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细胞质中重组蛋白的可溶性表达大肠杆菌

摘要

现代生物技术对纯、可溶性和功能性蛋白的需求很高。天然蛋白质源在数量、分离和价格等方面很少能满足要求,因此重组技术往往是首选的方法。重组细胞工厂经常被用于蛋白制剂的生产,用于下游的纯化和加工。大肠杆菌是经常使用的宿主,因为它通过其相对简单性促进蛋白质表达,其廉价和快速的高密度培养,众所周知的遗传学和可用的大量相容的分子工具。尽管所有这些品质,重组蛋白的表达大肠杆菌因为宿主通常会产生不溶和/或无功能的蛋白质。在这里,我们回顾了克服这些障碍的新方法,这些新方法的策略要么集中于以未修饰的形式控制靶蛋白的表达,要么利用表达性和溶解度标签进行修饰。

介绍

微生物,比如肠杆菌大肠杆菌是蛋白质重组表达的杰出工厂。一种用于合成重组蛋白的表达系统大肠杆菌通常是一个质粒和一种大肠杆菌[1]。重组蛋白表达的主要目的通常是在细菌细胞中获得高度积聚的可溶产物。该策略并不总是被主机的代谢系统接受,并且在某些情况下遇到细胞应激反应。重组系统中遇到的另一种反应是靶蛋白的积累成为称为夹杂物体的不溶性聚集体。这些聚集的蛋白质通常被错误折叠,因此生物学无效[2]。

在正常的细胞条件下,细胞质蛋白质的一个子集能够自发地折叠[3.虽然聚集易于蛋白质需要存在许多分子伴侣,其具有可逆地与新生多肽链相互作用,以防止折叠过程中的聚集[4.]。因此,在细菌细胞中过表达过表达的重组蛋白的聚集可以从高浓度的折叠中间体的积累中产生或通过分子伴侣的效率处理。已经建立了普遍的方法,以实现聚集的有效折叠易一重组蛋白[1]。

该文献描述了许多用于将蛋白质从包含体重定向到可溶性细胞质分数中的方法(图1)。总的来说,它们可以分为蛋白质从包涵体重新折叠的过程[5.修饰表达策略以获得可溶性表达的程序。在这篇综述中,我们专注于为可溶性表达开发的方法大肠杆菌细胞质。从包涵体重新折叠在许多情况下被认为是不可取的,但有时是选择的方法。其主要障碍是回收率低、对每个目标蛋白的重折叠条件的优化要求以及重折叠过程可能影响重折叠蛋白的完整性。此外,高表达可溶性蛋白的纯化比包涵体的重折叠和纯化更便宜和耗时。因此,最大限度地生产可溶性重组蛋白是一个有吸引力的替代方案在体外重新折叠程序。用于介导可溶性表达的方法可以分为避免靶修改的过程,并且设计了目标序列的程序(图1)。

图1
图1

用于从重组中获得可溶性蛋白质的下游应用大肠杆菌。作为一个共同的特质体内策略旨在降低与重组表达相关的代谢负担。因此,一些提到的策略仅仅是对折叠的间接影响,例如使用TRNA辅质粒和mRNA的稳定化(详见文本和ref [1])。

避免目标修改的策略

一些蛋白质通过其催化特性直接影响宿主的细胞代谢,但一般来说,重组蛋白的表达会引起一种“代谢负担”。代谢负担的定义是指为了维持和表达外源DNA而从宿主代谢中抽取的资源(原材料和能源)的数量[6.]。包涵体的形成是对变性蛋白积累的一种反应。代谢负荷和包涵体的形成没有直接联系,但两者都是决定细胞产生可溶性重组蛋白能力的主要因素。由于变性蛋白的积累和代谢负担可以由许多环境因素控制,我们可以部分地控制可溶性蛋白的形成体内

低温下的蛋白质表达

众所周知的技术限制了体内重组蛋白的聚集包括低温培养[7.]。这一策略已被证明有效地改善了许多困难蛋白的溶解度,包括人干扰素α-2、枯草杆菌素E、蓖麻素a链、细菌荧光素酶、Fab片段、β-内酰胺酶、水稻脂氧合酶L-2、大豆溶氧合酶L-1、卡那霉素核糖体转移酶和兔肌糖原磷酸化酶(见[8.在其中引用的参考文献)。

由于确定聚集反应的疏水相互作用的强烈依赖性强烈依赖性,聚集反应通常在较高温度下青睐9.]。温度降低的一个直接结果是在过表达条件下诱导的热休克蛋白酶的部分消除[10.]。此外,活动和表达的一些大肠杆菌在30°C约30°C的温度下增加伴侣11.12.]。这些因素在一定程度上解释了在低温下正确折叠的稳定性和潜力。

然而,培养温度突然减少抑制复制,转录和翻译[13.]。用于重组蛋白表达的载体中使用的传统启动子在效率方面也受到强烈影响[14.]。当使用中等强或弱启动子或部分诱导强启动子时,也会达到类似的转录效果。低诱导水平被发现会导致更多的可溶性蛋白质[15.]。这是对折叠的细胞蛋白质浓度降低的结果。然而,细菌生长减少,从而导致生物质量降低。

优化重组蛋白低温表达的不同策略如下。

一种基于CSPA.开发了促进剂以在低温下表达蛋白质[16.]。这CSPA.启动子在低温下高度诱导,并且在37℃的高于和高于37℃的抑制。编码毒素 - β-内酰胺酶融合蛋白的序列是毒性的大肠杆菌并在37℃下迅速降解在控制下CSPA.启动子。温度降至15或23°C时,融合蛋白的降解被抑制,与37°C表达相关的毒性表型被抑制。这表明,该系统是一个有价值的工具,以生产蛋白质含有膜跨域或其他不稳定的基因产品大肠杆菌

最近提出了一个允许蛋白质在4°C下表达和折叠的原理[17.]。该原理基于靶蛋白的与来自心理细菌的伴侣的共表达。两个伴侣(CPN60和CPN10)Oleispira南极洲RB8.T.)允许大肠杆菌在4°C下快速生长[12.]。的酯酶o .南极洲RB8.T.用CPN60和CPN10共同表达大肠杆菌在4°C。与37°C培养制备的酶相比,该方法使纯化的酯酶的比活性提高了180倍。结果表明,低温有利于重组蛋白的折叠,该系统可作为重组蛋白在细胞质中的表达和正确折叠的工具大肠杆菌

大肠杆菌用于改善可溶性表达的菌株

已经开发了许多专业的宿主菌株来克服与高水平蛋白质表达相关的代谢负担。

大肠杆菌突变株对难溶重组蛋白的可溶性表达贡献显著。C41(DE3)和C43(DE3)是突变体,可以过表达一些在亲本菌株BL21(DE3)中无法高水平表达的球状蛋白和膜蛋白[18.]。f的表达1FO.这些菌株的ATP合酶亚基b膜蛋白,特别是C43(DE3),伴胞内膜增殖,缺乏包涵体[19.]。这些菌株现在被阿维迪斯商业化了http://www.avidis.fr关于他们在困难蛋白表达中使用的大量报告已发表[20.-23.]。最近的一项研究报告指出,编码有毒蛋白的质粒在C41(DE3)中,特别是在C43(DE3)中稳定性增加[24.]。

半胱氨酸的大肠杆菌通过涉及硫氧嗪还原酶和谷氨酸毒素的途径积极地保持细胞质。异源蛋白的二硫化键依赖性折叠在诺曼斯的折纸菌株中得到改善。扰乱trxB气油比编码这两种还原酶的基因,允许二硫键的形成大肠杆菌细胞质。这trxB(Novagen Ad494)和TRXB / GOR.(Novagen Origami)负菌株大肠杆菌已在几种表达情况下被选中[25.-27.]。靶蛋白中的折叠和二硫键形成通过融合到缺乏硫氧吡嗪还原酶的菌株中的硫氧嗪(trxB)[28.]。细胞质中周质复合酶DSBC的过度表达促进二硫键形成[27.]。

改性培养策略以获得可溶性蛋白质

产生重组蛋白的最简单方法是分批培养。这里,生长所需的所有营养素都是从开始提供的,并且在该过程中的增长有限控制。这种限制通常导致生长培养基的变化,例如pH的pH和溶解氧的浓度以及底物耗尽。此外,各种代谢途径的抑制产物积累。细胞密度和生产水平仅适中培养。

在分批补料栽培中,能源的浓度可以根据消耗率进行调整。还可以调节其他几个因素,以获得每生物量目标蛋白的最大产量水平。通过流式细胞仪监测内在光散射的变化,可以跟踪包涵体的形成[29.]。这允许只要在低水平下检测到包含体并妨碍夹杂物体形成,就可以实时优化生长条件30.]。

某些蛋白质的折叠需要特定的辅助因子的存在。在培养基中添加这些辅助因子或结合伙伴可以显著提高可溶性蛋白的产量。这在血红蛋白的重组突变体中得到证明,当血红素过量时,可溶性产物的积累得到改善[31.]。类似地,当大肠杆菌在0.1mm mg的情况下培养重组剂2+[32.]。重组蛋白质可溶性表达的一个重要因素是培养基组成和优化。虽然这主要是通过审判和错误实现的,但最终可能是有益的。

分子伴侣驱动重组蛋白的折叠

防止包涵体形成的一个可能的策略是分子伴侣的共同过表达。这种策略很有吸引力,但不能保证伴侣蛋白能提高重组蛋白的溶解度。大肠杆菌编码伴侣,其中一些驱动折叠尝试,而其他人可以防止蛋白质聚集[4.11.33.]。一旦新合成的蛋白质离开出口隧道大肠杆菌核糖体与触发因子伴侣相关联[34.]。通过与意外或分子内相互作用相关的与触发因子相关联的暴露在新合成的蛋白质上的暴露疏水贴片,从而防止过早折叠。在从触发因子释放后,蛋白质可以开始或继续折叠到原生状态。捕获在非原生和聚集易于构象中的蛋白质是用于DNAK和腹股沟的基板。DNAK(HSP70伴侣家族)通过减少聚集和促进错误折叠蛋白质的聚集和促进蛋白水解来防止包涵体的形成[11.]。涉及DnaK和ClpB (Hsp100伴侣家族)的双伴侣系统介导蛋白质的溶解或分解[35.]。Groel(HSP60伴侣家族)在可溶性和不溶性蛋白质级分之间进行蛋白质过渡,并在分解和包涵体形成中积极参与。小型热休克蛋白LBPA和LBPB保护来自不可逆聚集的热变性蛋白质,并已发现与包涵体相关[36.37.]。

同时过表达伴侣编码基因和重组靶蛋白在几种情况下有效。重组剂中触发因子的共同表达防止了小鼠内抑素,人氧调节蛋白ORP150,人溶菌酶和豚鼠肝转谷氨酰胺酶的聚集[38.39.]。通过环形胶合体和DNAK-DNAJ-GRPE伴侣系统的共同过表达进一步刺激可溶性表达以及触发因子[39.]。伴侣系统是合作的,最有利的策略涉及与属于腹股沟,DNAK,CLPB和核糖体相关触发因子家族的伴侣箱组合的共表达[40.-42.]。

相互作用伙伴和蛋白质折叠

蛋白质的不溶性大肠杆菌细胞质部分与蛋白质表面上疏水残留物的分布部分。因此,杂多聚体蛋白的亚基的可溶性表达有时在没有合适的结合伴侣的情况下患有包涵体形成。

可溶性表达大肠杆菌噬菌体T4基因23产物(主要衣壳蛋白)需要基因产物31的共表达(噬菌体共同伴侣蛋白GP31)[43.]。正确的相互作用伙伴的表达使得GP23能够正确折叠并在细胞质中形成长期常规结构大肠杆菌

另一项研究报告了通过将每种亚基(Pheromaxein A和C)的表达作为融合给硫辛辛的融合[44.]。当在蛋白质解除蛋白质中,每种亚单位仍然溶于溶液,仅在另一个存在下除去。

结论,互动伙伴可能有利于体内靶蛋白的溶解度。用于复杂结构中的多种蛋白质的共同表达的新系统实现了这种策略[1]。

涉及工程目标蛋白的策略

目标蛋白质并不总是通过上述策略以可溶形式表达。本次审查的最后一部分讨论了如何将错误折叠的蛋白质工程化或推动以发展和选择以获得可溶性表达。

融合蛋白技术

在重组蛋白质纯化中使用亲和标记具有较长的传统。他们不仅被剥削了通用净化策略的发展。已经观察到亲和力标签以改善蛋白质产量,以防止蛋白水解并增加溶解度体内[145.]。

其中最有效的溶解度增强蛋白质的特征是迄今为止大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)和大肠杆菌利用物质A(NUSA)。MBP(40 KDA)和NUSA(54.8 KDA)作为溶解性增强伴侣,特别适用于易于形成包涵体的蛋白质的表达。虽然许多蛋白质是高度可溶的,但它们并不是作为溶解度增强剂有效的。大肠杆菌在增强溶解度特性的比较中,MBP被证明是比高可溶性GST和硫氧还蛋白更有效的溶解度伙伴[46.]。溶解性增强是许多生物中麦芽糊精结合蛋白(MBPs)的共同特性,其中一些甚至比大肠杆菌MBP [47.]。尚未发现对MBP的溶解度增强的精确机制。然而,MBP可以通过通过在其表面上暴露的“热点”的溶剂相互作用来充当伴侣,其稳定其他不溶性乘客蛋白[48.49.]。MBP促进融合伙伴溶解度的能力可以通过添加补充标签来提高。MBP融合蛋白的不同构型已被建议用于高通量蛋白表达和纯化[50.]。

Wilkinson和Harrison提出了一个模型,用于溶解度百分比的重组蛋白的溶解度百分比的模型大肠杆菌细胞质(51.]。计算此索引的网络服务器在http://www.biotech.ou.edu.。Wilkinson-Harrison模型与实验数据一起确定了NUSA作为一个非常有利的溶解性合作伙伴[52.]。除了良好的溶解度特征外,NUSA的主要优点是其高富有效力。MBP和NUSA都已被用于溶解高度不溶性的SCFV抗体在细胞质中大肠杆菌[48.53.]。在文献中发现了许多MBP和NUSA作为功能溶解度增强剂的实例[54.-57.]。

作为溶解度增强剂的天然分子伴侣包括脯氨酸CIS泛滥异构酶(PPIases) [58.],thioredoxin [59.]及dsbA [60.]。

融合伙伴如MBP和NusA是相对较大的蛋白质。我们最近建议使用翻译起始因子IF2的高可溶性n端片段(17.4 kDa)作为溶解度伙伴[61.]。使用小伴侣减少获得一定数量的分子所需的能量,降低空间阻断,简化如NMR的下游应用。另一个相对小的蛋白质,晶片酶被提出施加伴侣体内在体外融合到IgG的轻链可变结构域的C-末端[62.]。

在最近的一项研究中显示,Pfg27的17残基c端延伸可导致可溶性表达数倍增强[63.]。一些研究表明,蛋白质末端残基的性质可以在蛋白酶的识别和后续行动中发挥作用[64.65.]。因此,蛋白质的末端延伸可能间接地保护它们与与部分蛋白水解降解相关的变性/错误折叠。还提出,肽延伸的大净电荷增加了新生多肽之间的静电排斥,因此增强了它们的正确折叠[66.]。

筛选策略已被雇用以高吞吐量的方式选择有利的融合伙伴。在这样的系统中,超过80%的蛋白质显示出高水平的可溶品表达,其中八个融合伙伴中的至少一种,包括NUSA,Intein,Thioredoxin,His-Tag,MBP,钙调蛋白结合蛋白和谷胱甘肽-S-转移酶[67.]。这些结果得到另一项类似研究的支持[68.]。

可溶性变异体的筛选和选择

结构和功能基因组和蛋白质组学是基因功能评估中的重要元素。以高吞吐量方式的适当折叠蛋白的表达和纯化是这些研究中的关键元素。已经最近描述了许多不同的筛选可溶性表达产品的高通量筛选。

通过对目标蛋白进行工程设计,可以提高目标蛋白的固有折叠率、稳定性和溶解性。当结构信息可用时,表达蛋白的溶解度可以通过合理的定点突变来提高[69.]。一种更普遍的方法是通过定向进化找到更容易解决的变异。在这种情况下生成的库包括随机点突变、删除和片段[70]。通过感兴趣的蛋白质或更多通用屏幕来筛选产生的突变体的溶解性。基于生物活性的筛网意味着必须为所研究的每种新蛋白质开发新的测定。此外,在许多情况下,研究的蛋白质或蛋白质结构域根本不会显示任何已知活性。一般屏幕包括融合报告方法,应力报告方法和直接方法,因此通常优选用于高通量方法。

荧光的大肠杆菌表达与GFP-基因融合的靶基因的细胞与单独表达的靶基因的溶解度有关[71.]。因此,蛋白质折叠大肠杆菌通过筛选荧光突变体,可以通过针对某种靶蛋白的定向演化方法来改善。这种方法演化了三种不溶性蛋白质,包括Pyrobaculum aerophilum甲基转移酶、酒石酸脱氢酶β亚基和核苷二磷酸激酶的可溶性分别为50%、95%和90% [72.]。GFP报告系统进一步用于筛选将相互作用伙伴溶解到不能溶解的目标。整合宿主因子β与GFP上游的融合导致了聚集,而结合伙伴(整合宿主因子α)的共表达显著增加了荧光[73.]。

类似的方法是使用选择性压力。通过用氯霉素乙酰转移酶(CAT)含有氯霉素转移酶(CAT)的培养基中的培养基中选择更可溶的融合蛋白突变体[74.]。此外,在旨在在高通量方法中获得通过cDNA片段编码的可溶性蛋白质的系统中使用选择性压力(融合到KanamycinPhosphot ransfersease)[75.]。

另一种融合报告方法使用β-半乳糖苷酶α肽作为融合伙伴,在一个无活性lacZΩ供应的系统中筛选lacZα互补在反式。当α肽变为可溶性,并通过与lacZΩ结合恢复酶活性时,可检测到活性的β-半乳糖苷酶[76.]。

当重组表达的蛋白质被错误折叠时,就会诱导先天性宿主细胞反应。这种反应可以通过转录来监控大肠杆菌表达错误蛋白质时上调的启动子。发现小型热休克蛋白IBPA的启动子可以融合到LacZ并用作错误折叠蛋白的报告者[77.]。该报告基因可以区分可溶性、部分可溶性和不可溶性重组蛋白。基因筛选和定向进化在别处得到了进一步的研究[78.]。

可溶性融合蛋白不一定是生物活性且适当折叠的。有几个报告证明,与非融合蛋白相比,融合蛋白的可溶性制剂具有低生物活性[79.]。结果表明,由折叠MBP和错误折叠的E6组成的HPV癌蛋白E6至MBP形成的可溶性多聚体聚集体。通过筛选单分散性来优化表达条件,可以避免这些“可溶于包容体”[79.]。

替代策略

已经开发了几种与传统融合伙伴和选择方法不同的策略,用于潜在的重组蛋白质在误用中的潜在救援大肠杆菌细胞质。

通过由Oleosin和GFP组成的融合蛋白来开发和说明基于人造油体的系统[80]。在不溶性细胞级分中发现表达的融合蛋白,但通过将三酰基甘油和磷脂加入纯化的包涵体,可以重构为油体。随后可以使用工程因子Xa切割位点与油体与油体分离出GFP。

一个体内抢救系统基于大肠杆菌最近出现了核糖体[81.]。目标蛋白从体内通过将它们与核糖体蛋白L23融合而聚合。融合蛋白在一株大肠杆菌缺乏必需的L23核糖体蛋白。这允许目标蛋白与高可溶性核糖体颗粒共价耦合。偶联目标蛋白的核糖体随后可以通过离心方法分离,目标蛋白通过位点特异性蛋白酶裂解以高度富集的形式释放。

结论

我们已经审查了获得可溶性和功能性蛋白质制剂的最新改进大肠杆菌重组。其中一部分方法关注于缓解细胞压力,这是宿主细胞在高表达一个或几个蛋白质的过程中所经历的极端代谢情况的反应。第二种方法是通过将目的蛋白与特定的肽标签相结合来提高表达蛋白的溶解度和结构稳定性。现代表达策略的一个共同特征是基因工具箱中的工具的巧妙组合,但也不断地重新考虑蛋白质表达交易中的公认范式。

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致谢

K.K.M由丹麦自然科学研究委员会和Carlsberg的补助金提供资金(拨款号码21-03-0592,21-04-0149 ANS-0987/40和ANS-1649/40)。

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Sørensen,H.P.,Mortensen,K.K.。细胞质中重组蛋白的可溶性表达大肠杆菌活细胞的事实4,1(2005)。https://doi.org/10.1186/1475-2859-4-1

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  • 重组蛋白
  • 包涵体
  • 融合的合作伙伴
  • 麦芽糖结合蛋白
  • 小热休克蛋白