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生物降解氟胺酰胺GydF4y2BaEnsifer动因GydF4y2BaCGMCC 6315和拟丁腈酶的酶促表征GydF4y2Ba

抽象的GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

Flonicamid (GydF4y2BaNGydF4y2Ba-Cyanomethyl-4-三氟甲基丙酰胺,FLO)是一种新的吡啶胺杀虫剂,用于调节昆虫生长。由于其在水中的农业生产和高溶解度广泛应用,因此对水生环境和食物链造成潜在风险。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在目前的研究中,GydF4y2BaEnsifer动因GydF4y2BaCGMCC 6315显示有效地将FLO变为GydF4y2BaNGydF4y2Ba- (4-三氟甲基喹甲酰基)甘氨酸(TFNG-AM)通过由两个丁腈酶,PNHA和CNHA介导的水合途径。在纯文化中,休息细胞GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315在30℃(半衰期7.4小时半寿命中,在24小时内降低92%的0.87mmol / L Flo。自由和固定(通过凝胶珠,使用藻酸钙作为载体)GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315细胞在地表水中有效地降解了Flo。庞哈对我们的知识有所了解,最高报告的退化活动普及,GydF4y2BaV.GydF4y2Ba最大限度GydF4y2Ba = 88.7 U/mg (K.GydF4y2BamGydF4y2Ba= 2.96更易/ L)。铜离子的加入可使CnhA对FLO的酶活性提高4.2倍。结构同源建模表明残差GydF4y2BaβGydF4y2Ba-Glu56可以是用于PnhA和CnhA之间的酶活性所观察到的差异显著重要。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

应用GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2Ba可能是在地表水FLO的生物修复一个很好的策略。这项工作进一步加强了我们含腈杀虫剂的生物降解的酶促机制的理解,并提供有效的转化策略FLO污染的微生物修复。GydF4y2Ba

突出了GydF4y2Ba

  1. 1.GydF4y2Ba

    大肠的动因GydF4y2Ba有效地降低了通过水合途径杀虫剂FLO。GydF4y2Ba

  2. 2.GydF4y2Ba

    游离细胞和固定化细胞都能有效降解地表水中的FLO。GydF4y2Ba

  3. 3.GydF4y2Ba

    大肠的动因GydF4y2Ba腈水合酶CnhA和PnhA既水解FLO到TFNG-AM。GydF4y2Ba

  4. 4.GydF4y2Ba

    据我们所知,PnhA对FLO的降解活性最高。GydF4y2Ba

  5. 5.GydF4y2Ba

    关键残留(GydF4y2BaβGydF4y2Ba-GLU56)可能导致两种NHASE活动的显着差异。GydF4y2Ba

介绍GydF4y2Ba

Flonicamid (GydF4y2BaNGydF4y2Ba-cyanomethyl-4- trifluoromethylnictinamide, FLO)是一种具有选择性活性的新型系统杀虫剂,在害虫防治中表现出非常好的效果[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba].广泛应用于卷心菜、茶树、矮浆果作物和水果的叶面处理[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba].flo及其代谢物GydF4y2BaNGydF4y2Ba- (TFNG-AM),5-三氟甲基甲酰酸和4-(三氟甲基)甘氨酸在田间研究中检测到甘氨酸(TFNG-AM),甘氨酸甘氨酸[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba].在人类血清和尿液样本以及美国五大湖盆地周围的几个流域中也检测到FLO残留[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba].高剂量的FLO导致小鼠DNA降解和严重的基因组损伤[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba].由于它们在水中的高溶解度,这些化合物可以留在食物的可食用部分,进入食物链[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12GydF4y2Ba].环境中存在的这些长效化合物对人类健康构成潜在风险。GydF4y2Ba

农药微生物分解代谢是农药分解最重要、最有效的方法之一[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba].之前,我们已经证明微生物可能是影响土壤中FLO降解的主要因素之一[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba].GydF4y2BaMicrovirga flocculansGydF4y2BaCGMCC 1.16731,GydF4y2BaaminobacterGydF4y2Basp。CGMCC 1.17253,和GydF4y2BaEnsifer Meliloti.GydF4y2BaCGMCC 7333各自通过水合作用纯培养物将FLO转换为TFNG-AM [GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba];GydF4y2Ba粪产碱杆菌属GydF4y2BaCGMCC 17553可通过水解和水合途径转化FLO。有研究表明,FLO在土壤中的降解速度较快,DT值最大GydF4y2Ba90GydF4y2Ba(90%耗散初始浓度所需的时间)为1.5-8.7天,远低于100天的触发值[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba].每公斤土壤的干重,在LCGydF4y2Ba50GydF4y2Ba值为> 1000 mg,表明FLO对蚯蚓和土壤微生物的风险较低[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba].然而,FLO与DT相比,在水中和总水沙系统中具有更高的持久性GydF4y2Ba50GydF4y2Ba的分别30-37和36-44 d,值(GydF4y2Bahttps://www.ohp.com/labels_msds/pdf/pradia_sds.pdf.GydF4y2Ba).地表水环境中FLO的微生物修复尚未见报道。FLO的降解行为及其机理越来越受到人们的关注。GydF4y2Ba

腈的微生物降解通过两种酶的途径进行:(i)腈水合酶/酰胺酶途径和(ii)腈酶途径[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba].丁腈酶(NHase,EC 4.2.1.84)是微生物中腈代谢的关键酶之一。它催化腈水合在相应的酰胺中,并在有毒丁腈化合物的降解中显示出很大的应用潜力[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24GydF4y2Ba].NHases是由异常组成的异常GydF4y2Baα.GydF4y2Ba- - -GydF4y2BaβGydF4y2Ba- 在活性位点中具有非血红素熨斗(Fe-NHase)或非Contrin钴离子(Co-NHase)[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba].基因克隆和过表达分析鉴定出两种nasesGydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2Ba位于染色体(CNHA)和质粒(PNHA)上的CGMCC 6315,其负责转化Neonicotinoid acetamipriprid [GydF4y2Ba26GydF4y2Ba].然而,这些nase还没有完全的生物化学和结构特征。GydF4y2Ba

在这项研究中,我们采用免费和固定化GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315细胞用于修复水面水中的FLO。我们还表征了这种细菌的NHASES CNHA和PNHA;它们降解Flo,PNHA显示出高活性。这些结果提高了我们对氟氯化裂解的理解,并开发了氟于生物修复的良好药剂。GydF4y2Ba

材料和方法GydF4y2Ba

化学品和媒体GydF4y2Ba

Flo(C.GydF4y2Ba9.GydF4y2BaHGydF4y2Ba6.GydF4y2BaFGydF4y2Ba3.GydF4y2BaNGydF4y2Ba3.GydF4y2BaO,CAS登记号158062-67-0,95%纯度)从湖北Zhengxingyuan精细化工有限公司(武汉,中国)。TFNG-AM(CGydF4y2Ba9.GydF4y2BaHGydF4y2Ba8.GydF4y2BaFGydF4y2Ba3.GydF4y2BaNGydF4y2Ba3.GydF4y2BaO.GydF4y2Ba2GydF4y2Ba,如前所述制备CAS注册表No.158062-96-5,99%纯度[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba].高效液相色谱(HPLC)级乙腈由默克公司(Merck, Darmstadt, Germany)提供。所有其他试剂均为分析级,由生工生物技术(上海,中国)提供。GydF4y2Ba

LURIA-BERTANI(LB)培养基(10g / L NaCl,10g / l胰蛋白胨和5g / l酵母提取物,pH 7.2)用于培养所有GydF4y2Ba埃斯克里希亚洲GydF4y2Ba(GydF4y2Baes.GydF4y2Ba.)GydF4y2Ba科利GydF4y2Ba菌株。将LB的营养浓度稀释为1/15 LB,用于培养GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315GydF4y2Ba26GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

菌株和质粒GydF4y2Ba

大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315和GydF4y2BaES。科利GydF4y2BaRosetta(DE3)窝藏了GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315 nhase编码基因(GydF4y2BacnhAGydF4y2Ba和GydF4y2BaPnha.GydF4y2Ba)存放在我们的实验室[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27GydF4y2Ba].GydF4y2BaES。科利GydF4y2Ba以Rosetta (DE3) pLysS (Novagen, USA)为宿主菌株进行蛋白表达实验,以pET28a (+) (Novagen, Germany)为表达载体[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba].的登录号GydF4y2Baα.GydF4y2Ba亚基基因,GydF4y2BaβGydF4y2BaGenbank数据库中的-SubUnit基因和激活因子(编码PnHa的基因)分别是MH998515,MH998516和MH998517。的登录号GydF4y2Baα.GydF4y2Ba亚基基因,GydF4y2BaβGydF4y2Ba-亚单位基因和激活基因(编码CnhA的基因)分别为MH998512、MH998513和MH998514。GydF4y2Ba

休息细胞氟化的动力学GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315GydF4y2Ba

大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315接种于含20 mL LB培养基的100 mL烧瓶中,在30℃旋转摇床(220 rpm)中培养。孵育16 h后,将1 mL种子培养物接种到含有150 mL含CoCl的1/ 15lb培养基的500 mL烧瓶中GydF4y2Ba2GydF4y2Ba(0.1毫摩尔/ L终浓度),并培养72小时。细胞通过离心收获在7000×g下8分钟。获得的细胞沉淀物用50毫摩尔/ L磷酸钠缓冲液(pH7.5)中洗涤两次。将细胞密度调整至ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba= 5,然后用5 mL相同的含0.87 mmol/L FLO的缓冲液重悬。反应系统被放置在一个旋转振动筛上(220转),温度为30°C。每隔一段时间取样,12000 ×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba除去10分钟以除去细胞,并收集上清液,过滤并稀释至适合于通过HPLC分析FLO和代谢物的体积。GydF4y2Ba

FLO的生物降解表面水通过游离和固定化细胞GydF4y2Ba

从九仙湖,南京,中国湖北收集地表水样,然后通过灭菌0.22-μmmillipore过滤膜过滤。另外加入表面水样中的FLO。将含0.21mmol / L FlO含有0.21mmol / L FlO的水样(每种10ml)倒入100ml瓶中,然后静置细胞GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315加入到1×10的最终浓度GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba菌落(CFU) /毫升。以不添加细菌细胞的地表水作为对照。这些烧瓶在30°C, 120 rpm下培养。每隔24小时收集上清液,如上所述制备用于高效液相色谱分析[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

用于固定化细胞的FLO-降解的能力的检查,4种子毫升培养液转移到含有350毫升1/15 LB培养基1-L烧瓶中补充有氯化钴GydF4y2Ba2GydF4y2Ba(终浓度0.1 mmol/L)孵育3 d(30℃,200 rpm)。收集细胞,用50 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH 7.5)洗涤2次,最后悬浮在含有4%海藻酸钠的无菌去离子水中。将混合物彻底搅拌后倒入氯化钙中GydF4y2Ba2GydF4y2Ba(2%W / V),通过一个10毫升注射器的解决方案。的直径为约2-3毫米的凝胶珠形成并钙化24小时[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba].B.eads giving a final bacterial concentration of 1.25 × 109.GydF4y2BaCFU/mL转移到500 mL的烧瓶中,装100 mL地表水,含0.21 mmol/L FLO。这些烧瓶然后在30°C, 150转。在2-d的间隔,样品收集和制备HPLC分析如上所述。GydF4y2Ba

高效液相色谱和液相色谱-质谱分析GydF4y2Ba

采用Agilent 1260高效液相色谱系统对FLO及其代谢产物进行定量分析。HPLC体系采用安捷伦反相HC-C18色谱柱(4.6 × 250 mm)和反相C18前柱(4.6 × 20 mm)。流动相为含0.01%乙酸和乙腈的去离子水(水:乙腈,70:30 v:v)。以1 mL/min的流速洗脱,265 nm用Agilent G1314A紫外检测器检测。LC-MS分析使用安捷伦1290无极液相色谱仪(G1315B二极管阵列检测器)和安捷伦6460三重四极杆LC-MS系统(安捷伦技术)。LC-MS分析采用与HPLC相同的流动相,但流速为0.6 mL/min。GydF4y2Ba

FLO的生物降解通过搁置的细胞GydF4y2BaES。科利GydF4y2BaRosetta (DE3)过表达naseGydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315GydF4y2Ba

我们通过静止的细胞检查FLO降解能力GydF4y2BaES。科利GydF4y2BaPet28a-GydF4y2BaPnha.GydF4y2Ba(表达GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315 NHase PNHA)和GydF4y2BaES。科利GydF4y2BaPet28a-GydF4y2BacnhAGydF4y2Ba(表达GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315 nase CnhA)。GydF4y2BaES。科利GydF4y2Ba-pET28a细胞作为对照。首先,将细菌接种到含30 mL LB培养基的100 mL烧瓶中,在37°C, 220 rpm的旋转摇床中培养。孵育12 h后,取1 mL接种于500 mL含150 mL LB培养基的烧瓶中,孵育2.5 h(至OD值)GydF4y2Ba600GydF4y2Ba达到0.5)。然后异丙GydF4y2BaβGydF4y2Ba-GydF4y2BaD.GydF4y2Ba-1-硫代半乳糖苷加入到0.2毫摩尔/ L的终浓度。温育6小时后,将细胞通过离心以9000×收获GydF4y2BaGGydF4y2Ba8分钟。将细胞沉淀物用50毫摩尔/ L磷酸钠缓冲液(pH 7.5)。将细胞密度调整至ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba = 5 in 5 mL of the same buffer containing 0.87 mmol/L FLO. After transformation for 2 h, the samples were centrifuged at 10,000×GGydF4y2Ba8分钟以除去残留的细胞,并收集上清液,过滤,并稀释至合适的体积通过HPLC衬底和代谢物的分析。GydF4y2Ba

酶纯化和生物化学表征GydF4y2Ba

这两种重组nase的过表达和纯化的细节如我们之前的研究报道的[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31GydF4y2Ba].这GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315 nases分别在GydF4y2BaES。科利GydF4y2BaRosetta (DE3)带GydF4y2BaNGydF4y2Ba-terminal 6 × His-tag,根据色谱树脂制造商(Novagen Inc., Madison, WI, USA)的说明书,用亲和层析法纯化。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白表达,考马斯亮蓝R-250染色。分离凝胶和聚焦凝胶浓度分别为12.5%和5% (w/v)。GydF4y2Ba

为FLO的降解的最适反应pH值和温度,通过在pH 4-9测量在不同腈水合酶缓冲器活性来测定(柠檬酸盐缓冲液pH值4.0-6.0,磷酸钠缓冲液pH 6.0-8.0,的Tris-HCl缓冲液pH 8.0-9.0)和在20-70℃下,分别。为了测试腈水合酶活性的pH稳定性,将纯化的酶在4℃下在含有FLO-具有不同pH值,并测定剩余活性缓冲器预温育12小时。热稳定性通过在预温育20-70℃下酶2小时测定,测定残留的酶活性。加入EDTA,氯化钙后测定腈水合酶上活性的金属离子的影响GydF4y2Ba2GydF4y2Ba,Cuso.GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba, FeClGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba,mncl.GydF4y2Ba2GydF4y2Ba,ZnCl.GydF4y2Ba2GydF4y2Ba,NaCl,CoclGydF4y2Ba2GydF4y2Ba,或mgcl.GydF4y2Ba2GydF4y2Ba反应混合物的最终浓度为1 mmol/L。有机溶剂对NHase活性的影响是通过分别加入二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、环己烷或1-丁醇(体积比为2%)的反应混合物来测定的。分别在反应混合物中加入2 mmol/L FLO、acetamiprid (ACE)、thiacloprid (THI)、吲哚-3-乙腈(IAN)、3-氰吡啶(3-CP)、二氯苯腈、溴苯腈或氟虫腈,检测两种nhase的底物特异性,然后用高效液相色谱法测定。对于动力学分析,在37°C下进行一系列FLO浓度的反应。动力学常数在Origin 8.6软件中采用非线性回归分析(Michaelis-Menten)计算[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

使用HPLC分析测定NHase活性。NHase活性的一个单元(U)定义为催化1分钟内催化1μmolTFNG-am的酶的量。将总体积为1mL的反应在37℃下进行10分钟,并通过加入500μl乙腈淬灭。然后,将样品以10,000×离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba上清液用高效液相色谱法分析。GydF4y2Ba

半衰期测定GydF4y2Ba

FLO降解的半衰期值用ln(GydF4y2BaI / IGydF4y2Ba0.GydF4y2Ba)[根据方程ln(GydF4y2BaI / IGydF4y2Ba0.GydF4y2Ba)= - kt.GydF4y2Ba, 在哪里GydF4y2Ba一世GydF4y2Ba0.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba一世GydF4y2Ba分别表示初始浓度和残留浓度]。半衰期(GydF4y2BaT.GydF4y2Ba1/2GydF4y2Ba)计算为GydF4y2BaT.GydF4y2Ba1/2GydF4y2Ba = (ln2)/K.GydF4y2Ba, 在哪里GydF4y2BaK.GydF4y2Ba是明显的消除常数。一阶等式提供了令人满意的数据(R> 0.9)[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

nases的结构同源建模GydF4y2Ba

NHASE的结构同源性模型GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315由Phyre2 (GydF4y2Bahttp://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/GydF4y2Ba)和瑞士型号网站(GydF4y2Bahttps://swissmodel.expasy.org/interactiveGydF4y2Ba).nase亚基的晶体结构GydF4y2Ba热假GydF4y2Ba和GydF4y2Ba恶臭假单胞菌GydF4y2Ba(PDB登录代码4ob1.1.a,3qyg.1.b,3qxe.1.a和3qz9.1.b)[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36GydF4y2Ba用作模板GydF4y2Baα.GydF4y2Ba- PnhA的亚基GydF4y2BaβGydF4y2Ba- PnhA的亚基GydF4y2Baα.GydF4y2Ba亚单位CnhA,而GydF4y2BaβGydF4y2Ba分别为CNHA。全球模型质量估计(GMQE)和定量模型能量分析(Qmean)用于评估构建的NHase结构的质量[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

结果和讨论GydF4y2Ba

FLO退化的动力学GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315及其代谢产物鉴定GydF4y2Ba

大肠的动因GydF4y2Ba通过HPLC分析,CGMCC 6315将FLO代谢为一个表观极性代谢物,保留时间为3.25 min(图)。GydF4y2Ba1GydF4y2BaA),对应于TFNG-AM在LC-MS中的保留时间。这个峰在底物或细菌对照中没有出现(图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaA).在负离子模式下的质谱(图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaB和C),代谢物和底物具有峰值GydF4y2Bam / z.GydF4y2Ba分别为246和228,对应于[M−H]GydF4y2Ba−GydF4y2Ba离子。在GydF4y2Bam / z.GydF4y2Ba146.2,与c一致GydF4y2Ba6.GydF4y2BaHGydF4y2Ba5.GydF4y2BaNFGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba在之前的研究中已经报道了[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba].有些报道表明TFNG-AM和FLO的分子量为247和229 [GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba].因此,FLO的代谢产物被确定为TFNG-AM。这些结果表明,GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315可以通过水合作用来将FLO浮动到TFNG-AM。GydF4y2Ba

图1GydF4y2Ba
图1GydF4y2Ba

HPLC和LC - MS分析。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba用高效液相色谱法分析了FLO的降解GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315。GydF4y2BaB.GydF4y2BaTFNG-AM的负离子质谱。GydF4y2BaCGydF4y2BaFLO的负离子质谱GydF4y2Ba

静息的细胞GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315在24 h内将FLO从初始浓度0.87 mmol/L降解到0.07 mmol/L (FLO降解率为92%)。GydF4y2Ba2GydF4y2BaA.同时生成0.79 mmol/L的TFNG-AM(摩尔转化率98.8%)。因此,TFNG-AM是FLO水解的主要产物。FLO的半衰期存在GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315降解FLO的时间仅为7.4 h,明显缩短GydF4y2BaA.粪便GydF4y2BaCGMCC 17553(15小时),GydF4y2Ba大肠melilotiGydF4y2BaCGMCC 7333(60小时),和GydF4y2BaaminobacterGydF4y2Basp。CGMCC 1.17253(178.8小时)[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba].所以,GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315对于氟污染环境的微生物恢复可能更有利。在各种微生物中的氟浮削和常见水果作物中的Flo代谢物的代谢途径示于图2中。GydF4y2Ba2GydF4y2BaB.GydF4y2Ba

图2GydF4y2Ba
图2.GydF4y2Ba

一种GydF4y2Ba弗洛生物降解的GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315纯培养GydF4y2BaB.GydF4y2Ba提出代谢途径GydF4y2Ba

游离和固定化降解地表水中FLO的研究GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315个细胞GydF4y2Ba

FLO极易溶于水,可残留在进入食物链的作物可食用部分[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba].GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2Ba将CGMCC 6315接种到地表水中以检查其降解FLO的能力。孵育4d后,从图3中的初始值0.21mmol / L至0.01mmol / L(95.2%降解)中的氟烷含量降低。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaA.未接种细菌的对照对FLO无活性。GydF4y2Ba

图3GydF4y2Ba
图3.GydF4y2Ba

FLO降解的时间过程GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315在地表水中。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba游离细胞;GydF4y2BaB.GydF4y2Ba以海藻酸钙为载体的凝胶珠固定化细胞GydF4y2Ba

大肠的动因GydF4y2Ba还制备了使用藻酸钙固定的CGMCC 6315细胞,其用藻酸钙作为载体制备用于评估表面水中的氟化物降解能力。对照珠子在前2d上吸附了一些浮渣;吸附11.1%的初始FLO(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaB).固定化细胞在孵育11 d后降解78.9%的FLO。这些结果表明,GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315具有降解地表水中的浮渣。当使用游离细胞降解废水处理中有毒物质时,存在难以处理,细胞密度降低的问题,以及减少适应和渗透率的问题。然而,细胞固定化技术可以提供防止苛刻的环境条件并延长微生物的存活[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba].微生物细胞的固定化在废水处理领域引起了越来越多的关注[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba].与常规废水处理系统相比,固定化细胞系统具有高电位降解有毒化学物质。此外,生物处理的成本比物理和化学方法[低得多GydF4y2Ba38GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

我们之前分离了一株有效的硫虫啉降解菌株,GydF4y2BaM. flocculansGydF4y2BaCGMCC 1.16731,其表现出水面水中的弱氟化物降解能力,但固定细胞几乎没有降解Flo(数据未显示)[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba].作为氮素固定细菌,适用GydF4y2BaM. flocculansGydF4y2Ba通常仅限于微生物-植物联合修复。GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2Ba作为一种氮素固定和植物生长的促进流虫,是土壤和水环境的常见居民,并表现出分解复杂有机污染物的巨大潜力[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba].Zhou et al. [GydF4y2Ba27GydF4y2Ba)报道,GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2Ba发生故障的农药噻虫嗪和产生的次级代谢产物是植物生长和发芽有益的。在目前的研究中,GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315显示能够从地表水中去除Flo。GydF4y2Ba

nases的生物信息学分析GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315,NHASE的表达GydF4y2BaES。科利GydF4y2BaRosetta (DE3)和FLO降解GydF4y2Ba

ES。科利GydF4y2Ba罗塞塔(DE3) overexpressingGydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2Ba在我们之前的研究中构建了CGMCC 6315 NHase基因[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba].GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315含有编码两种腈水解酶的基因,在质粒上编码染色体上的一种(CNHA)和另一种(PNHA)。他们的NHase基因簇组合物GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315GydF4y2Ba⟨GydF4y2Baα亚基GydF4y2Ba⟩GydF4y2Ba那GydF4y2Ba⟨GydF4y2Baβ亚基GydF4y2Ba⟩GydF4y2Ba,GydF4y2Ba⟨GydF4y2Ba激活蛋白GydF4y2Ba⟩GydF4y2Ba.GydF4y2BacnhAGydF4y2Ba有基因结构GydF4y2Baα.GydF4y2Ba亚基(648个基点),GydF4y2BaβGydF4y2Ba亚基(660碱基对),和激活蛋白(375碱基对)。有一个四碱基(ATGA)之间的重叠序列GydF4y2Baα.GydF4y2Ba亚基,GydF4y2BaβGydF4y2Ba-SubUnit基因,并且之间存在重叠的14个碱基(TTGAACACGTAA)的序列GydF4y2BaβGydF4y2Ba-亚基基因和激活基因,这与我们之前的报道相似GydF4y2Ba大肠melilotiGydF4y2BaCGMCC 7333腈水合酶(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种)。GydF4y2BaPnha.GydF4y2Ba有基因结构GydF4y2Baα.GydF4y2Ba亚基(648个基点),GydF4y2BaβGydF4y2Ba亚基(657碱基对),和激活蛋白(360碱基对)。之间的重叠序列GydF4y2Baα.GydF4y2Ba亚基,GydF4y2BaβGydF4y2Ba-亚基基因仅仅是碱基“A”,它不同于四个碱基GydF4y2BacnhAGydF4y2Ba那GydF4y2Ba大肠melilotiGydF4y2BaCGMCC 7333 NHase,GydF4y2BaVariovorax硼氨氨磺酸GydF4y2Banase [GydF4y2Ba28GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33GydF4y2Ba],以及之前报道的腈水合酶的所有其他重叠序列。GydF4y2Ba

图4GydF4y2Ba
图4.GydF4y2Ba

表达式GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315 PNHA和CNHA INGydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba.(a)NHase基因簇的比较GydF4y2Ba大肠melilotiGydF4y2BaCGMCC 7333,GydF4y2Ba五boronicumulansGydF4y2BaCGMCC 4969,GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315。GydF4y2BaB.GydF4y2BaSDS-PAGE分析表达GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315 nases在GydF4y2BaES。科利GydF4y2Ba.泳道M,蛋白质分子量标记物(116,66.2,45,35,25和18.4 kDa的);泳道1和2,从总可溶性蛋白GydF4y2BaES。科利GydF4y2Ba控制细胞;通道3和4,总和可溶性蛋白质来自GydF4y2BaES。科利GydF4y2Ba细胞表达GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315 CNHA;泳道5,纯化CNHA;车道6和7,总和可溶性蛋白质来自GydF4y2BaES。科利GydF4y2Ba细胞表达GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315 PNHA;泳道8,纯化的pnhaGydF4y2Ba

基于NHase氨基酸序列的系统发育分析GydF4y2Baα.GydF4y2Ba-亚单位表明,CnhA与其他FLO降解菌的nase聚集在一个分支中,GydF4y2Ba大肠melilotiGydF4y2BaCGMCC 7333和GydF4y2BaaminobacterGydF4y2BaspGydF4y2Ba.GydF4y2BaCGMCC 1.17253 [GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33GydF4y2Ba],82.33和74.42%的蛋白质序列相似。比较GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315 PnhA和CnhA的酶GydF4y2Ba大肠melilotiGydF4y2BaCGMCC 7333的蛋白相似性分别为51.63%和82.33%。GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315 PNHA和CNHA聚集在不同的分支中,表明进化分歧(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S1)。GydF4y2Ba

SDS-PAGE分析表明,CnhA的溶解性良好(图GydF4y2Ba4.GydF4y2BaB,泳道4)。与此相反,PnhA较少可溶性和观察更多的包涵体(图GydF4y2Ba4.GydF4y2BaB,泳道7)。泳道5和8分别代表纯化的CNHA和PNHA。未观察到活化剂蛋白条带。我们推测的原因可能是活化剂蛋白的低表达水平,其类似于先前报道的GydF4y2BaMF.GydF4y2Ba来自另一种氟化物细菌的NHase,GydF4y2BaM. flocculansGydF4y2BaCGMCC 1.16731 [GydF4y2Ba32GydF4y2Ba].静息的细胞GydF4y2BaES。科利GydF4y2BaPet28a-GydF4y2BaPnha.GydF4y2Ba和GydF4y2BaES。科利GydF4y2BaPet28a-GydF4y2BacnhAGydF4y2Ba分别表现出氟浮削活性,而控制细胞(GydF4y2BaES。科利GydF4y2Ba-pET28a)对FLO没有活性。结果表明,PnhA和CnhA均通过水合作用将FLO降解为TFNG-AM。GydF4y2Ba

酶促表征GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315 CNHA.GydF4y2Ba

CnhA水合FLO的最佳pH值为8.0(图2)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa),酶活性达到最高。在pH 5.0,酶活性仅为最大活性的47.6%,而它显着抑制氟化合金52.4%。在不同pH 5-9下对12小时的CNHA预孵育仅对氟碱活性的略微影响;残留活性仍然存在> 95.6%(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab)。CnhA在50℃下显示出它的最大FLO降解活性。当反应温度升高到60℃,酶的活性显着降低(图GydF4y2Ba5.GydF4y2BaC).当纯酶在> 40°C预孵育2 h时,活性显著下降。在60℃预孵育2 h后,CnhA几乎没有活性(图2)。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaD)。当预孵育温度超过40°C时,GydF4y2BaaminobacterGydF4y2Basp。CGMCC 1.17253 NHase活性也显着降低,如CNHA [GydF4y2Ba17GydF4y2Ba].PnhF从GydF4y2BaM. flocculansGydF4y2Ba将CGMCC 1.6731在20-60℃下预孵育2小时,残留活性保持在约60%[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

图5GydF4y2Ba
图5.GydF4y2Ba

酶促表征GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315 CnhA和PnhA。GydF4y2Ba一种GydF4y2BapH对CnhA和PnhA活性的影响。GydF4y2BaB.GydF4y2BapH对CnhA和PnhA稳定性的影响。GydF4y2BaCGydF4y2Ba温度对CnhA和PnhA活性的影响。GydF4y2BaD.GydF4y2Ba温度对CnhA和PnhA稳定性的影响。GydF4y2BaE.GydF4y2Ba金属离子和金属离子的影响GydF4y2BaFGydF4y2Ba有机溶剂对CnhA活性的影响。GydF4y2BaGGydF4y2Ba金属离子和金属离子的影响GydF4y2BaHGydF4y2Ba上PnhA的活性的有机溶剂。酶测定法中使用FLO作为基材。平均值和标准偏差从一式三份样品计算从三个平行培养物(GydF4y2BaNGydF4y2Ba= 9)。各栏上方不同的字母(a-f)表示在GydF4y2BaP.GydF4y2BaDuncan检验≤0.05GydF4y2Ba

添加许多类型的金属离子略有促进FLO水合的CNHA活性。然而,引人注目,加入铜GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba离子4.2倍增加的活性与对照处理(没有添加金属离子)(图进行比较。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaE)。此优惠活动由铜GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba未发现其他flos降解细菌(GydF4y2BaA.粪便GydF4y2BaCGMCC 17553,GydF4y2BaaminobacterGydF4y2Basp。CGMCC 1.17253,GydF4y2Ba大肠melilotiGydF4y2BaCGMCC 7333和GydF4y2Ba五boronicumulansGydF4y2BaCGMCC 4969)[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28GydF4y2Ba].我们推测,铜GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba离子可促进酶的折叠,从而形成腈水合酶的较大量的正确构象,并因此增加了酶的活性[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba].有机溶剂中,DMSO和乙醇对CnhA水合FLO活性的抑制率分别为20.1%和24.75%。丙酮使FLO的水化活性提高了1.54倍(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaF)。GydF4y2Ba

动力学参数的分析表明,CnhA FLO降解过程与米氏动力学符合(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S2)。米氏常数为5.07 mmol/LGydF4y2BaV.GydF4y2Ba最大限度GydF4y2Ba9.55 U /毫克。米切里斯常数GydF4y2BaV.GydF4y2Ba最大限度GydF4y2BaPNHF来自GydF4y2BaM. flocculansGydF4y2BaCGMCC 1.16731涉及来自Flo的TFNG-AM的形成为32.9mmol / L和5.9 U / mg(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba),说明CnhA对FLO的亲和力高于PnhF。GydF4y2Ba

表1弗洛降解菌纯化酶的生化特性GydF4y2Ba

酶的特性表明GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCnhA具有显着的耐受性的范围内的pH,金属离子和有机溶剂的,并且可以具有应用潜力在修复环境污染。Oves等。[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba)报道,GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaOS3不仅可以在实验室条件下生成95%的NI和74%的PB;它还可以生产和分泌植物促进生物质。周和太阳[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27GydF4y2Ba)报道,GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315可降解噻虫嗪,啶虫脒和新烟碱类,促进大豆的盐胁迫下的发芽率。GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2Ba已广泛用于农业生产,但其在农药污染物的修复中的应用仍然比较少见。GydF4y2Ba

酶促表征GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2Ba6315年CGMCC PnhAGydF4y2Ba

PnhA水合FLO的最佳pH为6.0(图6)。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa),酶活性达到最高。在pH 5.0处,PNHA活性仅保留了最大活动的2.43%。pH 5-9缓冲液在pH5-9缓冲液中对12小时的PNHA预孵育对普通酶活性略微效果;残留活性> 86.98%(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bab)。PNHA显示其在50°C的FLO上的最大活动;酶在70℃下仅显示最大活性的23.38%(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaC)。当酶在> 40℃下预孵育2小时时,其活性显着下降;实际上,在≥50℃的预孵育后几乎没有活性(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaD)。GydF4y2Ba

在金属离子的加入上,除Mg外,所有被测离子GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba,Zn.GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba和铜GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba抑制PnhA对FLO的降解活性。添加锌GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba和铜GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba与对照处理相比,离子将活性增加1.2-和1.26倍(没有添加的金属离子)(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaG)GydF4y2Ba2+GydF4y2Ba也发现了CNHA的离子。但是,显然,铜的促进作用GydF4y2Ba2+GydF4y2BaCnhA上的离子含量远高于PnhA。与CnhA相比,所有有机溶剂均抑制PnhA对FLO的活性。其中,与对照处理相比,乙酸乙酯和乙醇的抑制率分别为91.68%和53.85%。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba这些结果表明PnhA对有机溶剂更加敏感。GydF4y2Ba

动力学参数分析表明,PNHA荧光降解的过程符合Michaelis-Menten动力学(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S2)。米氏常数为2.96 mmol/LGydF4y2BaV.GydF4y2Ba最大限度GydF4y2Ba是88.7 u / mg。这GydF4y2BaV.GydF4y2Ba最大限度GydF4y2BaNitA、NitD、PnhF和GydF4y2BaaminobacterGydF4y2Basp. CGMCC 1.17253 NHase参与FLO形成TFNG-AM的含量分别为0.58 U/mg、0.18 mU/mg、5.9 U/mg和14.98 mU/mgGydF4y2Ba1GydF4y2Ba),多比下GydF4y2BaV.GydF4y2Ba最大限度GydF4y2BaPnhA。据我们所知,PnhA对FLO的降解活性是目前报道的最高的。GydF4y2Ba

CnhA和PnhA均能降解FLO、THI、3-CP、IAN和ACE。PnhA对THI、3-CP和ACE的活性远高于CnhA,但对IAN的转化能力远低于CnhA(表)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba).我们推测这是因为IAN的结构,这意味着它比PNHA更容易结合到CNHA的活性点袋。NHAse均未对氟罗尼尔,二氯甲酸或溴洛尼尔(表)没有降解活性(表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba).我们的研究结果表明,CnhA和PnhA都表现严格的底物特异性。GydF4y2Ba

表2纯化CNHA和PNHA的底物特异性GydF4y2Ba

PnhA和CnhA的同源建模GydF4y2Ba

模板和模板之间的氨基酸序列相似性GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315蛋白的感兴趣亚基分别为39.18%、36.87%、62.87%和44.91%GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S3)。GMQE值分别为0.15、0.75、0.80和0.78,QMEAN值分别为−3.41、−3.47、−0.24和−2.10。GMQE取值为0 ~ 1之间的数字,数值越大表示可靠性越高。QMEAN值接近0,表明模型结构与相似尺寸的实验结构吻合较好;−4.0或以下表示模型质量较低[GydF4y2Ba42GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

PnhA和CnhA的三维结构模型示于图GydF4y2Ba6.GydF4y2BaA, b,金属配位球GydF4y2Baα.GydF4y2Ba-SubUnit PNHA涉及残留CYS115-THR116-LEU117-CYS118-SER119-CYS120(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaC)。Cys118和Cys120坐标钴离子,分别翻译成氧化成亚硫酸和硫酸。在CNHA的α-亚基中,残留物Cys116-Thro117-Leu118-Cys119-Ser120-Cys121在钴离子的配位球中;CNHA的CYS119和CYS121与PNHA的CYS118和CYS120相同的角色(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bad)[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba那GydF4y2Ba44GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45GydF4y2Ba].这些残基的翻译后氧化也已经在NHases观察到GydF4y2BaM. flocculansGydF4y2BaCGMCC 1.16731和GydF4y2Ba链canusGydF4y2BaCGMCC 13662 [GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

图6GydF4y2Ba
图6.GydF4y2Ba

相同的模型GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315 PnhA和CnhA。GydF4y2Ba一种GydF4y2BaPnhA,GydF4y2BaB.GydF4y2BaCNHA。预测关键有效位点残留物GydF4y2BaCGydF4y2BaPnha和GydF4y2BaD.GydF4y2BaCnhA被标记,钴离子被显示为一个浅粉色的球体GydF4y2Ba

第二电子层的残留物GydF4y2BaβGydF4y2Ba-glu56和GydF4y2BaβGydF4y2Ba-His147中的催化活性(远离活性位点)中发挥重要作用GydF4y2BaP. Pivida.GydF4y2BaNHase [GydF4y2Ba36GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46GydF4y2Ba].关键的氨基残留glu-56存在于此GydF4y2BaβGydF4y2Ba亚基的GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaPnhA(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaC)。然而,在CNHA中未发现相应的氨基残基。PNHA和CNHA均可转化FLO,但PNHA的比活性远高于CNHA。我们推测CNHA可能缺乏其他关键残留物,导致酶活性的差异很大。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

在这项研究中,我们发现GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315能有效降解杀虫剂FLO,表明该细菌的两种NHases PnhA和CnhA介导FLO水解为代谢产物TFNG-AM。自由和固定GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2Ba发现CGMCC 6315细胞有效地降解了地表水中的FLO。PNHA对任何NHASE报道的FLO具有最高的降解活动。CNHA更耐受各种pH,重金属离子和有机溶剂。这些调查结果可以有助于为氟污染的微生物修复产生有效的策略。GydF4y2Ba

数据和材料的可用性GydF4y2Ba

在这项研究中产生的或分析所有的数据都包括在此发表的文章和其他文件英寸GydF4y2Ba

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致谢GydF4y2Ba

我们感谢礼文便即,理文集团(中国)(GydF4y2Bawww.liwenbianji.cn/GydF4y2Ba),以编辑本手稿的英文初稿。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

国家自然科学基金资助项目(no . 31970094, no . 32000063);江苏省优秀科技创新团队资助项目(no . 17CXTD00014)。GydF4y2Ba

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yxz:调查,监督,写作原稿草案;LW,KXC,N-DJ:监督;SLS:监督,资金收购;FG:资助收购,审查和编辑;Y-JD:监督,资助收购,审查和编辑。所有作者阅读并批准了最终的手稿。GydF4y2Ba

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对应于GydF4y2Ba冯通用电气GydF4y2Ba或GydF4y2Ba易菌袋GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

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不适用。GydF4y2Ba

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所有作者阅读并批准了最终的手稿。GydF4y2Ba

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出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

补充信息GydF4y2Ba

附加文件1:图S1。GydF4y2Ba

NHases的系统发育分析;GydF4y2Ba图S2。GydF4y2Ba催化FLO降解反应的动力学参数GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315 PnhA和CnhA;GydF4y2Ba图S3。GydF4y2Ba序列比对GydF4y2Ba大肠的动因GydF4y2BaCGMCC 6315 NHases PnhA和CnhA与来自NHases的序列GydF4y2Ba热假GydF4y2Ba和GydF4y2Ba恶臭假单胞菌GydF4y2Ba用作同源模拟的模板。GydF4y2Ba

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开放获取GydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证,这允许在任何中或格式中使用,共享,适应,分发和复制,只要您向原始作者和来源提供适当的信贷,提供了一个链接到Creative Commons许可证,并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明,否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中,除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中,法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用,您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本,请访问GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba.创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本文中提供的数据,除非另有用入数据的信用额度。GydF4y2Ba

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关键词GydF4y2Ba

  • 生物降解GydF4y2Ba
  • 细胞固定化GydF4y2Ba
  • Ensifer动因GydF4y2BaCGMCC 6315GydF4y2Ba
  • 酶促劣化GydF4y2Ba
  • FlonicamidGydF4y2Ba