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嗜热菌和耐热酶在生物炼制中的潜力与利用

摘要

在今天的世界上,有一种越来越多的趋势是使用可再生、廉价和容易获得的生物质在不同的生物炼制厂生产各种各样的精细和散装化学品。生物炼制利用微生物细胞及其酶的活性将生物质转化为目标产品。许多这些过程需要酶,在高温下操作稳定,因此允许.易混合,基质溶解性好,传质速率高,污染风险低。嗜热菌经常被认为是工业上相关的耐热酶的来源。本文讨论了嗜热菌和耐热酶的现有和潜在应用,重点讨论了含碳水化合物原料的转化。以木质纤维素和淀粉转化为所需产品为例说明了它们在生物炼制中的重要性。提高酶的耐热性的策略体内在体外也评估。此外,本文还综述了在嗜热宿主中表达重组酶载体的研究进展。

背景

在过去的20年里,耐热酶和微生物一直是许多研究的主题,但对嗜热菌及其蛋白质如何在高温下发挥作用的兴趣实际上早在20世纪60年代就开始了,由Brock和他的同事的开创性工作[1].根据微生物的最佳生长温度,它们被分为三大类,.嗜冷(低于20℃),嗜温菌(中等温度下),和嗜热菌(高温,高于55℃)[2].目前已知只有少数真核生物能在这个温度以上生长,但有些真菌能在50 - 55°C的温度范围内生长[3.].几年前,Kristjansson和Stetter [4,建议进一步划分亲热菌和超亲热菌边界(在80°C及以上生长),这一边界如今已被普遍接受。今天大多数嗜热细菌的特征是生长在超嗜热边界以下(有一些例外,例如ThermotogaAquifex5]),而超嗜热种类通过古菌占主导地位。

利用和分子生物学技术,允许遗传分析和重组生产基因转移,在1990年代导致了热稳定酶的领域急剧增加活动的发展。这也刺激了一些从热环境中的微生物的隔离,以获取酶,可以显著提高酶的生物过程操作的窗口。一个早期的成功商业化的例子是分析用途的热稳定酶的,Taq.-从那时起,用于扩增DNA的聚合酶链反应(PCR)和来自嗜热来源的许多其他DNA修饰酶已在该领域商业化[6- - - - - -8].另一个感兴趣的领域是勘探用于技术产品和工艺的工业酶,通常是非常大规模地使用。酶作为工业催化剂是有利的,因为它们很少需要有毒金属离子来实现功能,因此创造了使用更环保处理的可能性[9]. 耐热酶提供了强大的催化剂替代品,能够承受通常相对苛刻的工业加工条件。

生物质转化为糖.能源利用率大约在30年前关注的话题。在生物催化转化新的兴趣最近出现的,对不稳定的日益关注和可能枯竭的化石石油资源,以及不断增长的环境问题,并重点再次放在生物精炼和生物炼制的概念。在生物精炼,可再生资源如农作物或木材被用于中间体的提取或用于直接生物转化成化学品,商品和燃料[1011].热稳定酶在这些方法中具有明显的优点,因为高温通常促进原料的更好的酶渗透和细胞壁紊乱[12].通过分子生物学的平行发展,新颖和发育稳定的酶也有很好的机会在合适的水平下产生。该审查将讨论从嗜热胶质化合物开发或分离的热稳定酶的潜在和可能性,包括考虑整个细胞的实例,在具有生物化的前景的可再生原料的生物蜕皮中。将说明作用于可再生原料的商业热稳定酶的实例。

耐热酶的稳定性和发展

在嗜热菌和耐热酶的工业应用中,分离的酶目前占微生物的主导地位。当一种酶或蛋白质具有较高的确定的展开(转变)温度(T),或在选定的高温下观察到较长的半衰期。高温应该是生长的亲热边界[>55°C]以上的温度。大多数,但不是所有来自嗜热菌的蛋白质都是耐热的。细胞外酶通常表现出较高的热稳定性,因为它们不能被细胞特有的因素如相容溶质所稳定[13].此外,还从较低温度生长的生物体中鉴定了一些热稳定酶(参见例如地衣芽。淀粉酶下文)。根本的理由选择热稳定的酶在生物处理过程是固有的热稳定性,这意味着可能性长期储存(在室温下)的,增加的耐受性有机溶剂[14],减少污染的风险,以及低活性损失的过程中(当停留在T即使在较高的温度下(通常用于原材料的预处理)。

耐热酶的发现和使用,结合重组生产和利用位点定向和酶进化技术的开发,已经消除了一些最初发现的障碍(.有限的接入和底物特异性)用于工业生物分析。如今,许多生物技术公司正在不断勘探新的,并使现有酶适应更高的体积和更严重的过程条件的反应[15].酶探矿通常侧重于利用分子探测技术直接从自然中提取基因,然后在选定的宿主中进行重组。编码稳定酶的基因的可用性,以及对酶结构特征的了解,也可以用于酶改良的分子开发(见表)1).

表1概述了内部热稳定性的建议特征,选自同源物的结构研究,以及引入热稳定性的一些发展方法,以及恒温蛋白的发育。

在体外进化策略可以利用编码热稳定蛋白质作为稳定支架的基因。当开发热稳定酶支架时,起始材料是已经稳定的骨架,从而产生了进化的良好可能性,以优化在选定的活性条件下的功能。已经利用这种类型的显影的实例是碳水化合物结合模块的结合特异性,源自来自嗜热细菌的木聚糖酶的CBM4-2的多样化Rhodothermus绿30.].碳水化合物结合模块允许微观调整多糖识别[31]并且在不同类型的应用程序中具有作为亲和句柄的潜力,正如Volkov及其同事最近所评论的那样[32].采用CBM4-2,具有较高的热稳定性和良好的生产力大肠杆菌表达系统,可以用朝向不同的碳水化合物聚合物的特异性开发单一热稳定蛋白[27,以及糖蛋白[33],显示具有总体理想性质的单一蛋白质选择性特异性发育的分子生物学的潜力。

在体外进化策略更常用来增加稳定性(表1),通常使用编码具有所需活性的非耐热酶的基因,以开发更好的耐热性,并使用筛选测定的温度作为选择压力[34- - - - - -36].例如,这可能包括开发耐热纤维生物水解酶,这在嗜热生物中并不常见,但有利于木质纤维素的转化。此外,这种策略可用于优化宿主细胞在重组表达期间的稳定性[37].另外,稳定酶的热稳定特性的识别可以利用位点定向诱变,将稳定性工程到不稳定酶(表1).生物分子对极端条件的适应涉及稳定性和灵活性的折衷,以优化蛋白质的功能状态而不是最大化稳定性[3839].稳定的自由能(ΔGn→U.)的差异很小(在30-65 kJ/mol范围内),对应少量弱相互作用,耐热蛋白和中亲蛋白之间的差异(ΔΔGn→U.),只对应一些额外的交互。此外,尽管对一级序列进行了一些统计研究,但在首选氨基酸交换方面还没有预期的通用策略[38- - - - - -43],非常小的3d结构改变可能因此就足以应付各种极端条件[3842].合理地确定用于稳定的相互作用的类型,一些研究已经进行,其中来自一个范围的生物体在不同温度下生长的分离的一种独特的酶的3D结构进行了研究。这些研究包括许多胞内酶的[171920.42]还有一些细胞外酶,.内切葡聚糖酶[23]和脂肪酶[44]. 这些研究提出了一些特征(表1)1), 和.离子对和离子对网络的增加已经经常被观察到,特别是在来自超温物种的酶中。二硫键是蛋白质的另一种稳定特性,对许多酶和蛋白质显示出重要作用,最近也在细胞内的嗜热蛋白中显示出这种特性,似乎在小蛋白质中特别常见[18].使用这些策略的稳定稳定蛋白质需要结构知识,并且可以相当复杂地预测引入新型相互作用氨基酸残基的效果。尽管有这些困难,但是使用两种定向和随机技术,延续了稳定的酶,具有所需的活动,为更有效的酶铺平道路。因此,预期在工业应用中使用热稳定酶将随着时间的推移而增加,最终导致更广泛的可用性和更低的价格,因此提高了诸如BioRefining等大规模应用中的潜力。

可再生资源利用的生物杂种

生物炼制最近已成为许多工业国家战略和愿景中使用的一个关键概念,受到环境(鼓励可再生化学品和燃料,阻止温室气体排放)、政治和经济问题的共同推动[45- - - - - -49].生物炼制被定义为可再生的原料,工业中间体和最终产物[之间必要的技术相结合的系统1011(图。1).目标是同时生产高价值、低量产品和低价值、高量产品(.燃料)[10].原料(或其剩余产品)可以直接用作生物加工的原料,或用作廉价的发酵过程底物,从中提取产品[50.].根据不同国家可获得的原料,已建议使用不同来源的生物质作为原料,例如玉米[51.)、小麦(52.], 甘蔗 [4653.,油菜,棉花,酢浆草,木薯[54.]和木质纤维素[47].最简单的生物炼制系统基本上只对一种原料(.粒)到一个主产品,同时最灵活的人使用生物质原料的混合,以产生产品的阵列。不同类型的生物量原料,可以使用例如全作物(.谷物和玉米)或木质纤维素原料(.来自木材或废物的生物质)[1011].为了实现原料的有效转化,预计将结合机械、生物催化和化学处理的混合物。我们的重点将是生物催化转化,并将给出使用作物或木质纤维素作为原料的例子。

图1
图1

生物精炼厂基本原理的示意图概述,以及一些产品实例。

涉及酶或微生物作用的生物分析,在生物填充系统中进行双重任务,两者在生物灌注体系中产生代谢结构块(从聚合物产生糖),以进一步转换,并作为特定催化剂作为特定催化剂在将建筑物转化为所需产物(转化特异性)中作用。.各种反应类型,.氧化,还原,碳 - 碳键的形成,和水解,可以使用酶催化。为了给出几个实例,单加氧酶可用于羟基化和拜尔 - 维利格氧化反应[55.].用醇脱氢酶可使羰基化合物立体选择性还原为手性醇,其中一些嗜热起源已被报道[56.].由于这些酶依赖于辅酶,因此必须考虑再生策略(见下文部分)。环氧化物合成,使用脂肪酶或氧化还原酶,具有巨大的潜力,对各种化学品的合成,酶反应可以取代一些有毒化学物质[57.].C-C键形成可以用裂解酶进行[58.].糖苷水解酶和转移可以催化糖苷合成(最终通过反向水解),用于产生定义长度的糖低聚糖,以及其它糖缀合物,例如烷基糖苷,和热稳定酶已被用于这一目的[59.60.

这些反应可以使用游离的或固定的全细胞、粗的、纯化的或固定的酶来进行,其中许多是基于重组生物体[15].为了提高底物的可用性,聚合物水解酶作出了重要的贡献。例如,糖苷水解酶(也用于食品和饲料加工)将植物和树木的聚合物储存和建筑材料降解为更容易被微生物吸收和代谢的低聚糖和单糖构建块。如果选择全细胞生物催化剂(即天然的、重组蛋白生产或其他代谢工程微生物),这可能是可取的,这可能是代谢途径产品为目标化合物的情况。作用于糖苷键的酶也可用于修饰含有糖苷的天然产物,如类黄酮抗氧化剂[61.].利用整个细胞以及分离的酶进行进一步加工的可能性增加了潜在产生的构建块的多样性,许多代谢产物今天已经被确定为有趣的平台化学品。

平台化学品

美国能源部发表了一份顶部价值化学积木的名单,.平台化学品可以通过生物或化学转化衍生生物质,随后转化为许多高价值的生物基化学物质或材料[62.]. 表中列出了12个最有价值的构建块2.每一块材料都可以转化为大量的高价值化学品或材料,其潜在的工业应用是巨大的(其中一些已列于表中)2).所有的原料都可以由生物质(纤维素、半纤维素、淀粉或植物油)通过发酵或人工发酵生产在体外通过中间糖的酶转化;分别为葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、乳糖和蔗糖(甘油除外)。在建议的生物催化途径中,前12位中嗜微生物发酵仍占主导地位,有些情况下生物转化途径尚不清楚,需要进一步探索。为了实现对生物质材料的熟练利用(.为了从原料中释放出尽可能多的糖分),人们认为需要高效的耐高温生物催化剂。

表2优先级的糖衍生搭积木一样上市的美国能源部门。从[62]调整。

例如,在高温下的催化可以有利于半纤维素木聚糖的生物转化,从木质纤维素材料到木糖醇(表2,[63.])。木质纤维素降解的困难已被一些作者报道[64.- - - - - -66.,通常还包括热前处理,以提高这些材料的降解性。据报道,热处理也可以提高半纤维素酶转化的酶渗透性[12,提高木聚糖的可用性。木聚糖转化为木糖醇需要三种酶:木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、木糖苷酶(EC 3.2.1.37)和木糖还原酶(EC 1.1.1.21)。使用热活性和耐热木聚糖酶允许酶的作用与加热步骤同时发生,而不需要预冷系统,因此缩短处理时间。通过添加耐热木糖苷酶(对低聚木糖有活性),可以高效地水解成木糖单体。然而,木糖转化为木糖醇是由依赖NAD(P) h的木糖还原酶催化的:因此,为了减少辅助因子的需要(及其成本),应考虑添加辅助因子回收酶,或利用细胞内辅助因子进行全细胞催化。今天,木糖转化为木糖醇经常被报道使用不同的戊糖利用酵母菌株[67.但这些菌株的一个问题是木糖醇进一步转化为木糖。在木糖发酵酵母中,比如匹赖念珠菌,这一步是由NAD催化的+- 依赖性木糖脱氢酶,而在细菌中,相应的步骤由木糖异构酶催化。代谢地被收入酿酒酵母由木糖还原酶转化的p . stipidis)的最终产物为木糖醇,该生物已用于将木糖转化为木糖醇,转化率超过95%,但随着一种新的辅因子依赖酶的引入,必须考虑辅因子回收[68.].

工业酶和生物精炼/相关应用

为了进一步说明耐热生物催化剂在可再生原料上的大规模应用,我们将重点介绍已建立工业规模的水解酶(蛋白酶、脂肪酶和糖苷水解酶)的潜力和应用。蛋白酶和脂肪酶的应用将仅作简要介绍(有关综述,请参阅[69.- - - - - -72.])特别强调将被施加糖苷水解酶。

根据Business Communications Company Inc的一份报告,2004年全球工业用酶市场规模估计为20亿美元[73.]. 此外,工业酶的年增长率预计在4%到5%之间,随着市场竞争的加剧,酶的价格也随之降低。工业酶市场可分为应用领域:(1)技术酶,(2)食品酶,(3)动物饲料酶。最大的部分是技术酶,用于洗涤剂、纸浆和纸张的酶占世界总市场的52%[73.].主导酶在本节中是水解酶,分类为蛋白酶和淀粉酶,其包含20和总市场的25%,分别[73.].水解酶通常很容易在生物过程中使用,因为它们通常不需要辅助因子或复杂底物。此外,它们可以在早期阶段用于森林和农业部门现成的材料。列出了一些考虑过耐热变体的生物质材料的可用应用[参见附加文件]1以及酶的活性,酶的活性可用于降解或修饰。应用选定的例子与生物提炼的观点,将进一步讨论的文本在各自的部分下。

作物biorefining

作物生物精炼的第一步是分馏。这是通过物理、化学和生物过程实现的[74.].在开始物理步骤(通常是碾磨)之后,生物过程使用不同的水解酶,这取决于被分离的作物种类。分馏通常伴随着较高的温度,这就需要耐热性和热活性酶。化学方法可能用于某些应用,但可能产生有毒的和不需要的副产品,我们在这里不集中讨论这些方法。相反,从谷物中提取淀粉的酶降解和利用由此获得的产品将作为耐热酶在这类加工中的潜力的一个例子。秸秆还可以通过加工利用木质纤维素组分中的碳水化合物(见下文)。

淀粉降解与改性

植物淀粉是世界上最丰富、最易获得的能源之一。它由直链淀粉和支链淀粉组成,图中给出了表明酶攻击位点的主要结构概述。2.玉米是工业淀粉加工中使用最多的作物,但小麦、土豆和木薯也是重要的作物,而大米、高粱、甘薯、箭芋、西米和绿豆的使用较少[75.].

图2
图2

支链淀粉分子的部分酶的攻击。葡萄糖分子用圆圈表示,在圆圈的两端用一条线标出。

水解酶(和序列相关转移酶)是作用于淀粉的α-淀粉酶超家族的成员,该家族由大量具有保留催化机制的一级序列相关酶组成[76.,释放α-构型中的基团。超家族属于糖苷水解酶家族GH-H,由3个糖苷水解酶序列相关家族(GH13、70和77 [77.)催化一系列反应(见附加文件1].特定的一致序列和不同数量的结构域被认为是特异性变异的原因,导致水解或转移酶活性以及不同的底物特异性。

加工淀粉主要用于葡萄糖、麦芽糖和低聚糖的生产,但一些产品/中间体也可以通过环糊精生产。葡萄糖可进一步转化为高果糖糖浆、结晶葡萄糖和葡萄糖糖浆,用于食品应用[78.].葡萄糖当然也可以发酵生产乙醇(见生物燃料下面),氨基酸或有机酸[78.].葡萄糖异构酶(EC 5.3.1.5)转化为高果糖糖浆通常在55-60°C和pH 7.0-8.5下运行[78.],需要一种热稳定酶。果糖是一种流行的甜味剂,部分原因是玉米淀粉的批量数量以低成本。

淀粉处理通常在液化和糖化的两步水解过程中进行。液化是将粒状淀粉转化为可溶性的较短链长糊精[de(葡萄糖当量)9-14]。在液化中,淀粉通过热处理凝胶化,需要温度约为70-90℃(用于玉米)[78.],但为了确保去除所有脂-直链淀粉复合物,最佳工艺温度为100℃以上[78.].当淀粉浆冷却时,通过一种称为逆行的过程,直链淀粉链通过氢键相互作用,形成一种热不可逆凝胶。79.].然后丢失结晶顺序,淀粉颗粒随着淀粉糖和淀粉蛋白链溶液溶胀[80].热稳定α-淀粉酶[查看附加文件1]在热处理前加入,热处理在105-110℃下进行5-7分钟[81.].然后将淀粉浆快速冷却到95°C,并在此温度下保持60-120分钟,以完成酶的液化[81.82.].因此,高度的热稳定性酶是必需的,这将在整个过程中是有效的。现在有,除了从最初使用的酶芽孢杆菌stearothermophilus或者地衣芽。,市面上有很多这样的例子.来自Valley Research/Diversa的Valley“超薄™”,Multifect AA 21L®来自Genencor和Termamyl®和液化酶®来自Novozymes[见附加文件2].理想情况下,这种酶在低pH值(~4.5)下应该是活性和稳定的,而且不需要钙来维持稳定。据报道,一些工程酶可以实现这些期望的特性(见附加文件)2].在淀粉浆液中的水含量通常是相当高的(35%),作为高粘度增加淀粉的熔融温度83].降低含水率可能更为经济,而且已证明在包括剪切处理的情况下是可行的[82.].这是但伴随着的异麦芽糖[形成增加82.而温度的升高也要求酶具有很高的热稳定性。

糖化是指剩余的低聚糖(8-12个葡萄糖单位)通过β-淀粉酶水解成麦芽糖糖浆或通过葡萄糖淀粉酶水解成葡萄糖/葡萄糖糖浆[84].该工艺在pH 4.2-4.5和60°C下运行,当前使用的温度为60°C黑曲霉葡糖淀粉酶是稳定的。然而,为了使葡萄糖淀粉酶起作用,液化后的温度必须降低,pH值也必须调整。更经济可行的方法是利用与液化酶具有相同pH值和温度范围的酶。Kim等人最近报道了一种来自Sulfolobus solfataricus.,在90°C和pH 5.5-6.0条件下活性最佳。这种酶形成的异麦芽糖(一种常见的副反应)也比市售的真菌葡萄糖淀粉酶少[85].为了提高糖化效率,可以在这个过程中加入一种去分支酶,如普鲁兰酶。现在市场上可以买到的耐热酶混合物含有葡萄糖淀粉酶和普鲁兰酶,.OPTIMAX®Genencor。

糊化淀粉(从液化得到)也可以被淀粉麦芽糖酶(EC 2.4.1.25,和GH 77的成员)修饰,这些4-α-葡聚糖转移酶将α-1,4-连接的葡聚糖片段从淀粉转移到受体,受体可能是另一个α-1,4-连接葡聚糖或葡萄糖的4-羟基[86].在植物中,该酶也称为不成比处的酶或D-酶[79.].迄今为止,已知一些工业相关的热稳定和热稳定淀粉酸酶(热带物种,Thermococcus物种,以及Aquifex Aeolicus.,[见附加文件2),最佳温度在75至90°C之间。淀粉酶催化转化为热可逆淀粉凝胶,由侧链缩短和拉长的支链淀粉组成,但不含直链淀粉[79.].所得凝胶的性能与明胶相似(可替代从牛骨髓中提取的明胶),在食品工业中有许多用途。淀粉酶在淀粉上的应用还包括环淀粉的形成[87]和异麦芽糖低聚糖的生产[88].

环糊精(CDs)是其他淀粉衍生产品,有一系列可能的应用,因为其极性内部可以承载“客体分子”,并溶解和稳定它们[89].有不同大小的cd,适合不同的应用。CDs及其衍生物的应用示例如下:治疗用重要肽、蛋白质和寡核苷酸的载体[90]、一系列药物分子的增溶和稳定[91],分析分离[92],并在食品,化妆品,纺织品和粘合剂中的各种应用93].还有大的环状糊精,通常称为环淀粉[94]或LR-CD [95].这些产物可以由CGTases合成[96或淀粉酶[8797].环酰胺可以用作粘合剂的涂料,用于可生物降解的塑料,作为软饮料的高能量添加剂,作为面包改善的逆转延迟,对于抗冷冻燃料,并用于生产Larsen的非粘性水稻,2002年和其中的参考文献[98].cycloamylost也被提议作为一种人工伴侣来帮助蛋白质重新折叠[99]以及溶解较大的化合物,.Buckminster富勒烯(C60, C70) [95].

木质纤维素的生物降解与改性

木质纤维素是一种丰富的原料的一个重要例子,为生产林产品而大量生产,往往留下很大一部分未利用的废物。农业废弃物,如秸秆,也具有显著的木质纤维素含量。酶(包括市售饲料酶)可将聚合木质纤维素水解成较短的代谢中间体,或降低饲料谷物中非淀粉多糖的粘度(.大麦、黑麦、燕麦)[100.]可用于改善木质纤维素碳水化合物级分的利用。随着木质纤维素材料经常进行热处理以促进降解,热稳定酶具有明显的优势。饲料酶已在市场上持续15年,这个市场的估计价值约为3.6亿美元[100.].饲料处理通常在高温下进行[101.[所以使用和开发稳定和强大的酶一直是势在必行的。

植物细胞壁的木质纤维素是由纤维素,半纤维素,果胶,和木质素(三和前者是多糖)的。纤维素是所有植物材料的主要成分和地球[上最丰富的有机分子102.而半纤维素和果胶则是植物细胞壁的基质多糖。许多酶参与了这种生物质资源的降解[103.,它们通常由离散的模块(最常见的是催化或碳水化合物结合模块)组成,由短连接肽连接在一起,有时将一个针对纤维素的特异性催化模块与半纤维素特异性模块连接在一起。这种多重酶系统有助于产生木质纤维素材料的有效降解。此外,一些微生物产生多种单独的酶,可以协同作用。无花果。3.概述了木质纤维素中存在的一些聚合物,以及作用于这些底物上的一些酶的攻击位点。本文给出了更多具有不同特性的嗜热性木质纤维素降解酶的例子[见附加文件]3.].

图3
图3

简化的结构和位置的酶攻击聚合物从木质纤维素。图中显示了纤维素链片段(A),以及假想的半纤维素片段木聚糖(B)、葡甘聚糖(C)和果胶(D)。一些主要酶作用于各自物质的攻击位点用箭头表示。主链的糖苷键类型显示在每个聚合物片段右侧的括号中。碳水化合物用圆圈表示,每条主链的还原端用一条贯穿圆圈的线表示。白色=葡萄糖,绿色=木糖,黄色=葡萄糖醛酸,红色=阿拉伯糖,浅蓝色=甘露糖,深蓝色=半乳糖,灰色=半乳糖醛酸,粉色=未定义的糖残基。醋酸基显示为三角形,酚基显示为对角线,甲基显示为rombs。

纤维素酶的纤维素转化

纤维素是由β- d -glucopyranose单元组成的同聚糖,由β-(1→4)-糖苷键连接。最小的重复单位是纤维二糖,因为连续的葡萄糖残基彼此相对旋转180°[104.- - - - - -106.].纤维素水解酶(.纤维素酶)分为三大类:内切葡聚糖酶、纤维生物水解酶(和外切葡聚糖酶)和β-葡萄糖苷酶,这三种酶都攻击β-1,4-糖苷键[107.108.].内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4,分成12个不同的GH家庭与反相并留住反应机制,以及不同的折叠)催化随机解理在纤维素链的内部债券,尽管cellobiohydrolases (EC 3.2.1.91 GH 5 7(保留),6,9(反相))攻击链结束,释放纤维二糖。β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21, GH1, 3[保留]和9[转化])只对纤维寡糖和纤维二糖有活性,释放葡萄糖(图3.2.1.21)。3).

20世纪90年代,纤维素酶在工业上达到了重要的地位[109],主要在纺织品,洗涤剂和纸浆工业中(.在再生纸的脱墨)。几个热稳定酶已被表征[见附加文件3.[这些领域,随着热稳定性对酶的性能非常相关,在这些区域中存在许多试验。

纤维素的降解(图。3)转化为可发酵糖用于商品产品生产是一个生物精炼领域,投入了巨大的研究努力,因为它是后续能源生产的先决条件,见生物燃料在下面。这很可能至少部分是在高温下进行的,以促进降解,从而使耐热酶(或嗜热微生物)成为可取的。尽管纤维素酶只裂解单一类型的键,但具有广泛键合模式的晶体底物必须由游离酶或称为纤维素质体的多组分复合物共同作用[110].通过接头连接到催化模块的碳水化合物结合模块还可对酶的作用产生显着的贡献,并改善降解效率,特别是在复杂的木质纤维素基质上[111- - - - - -113].纤维素降解效率水平的进一步提高(速度更快,成本更低)将创造环境和经济效益,激励使用酶混合物和工程细胞的试验,这仍然是一个开放的关键挑战[114].

半纤维素转换

半纤维素是第二丰富的可再生生物质,占木质纤维素生物质的25-35% [115].半纤维素是由戊糖(d -木糖,d -阿拉伯糖),己糖(d -甘露糖,d -葡萄糖,d -半乳糖)和糖酸组成的多相聚合物[115].硬木中的半纤维素主要含有Xylans(图。3 b),而在软木中葡甘聚糖(图。3 c)是最常见的[115].有各种酶负责半纤维素的降解。在木聚糖降解中,.enet -1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.139)、α- l -阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)和乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)(图1)3 b)都作用于自然界中可用的不同的杂聚物。在葡甘聚糖降解过程中,β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)和β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)裂解聚合物主链(图3.2.1.25)。3 c).主链内切割酶(木聚糖酶和甘露甘露甘露酶)是最着名的。大多数木聚糖酶序列在GH系列10和11(保留)下分类,并且在其他家庭中发现了几种额外的酶(反转和保留77.])。甘露聚糖酶主要属于GH家族5和26(两者都具有保留机制),迄今为止,在GH44中只有一种双功能酶[转化]被分类。这些科都有嗜热起源的代表。

半纤维素与纤维素一样,是生物精炼应用中可发酵糖的重要来源(另见生物燃料下面,高效的降解对于它使用至关重要。如上所述,我们还可以预测绿色化学品生产中间体的应用潜力(.木糖醇)。这些酶的其他生物技术应用也已确立,其中许多促进了耐热酶的使用。酶的选择如下所示[见附加文件3.].芬兰研究人员提出了在纸浆造纸漂白过程中使用1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8.)的概念,由于在后续步骤中可能会减少化学漂白的消耗,这是一个非常有环境利益的概念[116117].由于工艺条件,酶功能在高温和高ph值是可取的,在接下来的漂白过程。来自嗜热菌的酶满足温度需求,因为它们表现出固有的热稳定性,在高温下具有最大的活性.木聚糖酶Xyn10A来自r .绿已经显示出改善的漂白硬木的序列亮度和软木牛皮纸浆通过硫酸盐法加工制备,引入在80℃下[在酶处理步骤中,当118].已就耐高温木聚糖酶申请了多项专利,用于制浆[119- - - - - -121], 包含.氨基酸取代GH11酶提高性能[122].木聚糖酶作为家禽饲料添加剂也在工业规模中生产[123]作为小麦粉的添加剂,提高烘焙产品的质量[63.].

甘露甘露糖酶在纸浆漂白的潜力,特别是与木聚糖酶组合[124],以及在食品和饲料中的应用,包括速溶咖啡提取液的粘度降低作用[125].

果胶转化

果胶是植物细胞壁的第三种主要结构多糖,在甜菜浆中丰富[126]和水果,.在柑橘类水果和苹果中,它可以形成多达一半的细胞壁聚合物[127].果胶骨干,由同型半乳糖醛酸区域(有时甲基化),鼠李糖和半乳糖醛酸区域(图。3 d),含有由l -鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和木糖组成的中性糖侧链[128].l -鼠李糖残基在主链携带侧链含有阿拉伯糖和半乳糖。也有单的木糖醛酸侧链[127].果胶在商业上有广泛的用途,特别是在纺织工业中。129],以及在食品工业中作为增稠剂、调质剂、乳化剂、稳定剂、糖果、乳制品、烘焙产品等的填料[130].它在药物输送和制药工业中的潜力也被研究[131]和有趣的是作为膳食补充给人类,因为它可能降低胆固醇的作用[132].果胶还具有制作可生物降解的薄膜的潜力[133].尽管存在这些应用,果胶是类似的,类似于纤维素和半纤维素,普通废料可以转化为可溶性糖,乙醇[134],以及沼气[135].

微生物果胶酶占全球食品酶销售额的25% [136,广泛用于果汁澄清、果汁提取、无果胶淀粉制造、植物纤维精制、天然纤维脱胶、废水处理、咖啡、可可和烟草的固化,并作为评估植物产品的分析工具[136137].在某些应用中,它可以更熟练地使用耐热酶,特别是当使用底物(也可以是其他自然存在的含糖苷分子,与果胶的类似连接)时,在环境温度下难以溶解,如水果中的柚皮苷和芦丁[138].许多酶参与了果胶的降解(图中显示了一些主要的例子3 d),但有几个不同的名称,这可能相当令人困惑。它们可以通过水解或反式消除作用;后者由裂解酶完成[128].Polymethylgalacturonase (endo)聚半乳糖醛酸酶(果胶解聚酶,果胶酶,EC 3.2.1.15) exopolygalacturonase (EC 3.2.1.67)和exopolygalacturanosidase (EC 3.2.1.82)水解polygalacturonic酸链的添加的水,都是分类GH28下,是最丰富的在所有pectinolytic酶(128139].α- l -鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40,在GH家族28,78和106)在果胶骨干水解鼠李糖半乳酸。α- l -阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.55, α-L-AFases found in 5个不同的GH家族)水解l -阿拉伯糖侧链,内源性阿拉伯酶(EC 3.2.1.99, GH43)作用于果胶中的阿拉伯糖侧链[140].这两种酶协同作用,降解支链阿拉伯糖,生成l -阿拉伯糖[126].多糖裂解酶(PL),与GH一样被归为序列相关家族,通过β-消除裂解半乳糖醛酸聚合物并组成.polypoly半乳糖酸酯裂解酶(果胶裂解酶,EC 4.2.2.10), poly半乳糖酸酯裂解酶(果胶裂解酶,EC 4.2.2.2),和外聚半乳糖酸酯裂解酶(果胶二糖-裂解酶,EC 4.2.2.9) [77.139141].果胶酯酶(果胶甲基酯酶,果胶甲氧基酶,EC 3.1.1.11)去酯化果胶骨干的甲基酯连接[139].耐热果胶酶不是经常被描述,但报告显示有一些耐热α- l -鼠李糖苷酶,.从stercorarium梭状芽胞杆菌142并来自与之密切相关的一种菌株Thermomicrobium.138].来自嗜热霉菌的耐热聚半乳糖醛酸酶,孢子丝菌属喜温的,也有报道称,在55°C时最活跃,可能与果汁行业有关[143[见附加文件。3.].文献中描述了几种耐热α-L-AFases(也参与木聚糖的侧链降解)(列在半纤维素酶下面[见附加文件]3.])。

生物燃料

在70年代世界石油危机期间,美国和欧洲都开始对利用纤维素酶从纤维素废物中生产可发酵糖产生兴趣。当时的目标是减少对石油的依赖,减少石油进口。目前,这种需求更是直言不讳,不仅因为石油价格不断上涨,还因为需要减少温室气体排放,全面改善空气质量。今天,许多国家都有专门的项目,旨在发展利用可再生资源生产生物燃料,研究沼气、生物乙醇、生物柴油和燃料电池等的可能性。

生物乙醇是当今最常见的可再生燃料美国的“生物燃料计划”(美国能源部)力求到2012年使纤维素乙醇具有成本竞争力,预计到2030年将相当于美国燃料消费量的三分之一。欧盟的“未来能源”计划的目标是到2010年在欧盟拥有12%的可再生能源[144].乙醇通常从玉米(淀粉)或甘蔗(蔗糖)中提取[145].蔗糖可以直接发酵成乙醇,但淀粉要先水解成葡萄糖才能发酵,一般通过发酵酿酒酵母146].通过利用更好的酶和菌株,可以通过利用更好的酶和菌株来改善来自淀粉的乙醇发酵,并且优选在没有化学预处理的情况下从全颗粒中水解淀粉,并且同时液化,糖化和发酵147].

然而,淀粉生物质材料以及甘蔗都是有限的,为了使可再生生物燃料能够与化石燃料竞争,需要一种更丰富的可再生资源的成本效益更高的工艺。农业和森林生物量的数量足够大,可以考虑大规模生产酒精基燃料[148].城市废物是一种额外的生物质来源;据估计,纤维素占市政固体废物的40%[148].如果加工成本降低,以纤维素为基础的产品可以与来自化石资源的产品竞争[149].不幸的是,因为木质纤维素的复杂性和晶体结构,这种材料是困难得多比淀粉水解。至可发酵糖的木质纤维素材料的有效转化是必要的,但需要更好的菌株或能够既戊糖和己糖转变和耐受胁迫条件[酶系统150.].在木质纤维素材料的降解过程中使用耐热纤维素酶、半纤维素酶和嗜热微生物提供了一种优势,可以最大限度地减少污染的风险,并可以实现酶解、发酵和形成乙醇蒸馏的单步过程[151.].

如今,水解和发酵步骤是分开的。发酵步骤通常由酿酒酵母或者发酵单胞菌属mobilis,但这可能是一个缺点,因为必须从水解步骤开始降低温度,而在较高的温度下(至少50℃)可以更好地进行水解[152.].传热酵母,克鲁维酵母菌属marxianus,活性高达50°C,表现同样好S. Cerevisiae.153.,但需要更高的温度。发酵也可以由热活性厌氧细菌进行。例如,从冰岛温泉中分离出来的一些嗜热菌在从木质纤维素水解物中生产乙醇方面表现很好,但需要进一步测试[154.].

如今,纤维素酶水解葡萄糖主要是由真菌完成的,例如木霉,青霉曲霉属真菌155.,但是为了与酸水解的结果竞争,可能需要在更高的温度下进行更有效的降解,并且一些相关的酶已经从嗜热菌和超嗜热菌中描述过了(参见附加文件)3.].障碍在于表达一系列的蛋白质并将它们组装起来在体外151.],但它已经表明从不同来源,具有不同的最适温度范围为嗜温到高温,可以被匹配在一起,并且仍然在纤维素酶的纤维素材料的降解显示出实质性的协同作用[156.].的内切葡聚糖酶Acidothermus cellulolyticus,它被熔断了T. Reesei.二糖水和表达T. Reesei.例如提高糖化产量[157.].然而,内切葡聚糖酶和纤维生物水解酶的活性是不充分的,因为降解产物(纤维二糖)抑制了前一种酶,阻碍了纤维素的进一步解聚。为了解决这种产物抑制,必须添加β-葡萄糖苷酶,或将其改造成能够将纤维二糖和纤维三糖发酵成乙醇的生产菌株[158.].由于可用于修饰的载体和工具的数量有限,嗜热菌尚未在代谢工程中发挥任何主要作用。相反,著名的中温生物喜欢S. Cerevisiae.,并且最近已经用来自真菌木糖途径和细菌阿拉伯糖途径的基因进行了修饰,这导致了一种能够在戊糖和己糖上生长的菌株,提高了乙醇产量[159.]. 还需要更好的生物质预处理技术。机械、化学、生物或热预处理通过去除木质素和半纤维素以及部分破坏纤维结构来增强纤维素酶的可及性。Wyman等人最近进行了综述[160.),并比较了领先技术[161.].

生物催化剂的生产可能性

在选择生物催化剂时,一个重要的考虑因素是其产量是否足够。这些考虑包括选择是由本地宿主产生,还是编码某种酶的基因应该转移到选定的宿主进行重组生产。一般来说,基因表达与靶蛋白的嗜热性无关,来自嗜热资源的蛋白与来自中温菌的蛋白同样会遇到生产瓶颈。

另一个重要的考虑因素,生物催化剂的实施至关重要,是生产成本,并在几年前.Genencor国际公司是在美国生物质项目办公室的分包合同下工作的,以降低纤维素酶的成本,使降解成可发酵糖的成本更低[162.].

纤维素酶大规模降解纤维素(如生物燃料部分所述)通常由真菌菌株进行[155.],但如果引入更多的热活性酶,则有可能在细菌宿主中产生异源产物,而细菌宿主通常比真菌的生长速度更高。使用细菌纤维素酶的困难在于,它们是更大、更复杂的酶,通常是具有许多不同活性的纤维素体的一部分。研究的目的也在于通过代谢工程改进目前使用的发酵菌株。

嗜热菌产生的酶

高温下培养嗜热菌在技术上和经济上都很有趣,因为它降低了污染的风险,降低了粘度,从而使混合更容易,并导致很高的基质溶解度。然而,与中亲生物相比,这些生物获得的生物量通常低得令人失望。低细胞产量给大规模和小规模生产都带来了问题,这使得对其酶的广泛研究非常困难。这引发了大量旨在提高嗜热细胞产量的研究。到目前为止,已有一些关于不同嗜热菌培养基组成和培养优化的报告[163.].为改善嗜热菌和超嗜热菌的发酵过程,已开发了特殊设备和特殊工艺[164.].但是,由于诸如复杂和昂贵的媒体的要求等因素[163.],高温下气体溶解度低,比生长速率和产物抑制率低[164.],大规模商业化培养嗜热菌用于酶生产仍然是一个经济上的挑战。由嗜热菌和超嗜热菌生产酶的大规模发酵过程的高成本只适用于极少数特定的应用。

中嗜和嗜热宿主的重组酶生产

降低嗜热酶的生产成本是其大规模突破的基础。降低生产成本和提高产量的一种方法是使用重组技术。广泛的耐热酶已经被克隆并成功表达在中嗜微生物中,如大肠杆菌165.],枯草芽孢杆菌166.],酿酒cervisae167.],毕赤酵母属pastoris168.],米曲霉169.],克鲁维酵母菌属lactis170.),而木霉属reesei171.].

然而,密码子使用的差异或蛋白质的不正确折叠可导致酶活性降低或表达水平降低[172.173.].此外,许多复合酶,如氧伞生物或需要共价结合的共价源的那些,在嗜可能的宿主中可能非常难以生产。这引发了在嗜热宿主系统中对遗传学工具进行遗传工具的搜索。到目前为止,已经开发了许多含有嗜热宿主中蛋白质的载体(表3.).然而,这种新型的嗜热表达系统的使用仍处于研究阶段,在大规模开发或工业化开发之前还需要做更多的工作。

表3为嗜热表达系统构建的载体

分离酶还是全细胞应用?

由于其在高温下的操作稳定性和变性耐受性,嗜热酶具有广泛的工业应用前景。这种酶用于化学、食品、制药、造纸、纺织和其他行业[182.- - - - - -185.].这些应用中的大多数利用已在嗜可能在嗜可能在嗜可能的宿主中表达的重组热稳定性酶。根据应用的类型,反应的性质和产品纯度,酶制剂可以是无细胞(粗,部分纯化或均匀的)或细胞相关的。例如,通过对昂贵且敏感的共源区的需要,使用无细胞脱氢酶的使用[186.而转氨酶则处于不利的反应平衡[187.].在这方面,全细胞应用程序可以更有吸引力。整个电池的应用也有报道在食品加工,利用在表达的重组嗜热α葡萄糖苷酶Lactococcus lactis188.].

整个细胞的用途是木质纤维素转化特殊的兴趣。生物转化包括两个主要步骤;糖化和发酵。糖化是碳水化合物聚合物(纤维素和半纤维素)为糖的水解,然后将该水解物是由将其转化为代谢产物的微生物(用作在发酵步骤中的衬底.乙醇,见生物燃料).全细胞微生物生物转化具有单一步骤转化的有吸引力的可能性,其中微生物产生糖溶解酶,可降解木质纤维素和发酵释放的糖,这可能导致效率高于常见的多学期木质纤维素转化率189.190].

然而,纤维素和半纤维素在植物细胞壁中的纤维素与木质素结合,使得该基材难以以高产率降解成单体糖(与含糖或淀粉的作物相比,.甘蔗或玉米)。因此需要预处理(使用蒸汽,酸或碱)使碳水化合物聚合物可用于酶水解和发酵[155.191].在预处理方法中,使用液体热水的高温预处理可以使生物质(特别是纤维素部分)更容易受到酶的攻击。为嗜热菌开发发酵系统在这里是有吸引力的,因为它可以通过减少蒸汽预处理后的冷却成本,降低污染的风险,并提高糖化和发酵速率来节约能源。此外,在乙醇生产中,嗜热条件导致乙醇连续蒸发,允许在发酵过程中收获。同时发酵和产品回收可以减少发酵过程(由乙醇)对产品的抑制,减少蒸馏冷却所需的水量和蒸馏所需的时间,从而使过程更加高效。然而,与木质纤维素预处理程序相关的一个问题是降解产物的释放,这可以抑制微生物的生长[191,但是一些嗜热细菌在将木质纤维素水解物发酵成乙醇方面显示出了有希望的结果,比如木聚糖水解厌氧嗜热细菌,Thermoanaerobacter mathranii的研究显示,在没有预先解毒的情况下,将碱性湿氧化麦秸半纤维素馏分中的木糖发酵成乙醇[191].然而,在预处理过的木质纤维素上的生长可能因生物和底物来源的不同而有所不同[189.].此外,木质纤维素的不溶性会使反应器中的均匀性产生问题,使得对过程参数的监测和控制困难。因此,类似于它们的嗜可能的对应物,有效利用综合生物过程中的嗜热需求需要彻底调查。在过去几年中,已经对木质纤维素素质的固态培养进行了报告[192193].在某些情况下,与更传统的浸没液体发酵相比,在固体栽培中达到了更好的转化率[194].

然而,利用自然产生的微生物,通常不足以有效地将基质转化为更高价值的产品。因此,必须通过代谢工程提高微生物的稳健性,以增加底物水解和提高产物产量。代谢工程已在中嗜菌宿主中进行,产生了生物炼制感兴趣的菌株,可产生高产量的乙醇[195196),丙二醇(197198醋酸),(199],己二酸[200],琥珀酸[201]和乳酸[202].然而,这种代谢工程报告对嗜热术来说非常罕见[203,但可能会随着遗传工具的可用性/发展而增加。几种嗜热生物,如Thermoanaerobium brockii204],Clostridium Thermohorosulfurim.205),而Moorellasp。HUC22-1 [206],已经研究了用于乙醇生产。这种嗜热的代谢工程,以提高乙醇生产效率和利用如纤维素,半纤维素和果胶不同的基材可以是非常有趣的效率。

结束语

嗜热菌,特别是嗜热酶作为分析工具和大规模应用的生物催化剂,迄今已获得了极大的兴趣。然而,这些酶的利用仍然是今天,尽管许多努力,经常受到酶的成本的限制。随着酶的市场增长,产量增加,成本预计会下降。此外,随着工业模式从化石向可再生资源利用的转变,预计对微生物催化剂的需求将会增加,当然,未来对耐热选择性生物催化剂的需求将会持续增加。

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生物炼制中嗜热菌和耐热酶的潜力与应用。MicroB细胞事实6,9(2007)。https://doi.org/10.1186/1475-2859-6-9

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  • 发酵
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