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微藻作为生物塑化生产的生物反应器GydF4y2Ba

抽象的GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

聚-3-羟基丁酸酯(PHB)是具有热塑性性质的聚酯,其天然存在并通过这种细菌产生GydF4y2BaRalstonia Eutropha.GydF4y2BaH16和GydF4y2Ba芽孢杆菌MegiStium.GydF4y2Ba。与目前使用的塑料和大多数合成聚合物相比,PHB是可生物降解的,其生产不依赖于化石资源,使这种对各种工业应用的生物塑化有趣。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在这项研究中,我们报告了引入细菌PHB途径GydF4y2BaR. Eutropha.GydF4y2BaH16变成硅藻GydF4y2BaPhaeodactylum Tricornutum.GydF4y2Ba从而首次证明PHB生产在微藻系统中是可行的。细菌酶的表达足以导致pHB水平高达藻类干重的10.6%。如光和电子显微镜所示,在细胞的细胞溶胶中的颗粒状结构中累积的生物塑料。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们的研究表明,像硅藻这样的微藻潜力GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba与太阳能表达工厂充当太阳能表达工厂,与基于工厂的生产系统相比揭示了很大的优势。GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

全球每年消耗约1.4亿吨塑料,这需要加工约1.5亿吨化石燃料,直接导致巨大的浪费,这可能需要数千年来自然而然地恶化,如果它根本劣化[GydF4y2Ba118bet金博宝app ]。因此,生物塑料是一种可行的替代品,因为它们不是基于化石资源,而且很容易被生物降解。然而,到目前为止,石油衍生聚合物的生产成本仍然低于生物可降解替代品,这阻碍了环保替代品的商业开发和零售。GydF4y2Ba

聚 - (R)-3-羟基丁酸(PHB)是具有热塑性性质的脂族聚酯,其天然由某些细菌作为储存化合物产生,并且100%可生物降解[GydF4y2Ba118bet金博宝app -GydF4y2Ba118bet金博宝app ]。PHB由乙酰辅酶a合成,通过三种酶的作用:酮硫醇化酶,乙酰辅酶a还原酶和PHB合酶[GydF4y2Ba118bet金博宝app ]。在最佳条件下细菌如GydF4y2BaRalstonia Eutropha.GydF4y2BaH16可产生高达80%的细胞干重,一些公司专业从事商业PHB生产(例如Metabolix Inc.,Micromidas Inc.)。然而,通过细菌发酵的PHB生产的成本仍然非常高,因此作为光合作用燃料低成本生产系统将植物带入焦点[GydF4y2Ba118bet金博宝app -GydF4y2Ba118bet金博宝app ]。三种细菌酶在胞质溶胶中表达或靶向植物细胞的不同隔室,导致大量的PHB积聚在塑性体中GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba(高达干重的40%)[GydF4y2Ba118bet金博宝app 那GydF4y2Ba118bet金博宝app ]。但由于生长迟缓、不育,不适合大规模栽培。今天,具有可育后代的植物中PHB合成的最高水平是在叶绿体中获得的GydF4y2Ba烟草GydF4y2Ba导致细胞干重的高达18%pHB [GydF4y2Ba118bet金博宝app ]。GydF4y2Ba

通常,基于植物的表达系统非常有吸引力,因为需要外部有机碳源,这是大规模生产系统的重要成本因素[GydF4y2Ba118bet金博宝app -GydF4y2Ba118bet金博宝app ]。然而,另一方面,基于植物的表达系统直接与农业种植物的生存作物竞争,转基因植物的传播难以控制,这是一个道德问题,并导致许多国家转基因植物的严格监管控制。建立基于工厂的表达系统的主要缺点是相对较长的增长率,导致盈利能力下降。这在基于植物的表达系统上施放了一个阴影,使它们无法与当前建立的细菌系统竞争。微藻享有光合驱动的真核生物系统的所有优点,但缺乏许多所提到的缺点,即它们具有高增长率,易于处理,不需要多于耕种的光和水[GydF4y2Ba118bet金博宝app ]。因此,微藻被认为具有巨大的潜力作为新型低成本表达系统,特别是如果旨在瞄准许多工业,治疗或诊断应用中的重组蛋白的生物合成[GydF4y2Ba118bet金博宝app -GydF4y2Ba118bet金博宝app ]。GydF4y2Ba

在这项研究中,我们首次出现了关于在微藻系统中生物技术相关生物聚合物的生物合成的报告。我们证明生物塑料PHB的生产在硅藻中是可行的GydF4y2BaPhaeodactylum Tricornutum.GydF4y2Ba通过将细菌PHB途径引入细胞溶质隔室。获得高达10.6%的藻类干重的PHB水平揭示了这种低成本和环保的表达系统的巨大潜力。GydF4y2Ba

结果与讨论GydF4y2Ba

革兰氏阴性细菌的酶PHAA(酮酰基酶),PHAB(乙酰乙酰基-COA还原酶)和PHAC(PHB合成酶)GydF4y2BaR. Eutropha.GydF4y2BaH16在硅藻的胞嘧啶中表达GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba测试多羟基丁酸酯(PHB)是否可以在微藻系统中生产。最初的GydF4y2Ba体内GydF4y2Ba具有GFP融合蛋白的本地化研究表明,所有三种酶都在异源系统中表达并在细胞溶溶胶内积聚(图GydF4y2Ba118bet金博宝app )。GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba首先通过PCR分析与所有三种酶的序列与所有三种酶的序列转染的细胞通过PCR分析所有三种构建体的整合,并随后检查形态异常。有趣的是,当转移到含硝酸盐的培养基中5-7天(诱导PHAA,PHAB和PHAC)的转染剂,转染剂在胞质溶胶中积累了大量的颗粒状结构,其特异性地标记着许多人使用的亲脂染料尼罗红色其他研究GydF4y2Ba体内GydF4y2Ba染色phb颗粒(图GydF4y2Ba118bet金博宝app )。电子显微镜分析证实了这些数据,证明细胞填充了不存在于野生型细胞或相同线的非诱导细胞中的颗粒(图GydF4y2Ba118bet金博宝app )。气相色谱分析GydF4y2Bap . tricornutum phaAGydF4y2Ba/GydF4y2Ba伤健GydF4y2Ba/GydF4y2BaphaCGydF4y2Ba-转染到含硝酸盐的培养基中7天,发现这些细胞确实积累了PHB,达到了藻干重的10.6%(图GydF4y2Ba118bet金博宝app )。因此,PHB的积累结果取决于诱导期,因为仅1-3天PhaA/PhaB/PhaC的表达就会导致PHB的数量更低(数据未显示)。重要的是,野生型细胞并没有通过自然途径积累PHB(图GydF4y2Ba118bet金博宝app )。GydF4y2Ba

图1GydF4y2Ba
图1GydF4y2Ba

在活的有机体内GydF4y2BaPHAA,PHAB和PHAC表达的本地化研究GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba。序列分析表明,乙酰基辅酶a还原酶(acettoacetylcoa reductase, PhaB)和phc合成酶(PHB synthase, PHB synthase, PHB synthase, PHB synthase, PHB synthaseGydF4y2BaR. Eutropha.GydF4y2Ba将H16作为GFP融合蛋白引入GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba。所有三种酶在异源系统中表达,并且由于不添加特异性靶向信号,则在胞质溶胶中累积。塑性自发荧光显示为红色,GFP荧光以绿色描绘。秤棒表示10μm。PAF - 塑性自发荧光,RE -GydF4y2BaR. Eutropha.GydF4y2BaH16GydF4y2Ba

图2.GydF4y2Ba
图2.GydF4y2Ba

荧光和电子显微镜对PHB积累的分析GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba。酶的细胞溶质表达,phaa,phab和phacGydF4y2BaR. Eutropha.GydF4y2BaH16诱导颗粒状结构的形成,所述颗粒状结构通过荧光显微镜可视化(A:NO:NO)GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba)。在非诱导条件下,未观察到这种颗粒(A:NHGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba+GydF4y2Ba)。电子显微镜分析确认在表达PHB途径(C-F)的细菌酶的细胞系中的电子 - 半透明颗粒(示例性地标记的箭头)的细胞溶质积累。PHB颗粒的尺寸约为0.1-0.3μm,未在非诱导条件下观察到0.1-0.3μm。秤条表示1μm(B-D)和500nm(E / F)。DIC - 差分干扰对比,G - Golgi装置,MT -Mitochondrium,Nu - 核,PAF - 塑性自发荧光,Pl - Plastid,V - 液泡GydF4y2Ba

图3.GydF4y2Ba
图3.GydF4y2Ba

胞质细胞溶胶中PHB合成的定量GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba。五种转基因的PHB合成水平GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba通过偶联至质谱法通过气相色谱法分析细胞系(No.8,11,15,15,18,28)。7天后PHAA / PHAB / PHAC表达,检测到藻类干重的8.0-10.6%的pHB水平。野生型细胞对于PHB合成是阴性的。DWT - 干重,WT - 野生型GydF4y2Ba

本研究的结果展示了第一次在微藻系统中可以进行PHB生产。有趣的是,与植物细胞溶胶中的PHB合成的努力相比,PHB表达水平GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba大约高出100倍[GydF4y2Ba118bet金博宝app ]。这可能是由于大量脂质沉积物存在于细胞质GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba作为这些微藻自然产生有价值的ω-3-脂肪酸[GydF4y2Ba118bet金博宝app -GydF4y2Ba118bet金博宝app ]。因此,乙酰-CoA池是pHB合成的基础,在细胞溶胶中可能是显着高的GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba因此,能够非常高效的PHB生产。为了将乙酰-CoA限制为植物中PHB产生的缺点,测试其他细胞室,并且实际上具有由于脂肪酸合成而提供高乙酰辅酶含量的体积,结果产生了更高水平的PHB [GydF4y2Ba118bet金博宝app 那GydF4y2Ba118bet金博宝app ]。到目前为止,植物中具有肥沃后代的植物中最好的PHB合成水平,具有PHB的烟草,有助于18%的干重[GydF4y2Ba118bet金博宝app ]。经过第一次浏览,这看起来很有希望,作为植物植物的重要经济因素,直接比较是良好的GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba,需要大约两周时间才能在3个月的植被期间累积植物达到的类似PHB水平。GydF4y2Ba

当然phb生产GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba不能呈现出与生物生产的竞争GydF4y2BaR. Eutropha.GydF4y2Ba,这是多年前商业地建立的。然而,这一试点实验与许多其他目前的微藻生物技术项目突出了这些光合驱动的生产系统的巨大潜力。当然,微藻生物技术的这种进步将提高高效的光生物反应器的开发,以便在大规模的培养中使用,目前是将低成本生产实践的最有限因素之一。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

总之,本研究表明,微藻就像硅藻一样GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba对于重组蛋白的生物合成厂而言,具有巨大的潜力,而且作为用于合成PHB的生物技术相关聚合物的光合作用的生物反应器。即使没有酶工程,没有适应GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba在这些初始分析中,没有应用特定的密码子使用,并且没有得到大规模的筛选,获得了高达10.6%的藻类干重的pHB水平。因此,在未来,将重点关注各种目标,用于增强PHB生物合成GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba。其他亚细胞室,例如塑体尤其可能是PHB合成的有趣部位。硅藻在脂质和硅酸盐中天然富含富含脂质,并且已经在生物技术中具有应用[GydF4y2Ba118bet金博宝app ]。因此,在硅藻中插入和/或改变生物化学途径,以合成复杂的分子,生物活性物质和原料可以具有例如纳米技术工业和可再生生物燃料的生产中的许多应用。GydF4y2Ba

方法GydF4y2Ba

质粒建设和GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba转染GydF4y2Ba

质粒pbhr68 [GydF4y2Ba118bet金博宝app 用作扩增模板GydF4y2BaphaAGydF4y2Ba那GydF4y2Ba伤健GydF4y2Ba和GydF4y2BaphaCGydF4y2Ba基因GydF4y2BaR. Eutropha.GydF4y2BaH16。为了GydF4y2Ba体内GydF4y2Ba定位研究序列被克隆到eGFP(增强的绿色荧光蛋白)序列上游的载体ppa - nr中,该载体是pPhaT1的衍生物,内源性硝酸盐还原酶启动子/终止子位于多个克隆位点的侧边[GenBank:JN180663]。诱导型硝酸还原酶启动子体系较早在硅藻中建立GydF4y2Bac .梭杆菌属GydF4y2Ba通过Poulsen等人。2005 [GydF4y2Ba118bet金博宝app ]。转染如前所述进行[GydF4y2Ba118bet金博宝app 除了在非诱导条件下细胞生长细胞的异常外,NHGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba+GydF4y2Ba作为唯一的氮源。用于PHB合成GydF4y2BaP. Tricornutum.GydF4y2Ba,序列GydF4y2BaphaCGydF4y2Ba克隆到载体pha - nr(不含eGFP)中,得到GydF4y2BaphaAGydF4y2Ba和GydF4y2Ba伤健GydF4y2Ba将其插入载体ppa - dual [2xNR]中,该载体为ppa - nr衍生物,在内源性硝酸盐还原酶启动子的控制下具有两个多个克隆位点[GenBank:JN180664]。在非诱导条件下混合和共转染两种质粒。GydF4y2Ba

细胞培养及重组蛋白表达的诱导GydF4y2Ba

在其他地方(apt等人1999)中描述的标准条件下,细胞在F / 2培养基中生长(apt等。1999),0.9 mm noGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba或1.5毫米NHGydF4y2Ba4.GydF4y2Ba+GydF4y2Ba作为氮源。为了GydF4y2Ba体内GydF4y2Ba在含NO的培养基中培养GFP融合蛋白GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba诱导重组蛋白表达。3天后,通过共聚焦激光扫描显微镜分析克隆。GydF4y2BaphGydF4y2Ba/GydF4y2Ba伤健GydF4y2Ba/GydF4y2BaphaCGydF4y2Ba首先将共转染剂确定通过菌落PCR为所有三个序列的基因组集成。随后,在含有NH的液体培养物中生长阳性菌落GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba+GydF4y2Ba并允许达到指数阶段,随后他们被转移到否GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba含有不同时间段的培养基。为了可视化PHB颗粒,诱导细胞5天并分别通过电子和共聚焦微观分析分析。对于共聚焦显微镜,将细胞与亲脂性染料尼罗红(0.5μg/ ml)预孵育24小时。GydF4y2Ba

PHB分析GydF4y2Ba

用于对PHB生产培养的分析在NH生长GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba+GydF4y2Ba含培养基,在无氮培养基中洗涤并转移到NOGydF4y2Ba3.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba含培养基7天。收获细胞(1500×GydF4y2BaGGydF4y2Ba10分钟),用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并冻干24小时。在2ml甲醇/硫酸(85:15,V / V)和2mL氯仿存在下,将细胞的PHB含量测定5至10mg冻干细胞。通过使用Agilent 6850 GC(Agilent Technologies,Waldbronn,Germany)的Agilent 6850 GC(Agilent Technologies,Waldbronn,Germany)通过气相色谱分析所得甲酯的3-羟基丁酸酯的甲酯。[GydF4y2Ba118bet金博宝app 那GydF4y2Ba118bet金博宝app ]。GydF4y2Ba

荧光和电子显微镜GydF4y2Ba

在活的有机体内GydF4y2Ba采用Leica TCS SP2共聚焦激光扫描显微镜,使用HCX PLAPO 63x/1.32-0.6 oil Ph3 CS物镜分析GFP融合蛋白的定位。GFP、叶绿素和Nile Red在488 nm激发,荧光检测带宽分别为500-520 nm、680-720 nm和580-600 nm。电镜分析方法:2000 × g离心5 min,冷冻固定,树脂包埋。样品被高压冷冻在徕卡EM- pact 2中,随后冷冻替代(徕卡EM AFS 2;含纯丙酮,含2% (w/v)四氧化锇,0.1% (w/v)醋酸铀酰和5% (v/v) HGydF4y2Ba2GydF4y2BaO.冷冻替代在-90°C下4 h, -60°C下8 h, -30°C下8 h, 0°C下3 h,每一步加热时间为1 h。样品用冰水丙酮洗涤三次,在Epon 812 (Ted Pella, Inc., USA)中渗透24 h后,树脂在60℃下聚合72 h。超薄切片用Leica Ultracut (Leica, Vienna, Austria)切割。安装在裸400目铜网格和post-stained 2% (w / v)醋酸双氧铀20分钟和0.5% (w / v)柠檬酸铅1分钟。透射电子显微镜进行了JEOL 2100 TEM在80千伏结合快速扫描环绕2 k×2 k CCD相机F214 (TVIPS, Gauting,德国)。GydF4y2Ba

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    Walker TL,Purton S,Becker DK,夹头C:微藻作为生物反应器。植物细胞代表2005,24(11):629-641。10.1007 / s00299-005-0004-6。GydF4y2Ba

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    Carsten M,Molina Grima E,Robles Medina A,GiménezGiménezA,IbánezGonzálezMJ:来自Microalga的eicosapentaeno酸(EPA,20:5N3)GydF4y2BaPhaeodactylum Tricornutum.GydF4y2Ba。J AM Oil Chem SoC。1996,73:1025-1031。10.1007 / BF02523411。GydF4y2Ba

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    Ramírezfajardo a,Estebancerdánl,克莱尔麦纳A,AciénFernándezFG,GonzálezMorenoPa,Molina Grima E:来自微藻的脂质提取GydF4y2BaPhaeodactylum Tricornutum.GydF4y2Ba。EUR J Lipid SCI Technol。2007,109:120-126。10.1002 / EJLT.200600216。GydF4y2Ba

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下载参考GydF4y2Ba

致谢GydF4y2Ba

我们感谢来自Marburg的Jan Bamberger在初始气相色谱分析上的初始气相色谱分析上的技术援助。Reinhard Rachel教授和Regensburg的Ralph Witzgall教授我们感谢您提供高压冻结和冻结替代设施。此外,我们感谢Marion Debus进行电子显微准备的技术援助。这项工作得到了Hessen(德国)州的Loewe计划的支持。GydF4y2Ba

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作者的贡献GydF4y2Ba

研究由UGM,ASB和FH设计。NL对PHB分析和AK进行了实验性的电子显微镜分析。FH负责手稿的设计和起草,并进行了进一步的实验工作。AS,UL和SZ辅助稿件的数据分析和审查。所有作者阅读并认可的终稿。GydF4y2Ba

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Hempel,F.,Bozarth,A.S.,Lindenkamp,N。GydF4y2Ba等等。GydF4y2Ba微藻作为生物生产的生物反应器。GydF4y2Ba活细胞的事实GydF4y2Ba10日,GydF4y2Ba81(2011)。https://doi.org/10.1186/1475-2859-10-81GydF4y2Ba

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关键词GydF4y2Ba

  • 微藻GydF4y2Ba
  • 硅藻Phaeodactylum TricornutumGydF4y2Ba
  • 生物塑料的生产GydF4y2Ba
  • 硝酸还原酶启动子GydF4y2Ba
  • Microalgal系统GydF4y2Ba