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与Ecoflex的合成覆盆子酮途径的重构GydF4y2Ba

抽象的GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

合成生物学的一个关键重点是开发以微生物或无细胞为基础的生物路线,以增加香料等化学品的附加值。最初,我们开发了EcoFlex系统,一个金门工具包,以研究基因/路径灵活使用GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba异源表达。在本前的工作中,我们寻求使用Ecoflex来优化合成覆盆子酮生物合成途径。覆盆子酮是高价值(〜20,000公斤GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba)从覆盆子养殖的精细化学品(GydF4y2BaRubeus rubrum.GydF4y2Ba) 水果。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

通过应用合成生物学主导的设计-构建-测试-学习循环方法,我们重构了低生产率(0.2 mg/L)的树莓酮途径,实现了65倍(12.9 mg/L)的产量提高。我们在原型水平上执行这个优化(使用微量滴定板培养)GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaDH10β作为常规克隆宿主。指某东西的用途GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaDH10β有助于筛选组合库的金门克隆过程。此外,我们还新建了一种新型的基于颜色的表型筛选,可快速从固体/液体培养中鉴定生产性克隆。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们的研究结果提供了一种稳定的树莓酮途径,该途径依赖于天然原料(l -酪氨酸),并且仅使用组成型启动子来控制基因表达。总之,我们展示了EcoFlex对精细化学途径模型进行微调的能力,并提供了一系列新特征的启动子工具基因表达GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

介绍GydF4y2Ba

合成生物学旨在重构合成途径 - 以细胞的需要增长和分裂 - 因为它寻求向增值的化学品和生物药物提供生物皂理路线。最近的例子包括香草蛋白[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba],薄荷醇[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba和青蒿素等半合成药物[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]和紫杉醇[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba].工程精细化学路径的底盘,如GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba,经常破坏细胞稳态[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba].在不同环境下进化的外来酶——在嗜热生物、植物、真菌、古生菌中——可能会导致不可预测的连锁效应,包括:动力学差,需要辅助因子/金属[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]、次优基因表达和/或蛋白质折叠,而密码子含量和隐调控特征可能导致基因表达问题。在某种程度上,后者可以通过密码子优化来缓解,尽管这可能会导致快速翻译,但这也会带来代价。总的来说,这些失衡消耗了核心资源,降低了增长率。根据合成途径的不同,个别产品或中间体也会引起毒性[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba].在这种情况下,途径瓶颈可能需要工程,如外排蛋白泵出有毒产物[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba].要浏览其中一些问题,合成生物学可以重构基因表达,以微调个体酶水平,提高所选择的途径的效率,以及一定程度,最大限度地减少宿主新陈代谢和谐的毒性作用[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba].为了实现这一目标,DNA组合装配通常用于控制单个基因表达元件:启动子、绝缘体、开放阅读框架(ORF)、核糖体结合位点(RBS)和终止子。之前,我们发布了EcoFlex,一个模块化克隆工具包,用于灵活克隆和路径优化[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba].EcoFlex是一个基于金门的分层工作流程,用于克隆基因(Level 1)和表达通路(Level 2-3)GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba.在这项工作中,我们试图部署EcoFlex来解决高价值的精细化学途径。我们选择了4-(4-羟基苯基)丁醇-2-酮途径,也称为树莓酮,作为优化的模型途径。GydF4y2Ba

自然覆盆子酮来自GydF4y2BaRubeus rubrum.GydF4y2Ba在一些发展中国家,在一系列自然来源的产品中,造成了森林砍伐。通常每公顷土地约可获得1克树莓酮(约1000公斤水果)[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba].这是一个非常低效的净化过程,这反映在自然提取的树莓酮的高市场价格- 1万至2万公斤GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba.覆盆子酮的微生物异源生产导致滴度1-91mg / l使用GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba].最好的策略是在富介质上生长,并有强大的T7启动子驱动的基因表达。另外,一种半合成的全细胞方法最近被用来绕过细胞毒性,使树莓酮每升的克GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba[GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba].与Ecoflex一起为合成的覆盆子酮生物合成途径设计,我们首先考虑了可能限制其生产的潜在因素GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba和途径的设计:底物供应(大多数研究饲料GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-coumarate);丙二酰辅酶a (~ 35 μM)的有限池GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba];和潜在的瓶颈步骤,特别是对于III型聚酮化酶 - 苯甲酰丙酮合成酶(GydF4y2BaK.GydF4y2Ba猫GydF4y2Ba = 0.1 s-1GydF4y2Ba)[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba].此外,树莓酮和更大程度上的前体4-羟基苯扎丙酮(HBA)对细胞生长都有毒性[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba].在此基础上,我们选择了一个五步合成途径,并使用EcoFlex进行优化。我们首先筛选了一个组合启动子和RBS文库。从我们最初的探索中出现了三个问题:低成功率、低滴度以及启动子和终止子区域同源重组导致的通路基因丢失。而我们可以改变rho不依赖的合成终止子,通过从最初为抵抗同源重组而开发的文库中选择它们[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba,我们希望进一步控制启动子区域。因此,在本研究中,我们提出了一个新的简并σGydF4y2Ba70GydF4y2Ba启动子库微调酶水平。为了克服最初的低命中率,我们还确定了一种新的基于颜色的筛选方法,以确定生产树莓酮前体的最佳启动子设计空间,并单独定制每个酶水平,以提供最大的代谢通量平衡最小启动子强度;这减少了系统中的资源使用和代谢物毒性。总的来说,我们提供了65倍的改进(高达12.9毫克/升)在树莓酮生产GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba.总之,我们报告了合成树莓酮途径的重构,作为合成生物学设计-构建-测试-学习方法工程有毒精细化学途径的一个例子GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

结果和讨论GydF4y2Ba

重构in.GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba识别途径瓶颈和遗传不稳定性GydF4y2Ba

基于现有文献,我们设计了一个合成树莓酮途径(见材料和方法),从植物,细菌和真菌来源。该途径始于l -酪氨酸,这是一种内源性初级代谢物,用于表达GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba.四步途径使用酪氨酸氨裂解酶(TAL),GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-香豆素酰辅酶a连接酶(PCL)、苯扎丙酮合成酶(BAS)和nadph依赖的树莓酮合成酶(RKS)。为了补充这一点,我们还选择了malonyl-CoA合成酶(MatB),用于从丙二酸、CoA和ATP中再生malonyl-CoA(17)。GydF4y2Ba

首先,我们构建了每个基因都在低强度J23114启动子(pJ23114-RK)和强启动子(PET-RBS)控制下的质粒,并在多个试验中进行了测试GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba菌株。我们合理化地认为,使用弱启动子强度应该提供足够的树莓酮检测水平,允许我们通过测试更强的启动子来优化途径。出乎意料,GydF4y2BarecAGydF4y2Ba-GydF4y2Ba缺乏GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaDH10β克隆应变提供了其他常见实验室菌株的最高产量(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S1)。此外,不同介质(M9,M63,LB,2YT和TB)的临时实验证实了GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaDH10βPJ23114-RK质粒菌株仅在富培养基中生产(数据未显示)。最小介质中的覆盆子酮生产低于HPLC-MS对检测的极限。虽然在我们的实验的背景下,在合成生物学中的标准化中最小的介质是优选的,但我们决定继续富含培养基(2YT),以了解包括启动子和酶表征的所有实验。覆盆子酮酮生产也已在最低媒体中报告[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba].最后,我们还在半定义的SM6培养基中或在高密度发酵罐中只观察到微量的树莓酮GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S2),我们用最后的优化应变进行了测试。GydF4y2Ba

接下来,我们继续GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaDH10β作为一种异源宿主和2型培养基,其补充有10毫米丙二酸酯(用于MATB催化的丙二酰基-COA再生)用于筛选。然后我们做了一系列途径变体来识别潜在的瓶颈。同时,我们试图组装五个途径(GydF4y2Ba塔尔GydF4y2Ba-GydF4y2BapclGydF4y2Ba-GydF4y2BamatGydF4y2Ba-GydF4y2Ba基座GydF4y2Ba-GydF4y2Ba地基处理GydF4y2Ba),每个基因都有一个强J23100启动子控制的基因,其余四个基因受弱J23114启动子控制。有趣的是,经过MoClo组装的J23100-GydF4y2Ba塔尔GydF4y2Ba和J23114-GydF4y2BapclGydF4y2BaJ23114 -GydF4y2Ba基座GydF4y2BaJ23114 -GydF4y2BamatGydF4y2Ba和J23114-GydF4y2Ba地基处理GydF4y2Ba, 后GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba转化后,获得了一系列菌落大小。尽管多次尝试,我们仍无法分离出所需的途径组合,这表明由于TAL的过量生产,这种设计是不稳定的。然而,剩下的四个途径变异是通过弱J23114启动子获得的GydF4y2Batal表达式GydF4y2Ba,而虽然GydF4y2BapclGydF4y2Ba那GydF4y2Ba基座GydF4y2Ba那GydF4y2BamatGydF4y2Ba和GydF4y2Ba地基处理GydF4y2Ba基因与强J23100启动子单独过表达,以增加基因表达。有趣的是,J23100-GydF4y2BapclGydF4y2Ba(和J23114-GydF4y2Ba塔尔GydF4y2BaJ23114 -GydF4y2Ba基座GydF4y2BaJ23114 -GydF4y2BamatGydF4y2Ba和J23114-GydF4y2Ba地基处理GydF4y2Ba),途径不活跃 - 没有GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-香豆酸、HBA或覆盆子酮检测。然而,由于我们的LC-MS分析不包括细胞内中间体GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-香豆油酰辅酶a (pCA-CoA),我们不确定为什么这种变体会破坏途径通量。为了进一步测试,我们还建立了一个三基因通路(GydF4y2Ba塔尔GydF4y2Ba那GydF4y2BapclGydF4y2Ba,GydF4y2Ba基座GydF4y2Ba)仅使用J23100启动子,试图最大化HBA水平。有趣的是,这种变体途径仅产生了两种途径GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-香豆酸(~ 0.5 μM)或HBA (~ 0.5 μM),而L-Tyr底物的水平与空载体对照相比保持不变。接下来,为强J23100-GydF4y2Ba基座GydF4y2Ba与低强度启动子阳性对照菌株(1.9μm)相比,变体,HBA(9μm)水平增加4.7倍,证实BAS(表达和活性)是速率限制[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba].在HBA生产水平上,最终OD显著下降(24.7%)GydF4y2Ba600GydF4y2Ba培养48小时(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba价值= 0.02);我们怀疑这是由于HBA积累和/或基因表达毒性,从过量生产BAS。接下来,J23100-GydF4y2BamatGydF4y2Ba(所有其他基因J23114),途径活性保持不变。最后,J23100 -GydF4y2Ba地基处理GydF4y2Ba,将HBA完全源于覆盆子酮(2.7μm),这证实RKS强烈地利用产品形成。总之,这些研究结果表明可以使用Ecoflex改进途径。然而,由于BAS酶代表了一个关键的瓶颈,因此我们下次试图优化这一步骤。GydF4y2Ba

HBA /覆盆子酮生产的快速色素筛选策略GydF4y2Ba

精细化学途径的关键问题是缺乏优化途径设计的快速,高通量的方法;覆盆子酮是无色的,需要分析方法,如HPLC进行检测。有趣的是,一种retro-aldol对前体HBA的合成[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba[揭示这是一种黄色橙色粉末,其在中性碱性条件下大致吸收〜300-450nm(> pH7.5),但在pH7中无色。重要的是,尽管在260-350nm之间存在一些吸光度,但没有在其他途径中间体如L-Tyr(无色),GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-coumarate(淡黄色)或GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-coumaroyl-coa(浅黄色)或覆盆子酮(无色)分享这种不同的视觉谱性能。基于这种观察,我们通过首先优化仅优化前三个基因的浓度来监测使用Ecoflex的HBA生产,GydF4y2Ba塔尔GydF4y2Ba那GydF4y2BapclGydF4y2Ba和GydF4y2Ba基座GydF4y2Ba最大化HBA积累。为了进一步简化,我们也省略了丙二酰-辅酶a再生方案,因为GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba丙隆-Co​​A池是〜35μm[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba] BAS酶有一个有利的GydF4y2BaK.GydF4y2BamGydF4y2Ba(23.3μm)用于丙二酰基 - COA [GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba].因此,在低(~μm)的助焊水平,我们没有指出丙二醇-CoA是限速的。接下来,我们最初用一个随机启动子文库构建了含有10个低强度EcoflexΣ的随机启动子文库GydF4y2Ba70GydF4y2Ba启动子进入中拷贝(COLE1)复制PTU2-D目的载体的起源,同时还将卡那霉素标记添加为额外的选择性压力以保持质粒稳定性。在2YT板30°C孵育三天后,我们观察了一系列的白色,黄色和橙色的菌落(通常为100-1000GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba转型)。为了继续,我们挑选了32种菌落,这些菌落显示出强烈的黄橙色色素沉着,并在小规模的液体培养中增长(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba).有趣的是,许多菌株几乎都耗尽了L-Tyr底物(~ 1.6-2.3 μM),并且有高水平的L-TyrGydF4y2BaP.GydF4y2Ba-carmarate(154-180μm),但没有HBA或覆盆子酮。此外,两个菌株的HBA水平增加至68μm,来自未识别和非特异性的14μm覆盆子酮GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba烯烃还原酶(GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba].总的来说,所有产HBA的菌株都具有较弱的启动子GydF4y2BapclGydF4y2Ba基因J23114、SJM914GydF4y2Ba基座GydF4y2Ba基因具有培养基(SJM908,SJM910)或强启动子(J23100)。但是,这个新图书馆还包含了许多重组事件GydF4y2BapclGydF4y2Ba和GydF4y2Ba基座GydF4y2Ba但是只有在J23114启动子被发现在此之前GydF4y2BapclGydF4y2Ba基因。这可能是由于它经常出现在库中,作为一个弱强度的启动子。从近代文献[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba[这是由于在金门组件中启动子和BBA_B0015终结器之间的重复使用同源性。因此,我们旨在提高下一轮组装中使用的终止者的多样性。此外,对于单调个体酶水平,我们还期望较广泛选择的启动子。为了实现这一目标,我们构建并表征了一个新的σGydF4y2Ba70GydF4y2Ba带有退化碱基的启动子库以减少同源重组。GydF4y2Ba

图。1GydF4y2Ba
图1GydF4y2Ba

覆盆子酮生物合成在体外和体内比较鉴定途径局限性。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba覆盆子酮的生物合成途径和GydF4y2BaK.GydF4y2Ba猫GydF4y2Ba值在主文本中引用。通过LC-MS定量的中间体包括l -酪氨酸(白盒),GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-香豆酸酯(黄盒),HBA(橙盒)和覆盆子酮(红盒)。GydF4y2BaB.GydF4y2Baecflex重构树莓酮途径。有关生长条件的详细信息,请参见方法。数据和误差条(标准偏差)代表了三个生物重复GydF4y2Ba

图2GydF4y2Ba
figure2GydF4y2Ba

HBA生产中彩基表型筛网的开发。HBA模块的途径设计具有二级标记(卡那霉素抵抗)和启动子文库组装。在补充有50mM Tris-HCl pH8缓冲液的2YT琼脂的30℃下〜3天在30℃下生长后,鉴定了用于选择活性途径变体的黄色橙色菌落。液体生长(从三份单菌落)和LC-MS的途径中间体定量。排序摘要是在附加文件中提供的GydF4y2Ba1GydF4y2BaS2:表。数据和误差条(标准偏差)代表了三个生物重复GydF4y2Ba

一个新的EcoFlex启动子库的特征GydF4y2Ba

最终,我们的最终目标是使用组成型启动子来创建优化的途径,而不是诱导型启动子控制。对于一些途径构建体的生长紊乱,响应于较强的启动子,以及这是否是不同途径酶之间的常见观察,我们感兴趣。因此,我们在前三种途径酶(TAL,PCL和BAS)的单个基因表达水平上探讨了潜在的设计故障,这对HBA生物合成负责。提供新的变量强度σGydF4y2Ba70GydF4y2Ba我们还扩展了ecflex启动子库[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba].这是基于原始Anderson promoter library [GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba,简并在−35和−10框内。此外,为了减少同源重组,我们还在启动子内加入了两个单独的退化区。评价了新退化σ如何GydF4y2Ba70GydF4y2Ba启动子控制GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba生长和合成特定的蛋白质在树莓酮途径,我们描述了8 σGydF4y2Ba70GydF4y2Ba启动子,跨越低(相对于J23100)到高(SJM935-113%)活动(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。为了监测相对蛋白的合成,我们与TAL、PCL和BAS蛋白建立了c端eGFP翻译融合,并监测生长和荧光(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab)。正如预期的那样,最强的启动子(SJM935)为TAL和BAS提供了最强的EGFP荧光水平。然而,在两个独立的测量中,我们观察到增长和荧光的强烈变化(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab)对比最强启动子的数据集(SJM935和J23100)与低中型强度变体的更一致的生长相比。例如,SJM921-的一些生物重复GydF4y2Ba塔尔GydF4y2Ba-GydF4y2BaeGFPGydF4y2Ba和SJM921 -GydF4y2Ba基座GydF4y2Ba-GydF4y2BaeGFPGydF4y2BaGFP荧光在生长过程中自发丧失,表现出明显的滞后(> ~ 4 h),在后期指数生长和荧光丧失之前。此外,这些无性系的菌落在大小上是不同的,而且平均较小。这表明强大的启动子-基因组合在生长过程中积累了自然突变或丢失的质粒。虽然我们没有详细调查这一观察结果,但我们承认这一点GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaDH10β具有较高的背景突变率,比MG1655高13.5倍[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba-毒性反应中基因不稳定的可能原因。有趣的是,这些生长观察也依赖于所研究的基因。例如,对于PCL- egfp融合,虽然最终细胞密度随着PCL变体启动子强度的增加而降低,但我们没有观察到生物重复之间的生长或荧光的任何主要变化。这可能反映了对系统的特定毒性水平,在TAL的情况下,可能是由于l -酪氨酸作为核心代谢物的消耗。单基因过表达的毒性案例GydF4y2Ba基座GydF4y2Ba不太清楚,但可能与翻译伸长/核糖体占用的差异有关。虽然EGFP具有明显的趋势,但是PCL-EGFP和BAS-EGFP融合蛋白的启动子强度和荧光之间的荧光,我们用TAL-EGFP的明显和可变结果感兴趣(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaA).因此,我们试图利用变性SDS-PAGE分别研究基因- egfp融合,以评估融合蛋白的溶解性。为此,我们选择了具有低、中或高强度启动子的质粒菌株GydF4y2Batal-gfp.GydF4y2Ba那GydF4y2Bapcl-gfpGydF4y2Ba和GydF4y2BaBAS-GFP.GydF4y2BaDenAtry Page的融合和分析细胞内蛋白(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S3)。首先,所有GFP融合都以预期的分子大小合成。在高强度启动子(SJM935-113%)下,所有三种融合蛋白主要位于不溶性分数中,而是可溶性级分。特别地,与TAL相比,PCL和BAS的不溶性蛋白质的相对水平从SJM935启动子质粒降低。非特异性蛋白质聚集是具有强烈异源蛋白质生产的常见问题GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba].相比之下,低强度(SJM942-18%)和中等强度(SJM964-56%)启动子组合对SDS-PAGE进行了主要带,用于可溶性酶-GFP融合(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S4),在不溶性分数中观察到的融合蛋白得多(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S4)。因此,正如预期的那样,最强的推动者赞成更快地形成包涵体和排水资源,导致增长率下降。总之,这些结果证实,个体基因融合的表征与酶功能和细胞内蛋白质折叠的状态不同。这是一种上下文依赖的形式,这是合成生物学遗传电路和途径的设计越来越重要的因素[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba].接下来,有了这些新知识,我们开始重构这一途径来优化树莓酮的生产。GydF4y2Ba

图3.GydF4y2Ba
图3GydF4y2Ba

带有c端GFP翻译融合的HBA模块酶的启动子活性特征。GydF4y2Ba一种GydF4y2Ba堕落σ的设计GydF4y2Ba70GydF4y2Ba微孔板条件下eGFP特征的启动子库,详细信息见方法。GydF4y2BaB.GydF4y2Ba促进剂表征HBA模块酶融合。黑条代表ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba,而彩色(粉红色/绿色/蓝色)条在指数增长期间相对表达率代表EGFP融合(GFP HRGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba).数据代表两个技术读数和四个生物重复生长从单一GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba殖民地。误差条表示标准偏差GydF4y2Ba

重构优化的覆盆子酮途径GydF4y2Ba

为了达到平衡途径,我们接下来将途径分别优化为两个模块,HBA生物合成和HBA还原(Raspery Ketone合成),然后在最终组装中将其加入其中。我们从一个聚焦的库开始到微调HBA合成(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)应用以下理由。首先,高合成的TAL导致毒性和包涵体的形成。但是,由于缩小催化率相对较低和高kGydF4y2BamGydF4y2Ba对于L-TYR,我们选择了六个中高强度σGydF4y2Ba70GydF4y2Ba推杆为SJM964、SJM926、SJM923、SJM936、SJM942、SJM933GydF4y2Ba塔尔GydF4y2Ba基因。其次,PCL是一种高效酶,过多的PCL会使途径失活。因此,6低强度σGydF4y2Ba70GydF4y2Ba启动子(SJM940,SJM924,SJM956,SJM947,SJM952,SJM949)与此配对GydF4y2BapclGydF4y2Ba基因。最后,我们从之前的实验中得知BAS是限速的,而高合成会导致包涵体的形成和质粒的不稳定性。因此,GydF4y2Ba基座GydF4y2Ba与六个中高强度σ配对GydF4y2Ba70GydF4y2Ba(SJM928,SJM931,SJM935,J23100,SJM937,SJM941)启动子,在增长和性能之间提供权衡。使用聚焦的启动子策略的优点是,可以仅用有限范围的理想推动者强度填充文库,由此产生最快的生长克隆(例如,具有低强度启动子的那些)不会在文库中占主导地位。理性选择部分也将​​图书馆大小从10中减少GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba在6GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba.此外,我们还包括不同的强终端(BBA_B0015,L3S1P51,L3S2P21),以最大限度地减少同源重组[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]并保持RBS头寸不变(PET-RBS)。组装后,GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba第二库的转化,我们通过选择显示黄橙色色素沉着的20个菌落来重复筛选过程。经济增长后,LC-MS分析显示,菌株产生了广泛的GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-carmarate水平(21-153μm),具有强大生产HBA(36-98μm)和覆盆子酮(31-96μm)(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba).根据测序,我们发现九个克隆在图书馆中重复,但重要的是,这些克隆之间的途径中间体的水平非常相似。出乎意料地,我们发现克隆,6,10,14和18含有一种新的启动子序列驾驶表达GydF4y2BapclGydF4y2Ba不是特征图书馆的一部分的基因。启动子(SJM965,见附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)包含一个单基对缺失和一个新的随机区域在-10和-35序列之间。文库中的测序数据是干净的,表明该启动子一定是低水平存在的,但在我们的表型筛选中被强烈选择。有趣的是,尽管最终服用量平均下降了GydF4y2Ba600GydF4y2Ba(48小时)21%(范围3.7-4.7)与空载体控制相比(ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba = 5.03) (Additional file1GydF4y2Ba:图S4),所有克隆中的途径都基于Sanger测序稳定(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S5)。例如,我们没有发现任何同源重组事件,测序区域(如启动子、RBS和终止子区域)明显没有突变。附加文件中提供了序列的摘要GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S5及表S2)。对这一结果感到满意后,我们接下来着眼于优化还原酶模块,然后可以添加它来完成这一途径。GydF4y2Ba

图4.GydF4y2Ba
装具GydF4y2Ba

使用新的启动器库优化HBA模块。HBA模块的启动器微调。六个退化σGydF4y2Ba70GydF4y2Ba选择启动子与每个通路基因进行EcoFlex组装,GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba将DH10β转化并在2YT琼脂上在30℃下抗生素生长3天。如该方法所述,生长含有明显的黄橙色着色的菌落并定量途径中间体。测试低强度途径(J23114-RK)和空质粒对照(PTU1-A)进行相对比较。数据和误差栏(标准偏差)代表三个生物重复。排序摘要是在附加文件中提供的GydF4y2Ba1GydF4y2BaS2:表GydF4y2Ba

为了评估双键还原酶,我们配对GydF4y2Ba地基处理GydF4y2Ba五个低到强度σ的基因GydF4y2Ba70GydF4y2Ba启动子,PET-RBS和L2U2H09终结器进入PTU1-D-GydF4y2BaLacz.GydF4y2Ba.在30°C的微滴皿中培养24小时,评估生长速率和最终OD值GydF4y2Ba600GydF4y2Ba和活动与1mm HBA基板(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S6)。1 mm HBA导致OD减少57%GydF4y2Ba600GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba),穿过不同的不同GydF4y2Ba地基处理GydF4y2Ba启动子和空载体控制菌株(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba).在HBA通量方面,5个启动子变体中的4个(高-低强度)给予了99.9%的HBA转化为覆盆子酮(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba),只有最低强度的启动子(相对于J23100的活性SJM961-1%)导致树莓酮转化率较低:21.3 vs 13.9%。有趣的是,最后的过量用药GydF4y2Ba600GydF4y2Ba随着RKS促进剂强度的增加,RKS促进剂的活性趋于稳定。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba).GydF4y2Ba

图5.GydF4y2Ba
figure5GydF4y2Ba

促进剂微调还原酶模块。单一启动子变种GydF4y2Ba地基处理GydF4y2Ba基因在1ml 2YT培养基中在抗生素中在30℃下在12℃下,在12孔板中没有1mM HBA,并监测生长(ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba)和LC-MS。数据和误差条(标准偏差)代表了三个生物重复GydF4y2Ba

接下来,我们结合两个最强的HBA模块(图中的B6和B12),形成最终的路径设计。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba),优化的还原酶模块(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)和单独的丙二酰基-CoA再生模块(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba).对于后一个模块,我们的目的是通过外源表达丙二酸来增加丙二酸的供应GydF4y2Ba根瘤菌trifolii mactGydF4y2Ba(亚洛酸酯转运蛋白)基因结合GydF4y2BamatGydF4y2Ba(如前所述)在最终质粒设计中采用低强度的启动子。这种策略以前曾成功地用于其他类黄酮天然产物[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba].此外,我们还介绍了SFGFP荧光报告,以监测相对途径稳定性,作为遗传稳定的指标[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba].为了测定质粒系统在一般蛋白质合成上的通路稳定性和损耗,我们使用了超级文件夹GFP (sfGFP)报告基因,在控制下GydF4y2Bakasop *GydF4y2Ba推动者;一种GydF4y2Ba链霉菌属GydF4y2BaσGydF4y2Ba70GydF4y2Ba促进者强烈活跃GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba在低水平。接下来,对最终的质粒菌株进行生长和荧光检测,以监测其生长和质粒稳定性(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba).各重复序列之间的相对荧光非常相似,说明该菌株是稳定的。相对荧光降低了70%。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)与矢量控制相比(PTU1-A-GydF4y2Bakasop *GydF4y2Ba-GydF4y2BasfGFPGydF4y2Ba),这表明,无论途径产量如何,质粒设计中的额外基因(共8个)都会导致净蛋白合成的主要消耗。这反映在sfGFP报告荧光的减少和延迟4小时的滞后生长时间。最后,我们对菌株的相对蛋白水平进行了表征(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)和覆盆子酮生产。SDS-PAGE占所有细胞内蛋白的约10-20%(附加档案GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S7),而BAS和RKS也明显过剩(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S7)。在代谢物水平,我们观察到澄清的67-81%相对于对照,54-67μmGydF4y2BaP.GydF4y2Ba-香豆酸,~ 1 μM HBA和63-78 μM (10.8-12.9 mg/L)树莓酮,在小规模(5ml 2YT)批量条件下。此外,我们还做了单独的实验来测试丙二酸对丙二酰-辅酶a再生的影响,但我们发现这对树莓酮的生产没有明显的限制GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S8)。这可能是由于BAS酶的动力学性质,其具有低位GydF4y2BaK.GydF4y2BamGydF4y2Ba(23.3μm)用于丙二酰基 - COA [GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba]并且有利GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba替换在体内平衡下的替换总的来说,从一个几乎不产生树莓酮水平(0.2 mg/L)的初始设计开始,我们已经实现了最大65倍(12.9 mg/L)的滴度提高,并仅使用组成性表达产生了一个稳定的通路。GydF4y2Ba

图6.GydF4y2Ba
figure6GydF4y2Ba

利用丙二酰辅酶a再生模块、优化的还原酶步骤和途径稳定性监测器对最终优化菌株进行三级组装。质粒菌株在96孔微滴板上进行生长和eGFP荧光检测,以及途径中间体(代表6个生物重复)的LC-MS检测。误差条表示标准偏差。质粒株pRK-B6和pRK-B12对应于B6和B12 HBA模块,如图所示。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba和附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S5。对照质粒pTU1-A为pTU1-D-GydF4y2Bakasop *GydF4y2Ba-sfgfp。进一步的细节在方法中描述GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

目前,一系列精细化学品和药用化合物需要从天然来源中提取化学合成或提取,这可能是昂贵的,低效或需要广泛的农业用地 - 这尤其重要,因为我们转向可持续生物经济。在未来十年内的合成生物学的关键目标[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba是利用高效的工程微生物或植物底盘来替代这些策略。我们的工作展示了一种减少常规DNA组装工作中经常遇到的毒性压力的策略:在这里,我们使用了我们的ecflex MoClo平台。这是一个经常发生但未得到充分研究的问题[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba处理有毒精细化学途径,并对合成生物学有广泛的兴趣。我们的ecflex文库仅使用单个通路基因的组成控制,为产品通路,即树莓酮提供了稳定的通路表达;这比可诱导的促进剂更有利于工业应用[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba].然而,需要进一步的工作来在最小的培养基下建立产量,以利用可再生原料的潜在生物转化,以获得天然覆盆子酮的增值生产。这是可能的可实现的GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaL-酪氨酸池可以被设计成g/L规模[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba[工业应用的关键要求。此外,还可能需要解毒策略,例如使用自动阻力机制[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]或通过连续提取方法进行直接化学处理[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba].总之,我们为我们原来的ECOFLEX MOCLO系统提供了升级,以便快速优化毒性精细化学品GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba,通过重构途径表达到最大途径通量和最小资源排水的最小水平。GydF4y2Ba

材料和方法GydF4y2Ba

分子生物学和一般方法GydF4y2Ba

所有标准的分子生物学,常规生长条件和抗生素浓度在以前的出版物(EcoFlex)中描述。所用引物均列于表S3中。为了制备启动子库,每个启动子部分包含50 ng在1级MoClo反应中。用1 / 3(5µL)的反应液以25µL转化商业化学活性DH10β (NEB)细胞,用200µL的SOC培养基以正常热休克法恢复细胞1 h。50µL的混合液与10 mL的氨苄青霉素(10 μg mLGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba)在30°C下生长16小时。纯化质粒DNA并测序(SourceBioscience)。GydF4y2Ba

σGydF4y2Ba70GydF4y2Ba堕落的图书馆GydF4y2Ba

正向引物Sigma70_11N_R和反向引物Sigma70_F(见附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:使用表S4)从模板PSB1C3-J23100-EGFP中放大库,如我们以前的出版物中所述[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba].GydF4y2Ba

HBA合成GydF4y2Ba

20% (w/v) NaOH溶液(2.00 g NaOH in 10ml ddHGydF4y2Ba2GydF4y2Bao)在冰水浴中冷却。在5分钟内将碱溶液滴入4-羟基苯甲醛(2.00g,16.38mmol)的丙酮(12ml)中。将得到的黄色溶液在冰浴中再搅拌10分钟,然后在室温下搅拌16小时。用50ml冰水混合物淬灭反应,并在冰水浴中冷却。加入浓缩的HCl(15mL)以将pH调节至1.将混合物浓缩GydF4y2Ba真空GydF4y2Ba并用乙酸乙酯(2×100mL)萃取。用DDH洗涤乙酸乙酯提取物GydF4y2Ba2GydF4y2BaO(1×50mL),盐水(1×75mL)并用NA干燥GydF4y2Ba2GydF4y2Ba所以GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba.正相纯化(乙酸乙酯:正己烷梯度2-40%),得到黄色结晶固体(2.02 g,产率76%)。使用已发布的方法合成HBA [GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba和核磁共振谱(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S6)与已发表的文献一致。GydF4y2Ba

HBA筛选和分析GydF4y2Ba

对于HBA途径筛选,将转化混合物在30℃下在改性的2YT琼脂(Melford)上在30℃下生长48-72小时,直至观察到色素沉着。用50mM TRIS碱和HCl调节改性的2YT液体培养基至pH8,加入15g L之前GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba技术琼脂(梅尔福德),以加强颜色检测。降低氯霉素浓度(20µg mLGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba)和卡那霉素(20μgmlGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba)用于途径筛选和所有液体培养物。对于生长,荧光和LC-MS测量,使用标准2YT培养基。对于LC-MS分析,三个单一菌落(来自GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba转化)在5 mL 2YT中进行生物重复。HPLC-MS样品测量两次,以确保MS信号在测量时间内稳定。GydF4y2Ba

基因合成GydF4y2Ba

rhodotorula glutinis tal.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba拟南芥pclGydF4y2Ba那GydF4y2BaRubeus石basGydF4y2Ba那GydF4y2BaRhodopseudomonas palustris matBGydF4y2Ba那GydF4y2Ba根瘤菌trifolii mactGydF4y2Ba和GydF4y2Ba感冒石地基处理GydF4y2Ba被寿命技术,Invitrogen选择基因合成。该基因是密码子优化GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2BaK12表达和与Ecoflex的兼容性。附加文件中提供的序列GydF4y2Ba1GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

细胞内可溶性和不溶性蛋白的变性页面GydF4y2Ba

DH10β质粒菌株在30°C培养24 h。的ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba离心1 mL。然后将细胞颗粒重新悬浮于1mg mL的缓冲液A中GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba溶菌酶,1%Triton X-100和50单位/μl苯酶酶(Millipore),使细胞浓缩成等效的ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba20并在30℃下孵育30分钟。然后以18,000×澄清裂解细胞 GGydF4y2Ba, 4°C 10分钟,以分离可溶性和不溶性蛋白组分。10 ~ 50 μg总蛋白经PAGE变性分离后,用InstantBlue (Generon)染色。GydF4y2Ba

板读者测量GydF4y2Ba

对于Clariostar.GydF4y2Ba©.GydF4y2Ba(BMG LabTech)板读取器测定,在四份生物重复(例如四个单菌落)中生长100μl2Yt培养体积,作为16小时的过夜预培养。的ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba用100µL 2YT和抗生素稀释至96孔板,起始ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba0.02。在96孔Greiner板中以600nm的纸板读取器测量细胞密度,以在一个起始OD中GydF4y2Ba600GydF4y2Ba0.02。板用easy®呼吸膜(Sigma)密封,并在30°C下以600 rpm生长6-12小时。ODGydF4y2Ba600GydF4y2Ba每10分钟记录GFP测量。在两个独立日内重复实验,以确保可重复性。误差条表示标准偏差。GydF4y2Ba

树莓酮途径中间体的LC-MS研究GydF4y2Ba

对于培养物,通过以6,000×离心除去细胞 GGydF4y2Ba,4°C 10分钟。通过加入2%(v / v)Hcl酸化上清液,然后澄清18,000× GGydF4y2Ba,4°C 10分钟。对于酶反应,除去50μl样品并用2%(v / v)HCl灭活,并在室温下以13,000rpm以13,000rpm离心10分钟。用450μLDDH稀释样品GydF4y2Ba2GydF4y2BaO.然后通过LC-MS直接分析样品,用Agilent 1290无限远高度系统进行,其中具有在线二极管阵列检测器与Bruker 6500新飞行时间(Q-TOF)质谱仪组合。在25℃的温度下使用安捷伦延伸-C18 2.1×50mm(1.8μm粒度)柱,缓冲液流速为0.2mLGydF4y2Ba-1GydF4y2Ba闵GydF4y2Ba-1GydF4y2Ba.用缓冲液A(0.1%甲酸)和缓冲B(乙腈中0.1%甲酸)的线性梯度进行LC。使用5%缓冲液B进行2分钟的分离,然后将线性梯度为50%缓冲液B的2-9分钟,其在9-10分钟的50%缓冲液B处保持。在90-1000米的质量范围之间记录光谱GydF4y2Ba/ Z.GydF4y2Ba速度是每秒3个光谱。制备了中间体L-Tyr、GydF4y2BaP.GydF4y2Ba-香豆酸,HBA和树莓酮派生(附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba).与分析标准相比,定量基于前体或片段离子的MS峰面积。在所用条件下,覆盆子酮被检测为钠加合物[M + NAGydF4y2Ba+GydF4y2Ba]GydF4y2Ba+GydF4y2Ba或作为诊断片段离子GydF4y2Bam / z.GydF4y2Ba= 107.49,对应CGydF4y2Ba7.GydF4y2BaHGydF4y2Ba7.GydF4y2Ba对于溶剂中的标准品,良好的线性(RGydF4y2Ba2GydF4y2Ba> 0.99)在0.3 ~ 30 pmol的柱上得到。定量下限为0.3 pmol。将注射量增加到1µL,重复注射低于该限度的样品。误差条代表三个独立生物样本的标准偏差。GydF4y2Ba

可用性数据和材料GydF4y2Ba

产生和分析的大部分数据都包括在这篇文章中。有关使用和分析的质粒或数据集的任何进一步的细节或要求均可从通讯作者处获得。GydF4y2Ba

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确认GydF4y2Ba

我们要感谢Colin Robinson教授(肯特大学)寻求发酵师实验,并为萨拉博士博士提供帮助。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

这项工作由EPSRC [EP/K038648/1]支持,SJM作为一个PDRA,由KP和PSF监督。GydF4y2Ba

作者信息GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

作者GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

SJM、KP和PSF设计了这项研究;SJM、YH、SB、DB进行了实验;澳博、YH、SB、DB和KP分析了数据;SJM、KP和PSF撰写了手稿。所有作者阅读并批准最终稿件。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2BaKaren m . PolizziGydF4y2Ba或GydF4y2BaPaul Freemont s .GydF4y2Ba.GydF4y2Ba

伦理宣言GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

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Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

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提取的离子色谱图和示例LC-MS校准数据。GydF4y2Ba

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Moore, s.j., Hleba, y.b., Bischoff, S。GydF4y2Ba等等。GydF4y2Ba用EcoFlex重构合成树莓酮途径。GydF4y2Ba活细胞的事实GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba116(2021)。https://doi.org/10.1186/s12934-021-01604-4GydF4y2Ba

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