常用x射线衍射(XRD)测定的结晶度指数(CrI)来表示[41].通过比较添加和不添加Cip1的纤维素酶或缓冲液酶解CCR固体残渣的x射线衍射谱,研究了Cip1对纤维素底物结晶的影响。如图所示。4,酶解72 h后,纤维素I的特征衍射峰分别出现在16°、22.5°和35°左右[424344].与单独用纤维素酶处理的底物相比,添加Cip1显著降低了22.5°下残基的衍射强度。桌子4还表明,在酶水解72小时后,CIP1添加导致固体残余物的相对结晶指数的降低(从37.47-33.12%)。另一方面,还测量了单独使用缓冲液和CIP1的水解和CIP1的固体残余物的X射线衍射光谱。4和表4还表明,在缓冲液中添加CIP1也可以降低残留物的相对结晶指数(41.00至40.13%)。这些结果表明CIP1可以破坏纤维素的晶体结构,从而通过纤维素酶促进基材的酶水解。另外,为了确定非CBM区域是否可以降低基材的结晶度,在CCR的酶促水解中加入CIP1-Cd,测定酶水解后固体残基的结晶指数的变化。桌子4表明CIP1-CD的添加也通过纤维素酶(从37.47-36.14%)中CCR的酶水解的残余物结晶指数降低。此外,为了排除其他杂质蛋白的可能干扰CIP1-CD的作用,我们通过SDS-PAGE和SEC-HPLC验证了CIP1-CD的纯度。附加文件1:图。S1和附加文件2图S2显示在SDS-PAGE和SEC - HPLC中分别只有一个波段和一个单峰。结果表明,结晶度的变化是由Cip1-CD引起的,而不是由其他杂质蛋白引起的。

图4
装具

用纤维素酶或缓冲液酶解CCR 72 h后固体残渣的XRD谱图,分别添加或不添加Cip1和Cip1- cd

表4添加或不添加Cip1和Cip1- cd的纤维素酶或缓冲液酶解CCR 72 h后固体残渣的结晶指数

CIP1对基材纤维素酶吸附的影响

木质素与纤维素酶的非生产性结合抑制了纤维素酶的活性,极大地阻碍了木质纤维素的降解效率。木质素诱导的非生产性结合被广泛认为是纤维素酶失活和酶可回收性差的主要原因[454647].在本研究中,首先用含Cip1和不含Cip1的纤维素酶水解CCR 72 h,离心获得水解产物上清液。数字5a显示,与未添加Cip1相比,添加Cip1后上清液的相对滤纸活性从17.93提高到22.15%,说明添加Cip1后水解体系中游离酶的活性有所提高。另一方面,以液态热水预处理玉米秸秆提取的木质素为原料,进一步研究了纤维素酶吸附木质素后,Cip1对上清液中不同纤维素酶活性的影响。数字5b显示,在添加Cip1之后,所有的上层清液中不同的纤维素酶的活动都有所改善,特别是CBH(相对活动已经从46.21%上升到39.53),如(相对活动已经从65.13%上升到60.93),平安险(相对活动已经从57.58%上升到51.59),而对BG活动的影响相对较小。以上结果表明,Cip1的加入可以减少纤维素酶蛋白对木质素的非生产性吸附,向上清中释放更多的游离纤维素酶,从而有利于提高纤维素酶对底物的水解效率。此外,还研究了Cip1-CD的作用。数字5a、b表明,仅添加Cip1-CD也略微提高了水解体系中上清液相对滤纸的活性(由17.93提高到19.47%),以及纤维素酶吸附到木质素后上清液中纤维素酶的不同酶活。统计分析表明,这些酶活性变化显著(p < 0.05),说明Cip1的非cbm区也可以减少纤维素酶蛋白对木质素的非生产性吸附。

图5
figure5

一个72h时上清液中相对滤纸的水解活性。b木质素吸附24 h后上清液中FPA、CBH、EG和BG的相对活性。用**和*标记的数据分别表示差异显著(p < 0.05)和不显著(p > 0.05)。反应0 h时的相对活性定义为100%

预处理是提高纤维素酶可达性和木质纤维素的酶水解性能的重要途径[48].然而,木质素的性质在预处理后改变,导致其纤维素酶的吸附能力较强。研究表明,纤维素酶对预处理木材木质素的吸附能力为未处理木材的2-6倍[47].因此,降低纤维素酶对木质素的非生产性吸附是提高木质纤维素降解效率的重要策略之一。我们的研究结果表明,添加Cip1可以减少纤维素酶对木质素的非生产性吸附(图1)。5a, b),这可能解释了为什么添加Cip1对木质素含量较高的LPCS和CCR酶解更有效。对于纤维素酶与底物的结合,碳水化合物结合模块(CBM)被认为是主要的结合域。纤维素酶的CBMt . reesei楔形折叠,其中平坦表面提供了与木质素密切相互作用的钥匙(芳香族)残留物[47].另外,CIP1的非CBM区域还可以将纤维素酶蛋白的不生产的吸附量降至木质素上(图。5a, b).我们推测Cip1在固有CBM和非CBM结构域共同作用下竞争吸附到木质素上,从而减少了纤维素酶对木质素的非生产性吸附,从而提高了纤维素酶的降解效率(如图所示)。6)。

图6
figure6

预测了Cip1促进木质纤维素酶水解的模型

结论

Cip1从t . reesei能显著促进木质纤维素酶解,且在相同蛋白量下促进效果高于BSA,但Cip1蛋白不表现出多糖裂解酶和各种纤维素降解酶的活性。特别是对于木质素含量较高的底物,如LPCS和CCR,在相同蛋白添加量下,Cip1对酶解的促进作用甚至高于商业纤维素酶。Cip1的促进可能与破坏纤维素的晶体结构和减少纤维素酶对木质素的非生产性吸附有关。这一发现有助于指导对菌株胞外分泌系统进行修饰,以提高纤维素酶降解木质纤维素的能力,从而降低酶解所需酶的成本。

数据和材料的可用性

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本公布的文章中。

缩写

Cip1:

纤维素诱导蛋白1

BSA:

牛血清白蛋白

CBH:

Cellobiohydrolase

例如:

内切葡聚糖酶

BG:

β葡糖苷酶

LPMO:

溶解性多糖单氧酶

CBM:

碳水化合物绑定模块

答:

玉米棒子

CS:

玉米秸秆

LPCS:

液体热水预处理玉米秸秆

npc:

Naoh预处理玉米秸秆

CCR:

玉米穗轴残留

高效液相色谱法:

高效液相色谱

p核计划组:

p-Nitrophenyl -β-d吡喃葡萄糖苷

pNPC:

p-Nitrophenyl -d-cellobioside

pNPX:

p-Nitrophenyl -β-d木糖苷

pNPAf:

p-Nitrophenyl -l-arabinofuranoside

平安险:

滤纸活动

XRD:

x射线衍射

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下载参考

确认

作者谨此感谢中国天然科学基金会的补助金,中国山东省自然科学基金,以及山东省重点研发项目。

资金

本研究在中国国家自然科学基金(No.31870562),中国山东省自然科学基金(ZR2018MC024,ZR2019ZD19)以及山东省重点研发项目(2019GSF107009,2019Jzzy020223)的财政基础。

作者信息

隶属关系

作者

贡献

HJ和JZ对项目进行了构思和设计。HJ, WS和XL进行了实验。HJ分析了数据。HJ和WS撰写了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到薛志李或者赵赵

道德声明

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者没有相互竞争的利益需要申报。

附加信息

出版商的注意事项

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

补充信息

附加文件1:图S1。

Cip1-CD的SDS-PAGE分析。M巷,蛋白质标记;Lane 1,纯化Cip1-CD。

附加文件2:图S2。

采用SEC-HPLC法测定Cip1-CD的纯度。

权利和权限

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贾洪,孙伟,李旭东。et al。纤维素诱导蛋白1 (Cip1)Trichoderma Reesei.提高预处理木质纤维素的酶解性能。MicroB细胞事实20,136(2021)。https://doi.org/10.1186/s12934-021-01625-z

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关键字

  • 木质纤维素
  • 纤维素酶
  • 酶法水解
  • 晶体结构
  • 纤维素诱导蛋白1