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生产胰岛素的细胞工厂

摘要

全球糖尿病患者数量的迅速增加,以及对替代胰岛素输送方法的探索,如依赖更高剂量的吸入或口服途径,必将在不久的将来增加对重组胰岛素的需求。由于生产能力有限和生产成本高,目前的制造技术将无法满足人们对廉价胰岛素日益增长的需求。制造治疗性重组蛋白需要一个合适的宿主生物,具有高效的翻译后修饰和蛋白质复性机制。重组人胰岛素的生产主要使用大肠杆菌酿酒酵母用于人类治疗。在这篇综述中,我们将重点讨论各种方法,可以利用这些方法来增加生物活性胰岛素及其类似物的产量大肠杆菌和酵母。转基因植物也是非常有吸引力的表达系统,可以利用以生产大量用于人类治疗用途的胰岛素。基于植物的表达系统具有巨大的潜力,以非常经济的方式高容量生产胰岛素。具有长期稳定性的种子或叶片在种子或叶中的生物活性胰岛素的表达非常高,提供了一种可注射的低成本技术,也可以是胰岛素的口服递送。

介绍

发明DNA克隆技术的斯坦利·科恩和赫伯特·博耶的开创性工作标志着基因工程的诞生,它使基因在不同生物物种之间轻松转移。1.].他们的发现导致了几种具有治疗用途的重组蛋白的开发,如胰岛素和生长激素。克隆并表达人胰岛素和生长激素基因大肠杆菌分别在1978年和1979年。第一个使用重组DNA技术生产的获批药物是人类胰岛素,由基因泰克公司开发,并于1982年由礼来公司获得许可并上市。

目前市场上有超过300种生物制药产品,包括治疗性蛋白和抗体,销售额超过1000亿美元[2.],[3.].治疗性单克隆抗体已捕获主要的市场份额(>亿美元),其次是激素(110亿美元)和增长因素(>美元)[4.]. 2004年至2013年,美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)批准的生物制药主要来源于哺乳动物细胞(56%);大肠杆菌(24%);酿酒酵母(13%);转基因动植物(3%)和昆虫细胞(4%)如图所示1.[5.] - [13]. 目前,胰岛素的生产主要集中在非洲大肠杆菌酿酒酵母用于治疗糖尿病患者。

图1
图1

不同表达系统中生物制药的百分比[5.] - [13]

自20世纪20年代初以来,糖尿病患者用胰岛素处理,胰岛素纯化,从牛或猪胰腺纯化。基因工程领域的发展允许生产胰岛素大肠杆菌和酵母,已获FDA批准用于人类治疗[14],[15].

如今,重组人胰岛素主要生产大肠杆菌或者酿酒酵母.使用大肠杆菌在表达系统中,胰岛素前体(IP)作为包涵体产生,最终通过溶解和重折叠程序获得功能完全的多肽[16].酵母基表达系统产生可溶性IP,并分泌到培养上清液中[17] - [19].酿酒酵母是大规模商业化生产胰岛素最首选和最主要的酵母,然而,已经探索了几种其他替代酵母菌株用于胰岛素生产[20.] - [24].除此之外,E.coli.和酵母,哺乳动物细胞,转基因动物和植物表达系统也用作重组胰岛素的大规模生产的宿主[25] - [28].

糖尿病的发病率正在以惊人的速度增长,据推测,到2025年,全世界糖尿病患者的数量将增加到大约3亿[29].因此,对胰岛素的需求将成倍增加(大约超过16000公斤/年),现有的胰岛素表达系统的生产力将无法满足未来的市场需求。高效的胰岛素表达系统也需要,新的胰岛素给药途径,如口服或吸入正在开发。

FDA批准了多种表达系统生产的重组蛋白类药物。在原核生物中,大肠杆菌由于它具有生长速度快、培养基要求简单、易于处理、产量高和成本效益好等优点,一直是重组蛋白生产的首选。然而,有一些缺点使用大肠杆菌表达系统,例如质粒和抗生素特性的丧失,未经请罗的基因表达诱导剂,异源蛋白的细胞内积累作为包涵体,不当蛋白质重折叠,缺乏翻译后修饰(包括不能形成二硫键),蛋白质介导的代谢负担和压力,内毒素污染,分泌差,下游过程中的蛋白水解消化和复杂性[30.] - [32.].

在酵母菌株中,酿酒酵母、多形汉森酵母和毕赤酵母通常用于生产重组蛋白[21],[24],[33.] - [35.].喜欢大肠杆菌,它们生长迅速,非常容易处理,易于接受各种基因操作。在酵母中产生的重组蛋白被适当折叠和糖基化,在一定程度上与哺乳动物细胞中表达的蛋白相似。在中国仓鼠卵巢(CHO)和小仓鼠肾脏(BHK)等哺乳动物细胞中,正在生产包括治疗性单克隆抗体在内的多种人类治疗蛋白。在哺乳动物细胞中表达的重组蛋白是适当折叠的、糖基化的,通常能产生具有功能的活性蛋白[36.].然而,由于昂贵的培养基,使用哺乳动物表达系统的生物原理的生产成本非常高。但是,当我们查看美国和/或2013年欧洲联盟的批准生物制药人数,与过去五年相比的高于平均水平。平均批准率为13,如图所示2.[5.] - [13].值得注意的是,2009年和2013年的数字都是一样的。

图2.
图2

在过去的六年中,美国和/或欧洲联盟的批准数量与趋势线,呈现出平均批准率[5.] - [13]

胰岛素的结构与功能

人胰岛素由51个氨基酸组成,分子量为5808Da。它由胰腺的β细胞产生,并在调节身体中调节碳水化合物和脂肪代谢的关键作用。胰岛素被合成为称为胰腺β细胞中称为前胰岛素的单个多肽。前预胰岛素母蛋白是24-残基信号肽,其将新生多肽引导到内质网。当多肽被旋转到内质网的人中,信号肽切割成导致胰岛素的形成。在内质网中,在适当的确认中折叠胰岛素,形成3个二硫键。然后将折叠的胰岛素转移到反式-GOLGI网络中,其中通过细胞内肽酶转化为活性胰岛素,称为前料理转化酶(PC1和PC2)和外泌蛋白酶羧肽酶E.内肽酶在两个位置切割,导致裂片释放片段称为C-肽。由此形成的成熟胰岛素由具有21个氨基酸的A链和含有30个氨基酸的B链和两种多肽通过两种二硫键连接的B链组成。此外,A链具有内夹尾键[37.],[38.].

胰岛素生产的大肠杆菌表达系统

大肠杆菌是重组蛋白大规模生产的优选微生物。然而,有几个缺点限制了其用于生产重组生物药物的用途。诸如糖基化,磷酸化,蛋白水解加工等各种翻译后修饰(PTMS),这对生物活性非常重要的二硫键,不存在大肠杆菌[39.],[40].N-连接的糖基化是真核生物中最常见的蛋白质的发生变化。已经发现细菌空肠弯曲杆菌具有糖基化蛋白质的能力,并且还表明可以将功能活性的N-糖基化途径转移到大肠杆菌[41.].虽然细菌的n -聚糖结构与真核生物不同,但其工程性质不同弯曲杆菌N-连接的糖基化途径进入大肠杆菌,提供了在糖基化形式中表达异源蛋白质的机会大肠杆菌。Pglb寡糖基转移酶或(OTase)在大肠杆菌中的表达C. Jejuni在里面大肠杆菌表现出糖戊戊醛产量的显着增加[42.],[43.].最近的努力已作出与底物以外的天然和非天然的糖基化蛋白质大肠杆菌C.jejuni[44.] - [48.].

异源蛋白的密码子使用在决定重组蛋白的表达水平方面也起着重要作用。如果异源蛋白的密码子使用与异源蛋白的平均密码子使用显著不同大肠杆菌主机,它可能导致表达式非常低。通常,密码子使用的频率反映了它们相应的TRNA的丰富。因此,密码子使用的显着差异可能导致翻译的过早终止,氨基酸的MISClinators和蛋白质合成的抑制[49.].异种蛋白在大肠杆菌可以通过更换高度表达的密码子来改进大肠杆菌具有更有利的主要密码子的基因。类似地,编码用于稀有密码子的多个TRNA的基因的共表达可以增强异源蛋白的表达大肠杆菌。有一些商业广告大肠杆菌BL21 (DE3) CodonPlus-RIL、BL21 (DE3) CodonPlus-RP (Stratagene, USA)和Rosetta (DE3)等罕见密码子的tRNA编码株。BL21 (DE3) CodonPlus-RIL含有AGG、AGA(精氨酸)、AUA(异亮氨酸)、CUA(亮氨酸)等罕见密码子的tRNA基因。同样,Rosetta (DE3)菌株含有AGG、AGA(精氨酸)、CGG(精氨酸)、AUA(异亮氨酸)、CUA(亮氨酸)、CCC(脯氨酸)和GGA(甘氨酸)等稀有密码子的tRNA基因。这些罕见的密码子已经与低表达的蛋白质大肠杆菌,因此在这些转基工程化的应用大肠杆菌宿主菌株可以改善异源蛋白的表达水平,因此可能导致所需蛋白质的产率更高[50.] - [52.]. 蛋白酶缺乏症的应用大肠杆菌将消除蛋白酶产生的突变的菌株也可以通过降低蛋白水解降解来提高重组蛋白的产率。大肠杆菌菌株BL-21的两种蛋白酶缺失(细胞质)和ompt.(周质的)基因。而不是外部参数,靶向方法,如蛋白酶或分泌途径的修改,可以提供对重组蛋白生物学的见解[53.].在大肠杆菌,络合物和大的治疗蛋白质可以在周质中分泌,因为它提供氧化环境并有助于形成二硫键,这促进了重组蛋白的适当折叠,并且可能产生具有表达蛋白的可靠N-末端[54.]. 周质比细胞质具有蛋白质浓度低、蛋白水解活性强、生产效价高的优点[55.],增强重组蛋白的溶解度。完全,随着这些先进的修改和发展,缓解了目标蛋白质生产的过程,从而加速了药物发展[56.].

异种蛋白质通常在大肠杆菌作为包涵体,其包含不溶性错误的蛋白质聚集体。使用分子伴侣可以增加蛋白质溶解度并有助于适当的重组蛋白折叠。一些伴侣可以防止蛋白质的聚集和一些有助于重折叠和溶解错误的蛋白质。大肠杆菌中最重要的伴侣是Groel,Groes,Dnak,DNAJ,GRPE和触发因子。这些伴侣可以单独使用,也可以组合使用,以增强蛋白质溶解度大肠杆菌[57.],[58.].

重组人胰岛素首先生产大肠杆菌Genentech于1978年提出,采用一种方法,要求在细胞中分别表达化学合成的编码胰岛素a和B链的cDNA大肠杆菌[59.]. 独立表达后,纯化两条链并在最佳反应条件下共同孵育,通过二硫键形成促进完整和生物活性胰岛素的生成。第一个商业化的重组胰岛素是通过这种双链组合程序开发的,用于人体治疗[60.]. 另一种方法是在大肠杆菌中表达编码人胰岛素原的单一化学合成cDNA大肠杆菌然后通过蛋白水解纯化和切除c肽。与两链组合方法相比,这种方法更有效、更方便地大规模生产治疗性胰岛素,并自1986年开始商业化使用[60.].礼来公司采用这种技术生产了Humulin,这是1982年批准的第一个用于治疗糖尿病患者的重组胰岛素。这些第一代重组胰岛素具有与天然人类胰岛素相同的氨基酸序列,优于动物衍生胰岛素产品[14].然而,基因工程领域的进步和技术的发展与核苷酸序列改变的化学合成基因,促进了氨基酸序列改变的胰岛素类似物的发展。已经观察到,商业制剂中的天然胰岛素通常以低聚形式存在,作为由于浓度非常高,但在血液中,生物活性胰岛素是单体形式的含锌的六聚体。61.]. 因此,这种低聚物复合物应该解离,以便胰岛素可以从注射部位吸收到血液中。因此,皮下注射的重组胰岛素通常起效缓慢,注射2小时后血浆浓度达到峰值,作用时间更长,持续6-8小时[62.].因此,为了开发一种快速作用的胰岛素类似物,需要对其侧链参与二聚体或低聚体形成的氨基酸残基进行修饰。研究表明,胰岛素b链中的氨基酸残基特别是B8、9、12、13、16和23-28在低聚化中起着关键作用[63.],[64.]. 礼来公司开发的Lispro是1996年获得监管部门批准的第一种用于治疗的速效胰岛素类似物[60.].胰岛素Lispro被设计成具有与天然胰岛素相似的氨基酸序列,但在b链的28和29位出现了脯氨酸-赖氨酸序列倒置,从而减少了疏水相互作用,从而阻止了二聚体的形成。用于胰岛素Lispro的商业化生产,这是一种合成的Lys编码cDNAB28- 亲B29人体胰岛素被表达大肠杆菌通过用胰蛋白酶和羧肽酶处理通过胰蛋白酶和羧肽酶从胰岛素中蛋白水解胰岛素,通过胰蛋白酶切除胰岛素。另一种迅速作用的胰岛素类似物,生产大肠杆菌是Glulisine (Apidra),由Aventis制药公司开发,并于2004年获得美国监管机构批准。用赖氨酸取代B3天冬酰胺和用谷氨酸取代B29赖氨酸已生成谷氨酸胰岛素[14].

为了避免多次注射,也产生了具有长期持续时间的长效胰岛素类似物。胰岛素甘油是一项长效的胰岛素类似物之一,由Aventis Pharmaceuticals开发,由美国和欧盟的监管机构批准。通过用甘氨酸残基替换A链的C末端天冬酰胺来产生胰岛素狼科。通过添加两个精氨酸残基来改变B链的C末端。这些修改导致从5.4到中性值的等电点(PI)的增加。Glargine被制作为胰岛素并表达大肠杆菌最后以可溶性形式在pH4中配制。然而,在皮下给药后,它由于皮下组织中的中性pH而沉淀。胰岛素的溶解缓慢地发生,导致血液中释放的持续时间更长[14].

胰岛素生产的酵母表达系统

酵母是一种优选的宿主,用于表达各种异源蛋白,其需要翻译后改性其生物活性。酵母细胞能够进行许多翻译后修饰,例如磷酸化,O型糖基化,N-连接的糖基化,乙酰化和酰化。重组蛋白以可溶形式的酵母表达并以功能效应形式适当折叠。使用酵母表达系统的生物制药生产也非常成本效益,并且可以使用大型生物反应器来扩展。然而,为人类应用产生治疗性糖蛋白的一个主要问题是酵母N-糖基化是高甘露糖型,其赋予体内的短半衰期和超 - 免疫原性,因此使治疗性糖蛋白更少有效。已经对人源化酵母N-糖基化途径进行了各种尝试,以产生具有人源化的N-糖基化结构的治疗糖蛋白[65.].

酵母中产生的治疗蛋白质特别来自酿酒酵母包括激素(胰岛素、胰岛素类似物、非糖基化的人生长激素促生长激素、胰高血糖素)、疫苗(乙型肝炎病毒表面抗原)黄曲霉、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白蛋白、水蛭素Hirudo Medicinalis.和人血小板衍生出生长因子[34.].喜欢大肠杆菌,酵母衍生的重组生物制药主要是作为传染病或内分泌,代谢障碍的治疗剂。交替酵母菌株,此外S. Cerevisiae,正在探索生物制药的大规模生产。具体地说,毕赤酵母通过其强大的甲醇诱导醇氧化酶1 (AOX1)启动子和简单的发育方法,能够获得高细胞密度,有助于高质量和数量的重组蛋白生产。相比酿酒酵母,毕赤酵母在分泌蛋白质的糖基化中提供了主要优点,因为它不具有异源蛋白质的高糖基化。酵母菌株均具有大部分高甘露糖类型的N键合糖基化,但寡糖链的长度加入蛋白质中毕赤酵母属(每侧链约8-14个甘露糖残留物)比表达的那些短得多酿酒酵母(每侧链约50-150个甘露糖残基),表明在毕赤酵母可能更适合用于人类的治疗[66.],[67.].此外,外源蛋白的表达水平也很高毕赤酵母,这可能占细胞总蛋白的30%左右,这与酿酒酵母[68.],[69.].因此,毕赤酵母可作为大规模生产重组胰岛素和胰岛素类似物的一种有吸引力的替代品。比较不同的胰岛素生产系统,其中细菌表达系统的平均比生产率更高,最大生物量浓度在酵母中更高,总体生产时空产量基本一致,如表所示1.[70].

表格1人胰岛素生产系统的比较[70]

酿酒酵母自20世纪80年代初以来,已广泛用于生产重组人胰岛素[17],[18]而很大一部分重组商业胰岛素是由这种酵母表达系统产生的[19],[74.].为了在酵母中的高效表达和分泌重组胰岛素中,胰岛素构建体被设计成含有天然A链和缺少C末端B30苏氨酸的B链,可通过短合成的C肽(如AAK)直接熔化或连接).该构建体编码的cDNA序列与α因子信号序列融合酿酒酵母用于胰岛素原的分泌表达,产生高达80 mg/ml的胰岛素。在苏氨酸酯存在下,通过胰蛋白酶介导的转肽反应纯化单链胰岛素原并转化为活性胰岛素[19].除了天然重组胰岛素外,还在生产各种胰岛素类似物中S. Cerevisiae。门冬氨酸胰岛素是另一种快速作用的胰岛素类似物酿酒酵母,由Novo Nordisk开发,并于2001年由美国FDA批准用于人类治疗用途。通过在B链中用天冬氨酸替换脯氨酸残基来产生胰岛素Aspart。这种遗传改性导致链间电荷排斥的增加,自我关联减少,从而导致从皮下注射部位进入血液[63.],[75.].

地特胰岛素是另一种重组长效胰岛素类似物,在S. Cerevisiae,由诺和诺德开发,并于2004年被欧洲监管机构批准用于人体治疗。通过去除B链30位的苏氨酸残基和共价连接到B链29位赖氨酸残基的C14脂肪酸链,已生成重组Detemir。这些基因改变导致胰岛素与血浆中的白蛋白结合,从而确保胰岛素的缓慢和持续释放,从而将其作用时间延长至24小时[76.] - [78.].

Sacharomyces酵母已被报道用于生产40多种不同的重组蛋白[79.].与糖尿病有关的一些是在表中示出的2.,以及不同的特点。细胞外分泌的蛋白质很少Sacharomyces酵母重复使用α-因子先导序列以充分生产重组蛋白。此外,诺和诺德公司的Kjeldsen及其同事开发了一种合成先导序列,用于酵母中更有效的蛋白质分泌[79.],[80].

表2.有些生物制药是由酿酒酵母[2.]

转基因植物作为产生胰岛素的宿主

转基因植物已经被用来生产重组蛋白,因为它们具有成本效益、高质量的蛋白质加工、没有人类病原体、易于生产和存在真核生物翻译后修饰的优势。最初,人类生长激素是从转基因烟草植物中提取的重组蛋白产品[81.]. 此后,从植物中开发出了许多不同的产品,如乙型肝炎病毒表面抗原、抗体、工业蛋白和牛奶蛋白。

重组人胰岛素已成功表达并在植物的油籽中产生拟南芥蒂利亚纳[27].该技术涉及胰岛素在称为油体的亚细胞细胞器中的靶向表达,允许非常高水平的表达,易于重组胰岛素的恢复。油体是油料种子内部的贮藏细胞器,由磷脂膜包裹的疏水三酰甘油核和被称为油脂蛋白的外壁组成。基因工程油料种子是用以油体为靶点的重组蛋白合成的。27],[82.],[83.].然后通过液-液相分离,将油体与其他种子组分分离,从而减少了获得纯化胰岛素所需的色谱步骤。在转基因种子中,胰岛素积累水平很高(占种子总蛋白的0.13%)。重组胰岛素从油红蛋白融合伙伴中分离,经油体纯化后与胰蛋白酶消化成熟,获得具有生物活性的胰岛素。本研究清楚地证明了胰岛素在植物中作为油苷融合蛋白的表达,使得大量重组胰岛素在种子内积累,同时也提供了简单的离心下游纯化,即油体纯化。随后的成熟获得生物活性胰岛素可以使用目前用于商业生产胰岛素的标准酶法来完成大肠杆菌和酵母。油籽还作为一个天然的细胞仓库,重组胰岛素可以储存到需要的时候[27].

在另一种方法中,已经产生了转基因植物,其中烟草和莴苣叶绿体用由A、B和c链组成的人胰岛素原与霍乱毒素B亚基融合[28].已经观察到,旧烟草剩余的植物蛋白高达47%的总叶蛋白,同样地,旧的莴苣留下了大约53%的总叶蛋白的53%。储存在莴苣叶片中的胰岛素被发现是非常稳定的,即使在衰老和干燥的叶片中也可以检测到高达40%的胰岛素,如表所示3.. 从烟叶中提取纯度为98%的胰岛素原,并用呋喃蛋白酶裂解释放胰岛素肽。口服封装在植物细胞中的未经加工的胰岛素原或注射到小鼠体内,显示出与市售胰岛素类似的血糖水平降低。根据产量(每克烟叶3毫克胰岛素原),估计一英亩烟草种植园每年可生产高达2000万每日剂量的胰岛素[28].胰岛素原的c肽,它不存在于目前的商业可用的胰岛素和胰岛素类似物大肠杆菌美国cereviciae在长期治疗糖尿病并发症如刺激神经和肾功能方面具有很大的优势。生物活性胰岛素原在烟草和莴苣叶片中的高水平表达,以及在干叶片中的长期稳定性,为胰岛素原的注射和口服提供了一种可靠的低成本技术。

表3霍乱毒素B亚基胰岛素原在烟草和莴苣叶绿体中的表达[28]

结论

在未来20年中,世卫组织估计全球胰岛素销售额将从120亿美元增长到540亿美元。饮食和生活方式的改变正导致全世界糖尿病发病率的急剧上升。I型和II型糖尿病患者都使用胰岛素,但是晚期II型糖尿病患者需要大剂量的胰岛素,因为他们会产生胰岛素抵抗。全球糖尿病患者数量的急剧增加以及吸入或口服等替代胰岛素输送方法的探索必将在不久的将来增加对重组胰岛素的需求。由于生产能力有限和生产成本高,目前的生产技术将无法满足日益增长的胰岛素需求。重组人胰岛素的生产主要使用大肠杆菌酿酒酵母用于人体治疗。然而,最需要的是将生物活性胰岛素及其类似物的产量提高几倍大肠杆菌和酵母使用最新的新颖和高效的技术。另一种策略,使用不同于主机的表达式大肠杆菌酿酒酵母可以使用。基于植物的表达系统具有巨大的潜力,以非常经济的方式高容量生产胰岛素。具有生物活性的胰岛素原在种子或叶子中长期稳定的高水平表达,为胰岛素原的注射和口服提供了一种低成本的技术。此外,转基因种子还可以作为仓库,重组胰岛素可以储存到需要的时候。

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致谢

这项工作得到了沙特阿拉伯王国的NSTIP战略技术计划(项目号10-Bio1257-03)的支持。作者还承认科学技术单位的援助,科学研究和研究生研究,吉达,肯塔州吉达,吉达。

作者信息

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作者

通讯作者

对应到Mohamed Morsi M Ahmed

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提交人声明他们没有竞争利益。

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所有作者的贡献在写作,设计和图表的这一回顾。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

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Baeshen,N.A.,Baeshen,M.N.,Sheikh,A.等等。生产胰岛素的细胞工厂。MicroB细胞事实13,141 (2014). https://doi.org/10.1186/s12934-014-0141-0

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关键词

  • 重组胰岛素
  • 大肠杆菌
  • 酵母
  • 表达系统
  • 转译后的修改
  • 转基因植物